Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Напряжение мышц-40-mRFP, предоставляемое CGC, которое финансируется NiH Управлением научно-исследовательских инфраструктурных программ (P40 OD010440). Нейрон-40-CFP был добрым подарком лаборатории Моримото. Мы признаем DFG (KI-1988/5-1 в JK, NeuroCure PhD стипендий по NeuroCure кластера передового опыта в MLP), EMBO (краткосрочные стипендии для MLP) и компании биологов (путешествия гранты CG и MLP) для финансирования. Мы также признаем, что центр расширенной световой микроскопии в Центре молекулярной медицины Макса Дельбрюка в Берлине предоставляет установку для изображения, построенного YFP.

1. Синхронизация C. elegans
<ol><li>Синхронизируйте C. elegans либо с помощью щелочной гипохлоритной обработки раствора, либо с помощью простого откладывания яйцеклеток в течение 4 ч при 20 градусах По цельсии8.</li>
	<li>Выращивайте и поддерживайте нематоды при 20 градусах по Цель?...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease.">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58 (2016).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging.">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo.">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li><li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading.">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li><li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting.">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets.">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687 (2013).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging.">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation.">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

Представленный здесь протокол описывает метод на основе микроскопии для выявления агрегированных видов в модели системы C. elegans. FLIM может точно охарактеризовать наличие как агрегированных, так и растворимых видов, слитых с фторфором, путем измерения их распада флуоресценции. Когд?...

Агрегация белка происходит как при старении, так и при заболеваниях. Пути, которые приводят к образованию и осаждению крупных амилоидов или аморфных включений трудно следовать и их кинетика также сложно разгадать. Белки могут неправильно сложиться из-за внутренних мутаций в их последовательности кодирования, как и в случае генетических заболеваний. Белки также неправильно, потому что протеостаз сети (PN), что держит их растворимыми и правильно сложены нарушается, как это происходит во время старения. PN включает в себя молекулярные сопровождающие и машины деградации и отвечает за биогенез, складные, торговые и деградации белков1.
C. elegans стала моделью для изучения старения и болезней из-за его короткой продолжительности жизни, изогенной природы и простоты генетических манипуляций. Было создано несколько трансгенных штаммов C. elegans, которые выражают белки, вызывающие болезни человека, в уязвимых тканях. Важно отметить, что многие штаммы, содержащие агрегации подверженных белков резюме отличительной чертой амилоидных расстройств, формирование крупных включений. Благодаря прозрачному телу C. elegans, эти агрегаты могут быть визуализированы in vivo, неинвазивно и неразрушительно2. Генерация любого белка, представляющих интерес (POI) в синтезе с фторфором позволяет исследовать его местоположение, торговлю людьми, сеть взаимодействия и общую судьбу.
Мы представляем протокол для мониторинга агрегации болезнетворных белков в жизни и старения C. elegans с помощью флуоресценции визуализации микроскопии (FLIM). FLIM является мощным методом, основанным на жизни фторфора, а не его спектры выбросов. Срок службы (тау, ) определяется как среднее время, требуемое фотоном для распада от возбужденного состояния обратно в его наземное состояние. Срок службы данной молекулы рассчитывается с помощью метода временной домены учета одного фотона (TCSPC). В TCSPC-FLIM функция флуоресцентного распада получается путем захватывающих флюорофора с короткими, высокочастотными лазерными импульсами и измерения времени прибытия испускаемого фотона на детектор по отношению к импульсам. При сканировании образца для каждого пикселя создается трехмерный массив данных: массив содержит информацию о распределении фотонов в их x,y пространственных координатах и кривой временного распада. Таким образом, данный образец становится картой жизней, раскрывающей информацию о структуре белка, связывании и окружающей среде3,,4. Каждый флуоресцентный белок обладает внутренней и точно определенной продолжительности жизни, как правило, в несколько наносекунд (нс), в зависимости от его физиохимических свойств. Важно отметить, что срок службы флюорофора не зависит от его концентрации, флуоресцентной интенсивности и методологии визуализации. Тем не менее, в биологической системе, это может быть влияние экологических факторов, таких как рН, температура, концентрации ионов, насыщение кислородом, и его партнеров взаимодействия. Сроки службы также чувствительны к внутренним структурным изменениям и ориентации. Слияние фторофора с POI приводит к изменению в его жизни и, следовательно, информация о поведении слитого белка. Когда фторофор окружен или инкапсулирован в плотно связанной среде, такой как антипараллельные бета-листы амилоидной структуры, он теряет энергию нерадиационно, процесс, известный как закалка5. Утоления фторофора приводит к сокращению его очевидной жизни. Когда растворимый, срок службы белка будет оставаться ближе к его первоначальной, более высокой стоимости. В отличие от этого, когда белок начинает агрегироваться, его срок службы неизбежно перейдет к более низкому значению6,,7. Таким образом, становится возможным контролировать склонность к агрегации любого амилоидного белка в разном возрасте в живых C. elegans.
Здесь мы описываем протокол для анализа агрегации белка синтеза, состоящего из различных полиглютамин (CAG, No) тянется (No40, No 44, и No 85). Мы иллюстрируем, как этот метод может быть применен в равной степени к различным флуоророромам, таким как циановый флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и мономерный красный флуоресцентный белок (mRFP); и во всех тканях C. elegans, включая нейроны, мышцы и кишечник. Кроме того, в контексте протеостаза, FLIM является очень полезным инструментом для наблюдения за изменениями при истощении молекулярных сопровождающих. Сбив ая расшатывание одного из ключевых молекулярных сопровождающих, белок теплового шока 1(hsp-1),с помощью РНК-интерференции производит преждевременное искажение белков. Увеличение нагрузки агрегации в результате старения, болезни или дефицита сопровождающих, затем измеряется как снижение продолжительности жизни флуоресценции.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

Амилоидные фибрилки связаны с рядом нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Гентингтона, Паркинсона или болезнь Альцгеймера. Эти амилоидные фибриллы могут секвестировать эндогенные метастабильные белки, а также компоненты сети протеостаза (PN) и тем самым усугубить неправильное сворачивание белка в клетке. Существует ограниченное количество инструментов для оценки процесса амилоидных белков в животном. Мы представляем протокол для флуоресценции жизни микроскопии (FLIM), что позволяет контролировать, а также количественноать амилоидной фибрилизации в конкретных клетках, таких как нейроны, в неинвазивной образом и с прогрессированием старения и при возмущении PN. FLIM не зависит от уровня экспрессии фторофора и позволяет анализпроцесса агрегации без каких-либо дальнейших окрашивания или отбеливания. Флюорофоры угасают, когда они находятся в непосредственной близости от амилоидных структур, что приводит к снижению срока службы флуоресценции. Закалка напрямую коррелирует с агрегацией амилоидного белка. FLIM является универсальным методом, который может быть применен для сравнения процесса фибрилизации различных амилоидных белков, экологических стимулов, или генетических фонов in vivo в неинвазивной манере.

Протокол показывает, как точно контролировать формирование агрегированных видов в живых C. elegans,как во время его естественного старения и при воздействии стресса. Мы отобрали четыре различных штамма трансгенных нематод, выражающих полиглутамин белки либо 40 ", 44" и?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Флуоресценция жизни визуализации мониторов, количественно и отличает агрегации тенденции белков в жизни, старение, и подчеркнул C. elegans модели болезни.

Характеристика амилоидных структур в старении C. Elegans использованием флуоресценции пожизненной визуализации

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Метод позволяет четко отличать интегрированные структуры амилоидного белка от растворимых и даже накопленных аналогов. Техника выполняется in vivo в неинвазивной манере практически без токсичных побочных эффектов. Поскольку он зависит от флуоресцентных свойств самого флюорофора, он очень прочный и воспроизводимый с течением времени.FLIM был использован в области диагностики рака. Тем не менее, мы используем его для изучения основных механизмов агрегации белка, которые действительно имеют отношение к нейродегенеративным заболеваниям. Методология может быть использована в области агрегации белка.До тех пор, как болезнь связанных белка помечены флуоресцентный зонд, он может отслеживаться и контролироваться с течением времени. Соединения и стратегии, которые либо способствуют, либо препятствуют агрегированию, могут быть успешно изучены. Любая биологическая система, позволяющая визуализировать с помощью световой микроскопии, подходит для FLIM либо in vivo, либо ex vivo, например, в клеточной культуре, в зацикленных или проницаемых образцах и в любой необходимой среде.Убедитесь в том, чтобы проверить свойства выбранного фторфора в нематоде до получения экспериментальных данных и проверить, что установка полностью функциональна перед приобретением измерений. Для начала выращиваем и поддерживайте нематод при 20 градусах Цельсия на ngM пластинах. Возраст нематод до дня четыре жизни, как молодые взрослые и восьмой день жизни, как старые взрослые.В день визуализации начните с подготовки слайдов изображений. Место агарозы и двойной дистиллированной воды в концентрации 3%weight по объему. Перенесите его в микроволновую печь, чтобы расплавить, а затем дайте ему немного остыть.Вырезать кончик одного миллилитров пипетки отзыв и принять примерно 200 микролитров расплавленной агарозы. Pipette агарозы на чистую стеклянную горку и сразу же место второй на вершине избежать образования каких-либо пузырьков. Оставьте слайды высохнуть и аккуратно удалите верхнюю стеклянную горку.В результате получится стеклянная горка с равномерной поверхностью агарозы, на которой будут расположены нематоды. После того, как установка изображений готова к использованию, работая под стерео микроскопом, поместите 10 микролитровую каплю обезболивающего соединения на агарозную площадку и аккуратно перенесите в нее от пяти до 10 нематод. Используйте наконечник ресниц, чтобы отделить нематод.Держите их близко друг к другу, но не касаясь, чтобы облегчить локализацию нематод во время получения изображения. Тщательно наложить нематод с крышкой. В течение одного часа после монтажа, принять измерения.Убедитесь, что нематоды полностью неподвижны. Откройте программное обеспечение для приобретения FLIM. Найдите кнопку вкладок и нажмите, чтобы обеспечить выходы.Поместите слайд с установленным c.elegans на сцене и с помощью 10X увеличение объектива в режиме передачи, локализовать положение нематод на слайде. Снимите слайд, переключитесь на объектив увеличения 63X и нанесите требуемую среду погружения. Поместите горку на сцену и локализуйте нематод.Начните сканирование образца. Выберите область интереса и сосредоточьтесь на максимальной проекционной плоскости. На интерфейсе программного обеспечения FLIM можно просмотреть количество обнаруженных фотонов.Значение ADC должно быть от одного раза 10 до четвертого и один раз от 10 до пятого. При необходимости смещайте фокус на другую плоскость или увеличьте мощность лазера, чтобы собрать больше фотонов. Убедитесь, что вы избегаете накопления фотонов, но собираете достаточное количество фотонов, чтобы создать хорошую жизнь подходят и измерения.В баре меню выберите вкладку для набора параметров приобретения. Выберите синхронизацию сканирования, чтобы обеспечить обнаружение одного фотона. Установите приобретение на фиксированное количество времени или фиксированное количество фотонов.Пресса начинает приобретение. Откройте программное обеспечение и импорт файлы данных FLIM через файл, загрузите данные FLIM. Загрузите все образцы из одного состояния, даже если они получены в разных сеансах и из разных биологических повторов.При необходимости сегмент для сигнализации нематод для многих FLIM изображение через сегментации, сегментации менеджера. Перетащите инструмент обрезки вокруг области, представляющие интерес, пока он не будет выделен. После завершения, нажмите OK. Выберите небольшой регион, где отображается изображение C.elegans на основе интенсивности.Кривая распада этой области отображается в большом окне распада на правой стороне интерфейса. Чтобы экстраполировать срок службы на вкладке данных, установите произвольно интегрированное минимальное значение от 40 до 300, чтобы исключить любые пиксели, которые слишком тусклые, чтобы хорошо подходят. Выберите минимальный срок и максимальное число времени, чтобы ограничить сигнал FLIM этими значениями.Не меняйте заданные подсчеты фотона одного из них. Вввейте скорость повторения в мегагерц лазера, используемого во время приобретения. Вввещаете максимальное значение ворот, чтобы исключить все насыщенные пиксели.На вкладке продолжительности жизни выберите глобальную установку, которая будет использоваться. Не меняй никаких других параметров, кроме количества экспоненциального отбора, если известно, что выбранный распад флуоресценции является многорасциациаливным и демонстрирует более одного срока службы. Загрузите IRF через меню IRF.Для оценки смены IRF выберите IRF, оцените сдвиг IRF. Набор значений автоматически отображается на вкладке IRF. Как только это будет установлено, не меняй других параметров этой вкладки.После того, как все параметры установлены, нажмите подходят набор данных. Полученная подгонка, выделенная синей линией, должна перекрываться со всеми событиями. Хорошая подгонка получается, когда все события выровнены вдоль подгонки.Нажмите на вкладку параметров, расположенную в правом верхнем меню интерфейса программного обеспечения, и выберите статистику, средневзвешенное значение и убедитесь, что значение квадрата чи как можно ближе к одному. Таким образом, значение продолжительности жизни выбранного изображения раскрывается как тау-один. Экспорт любой информации, представляющих интерес через файл, изображения интенсивности экспорта, подходят таблицы результатов, изображения, гистограммы.Здесь показаны репрезентативные карты C.elegans, выражают мускулистую RFP No40 на четвертый или восьмой день жизни. Чем длиннее, тем больше уровень I'85 был более склонен к агрегации, и уже на четвертый день жизни в гистограмме был флуоресцентный сдвиг. В самом деле, на четвертый день, очаги формирования наблюдалось для I'85 в то же время отсутствует в I'44.После старения, однако, I'44 также выставлены очаги формирования и, таким образом, снижение срока службы флуоресценции. Наконец, образование очагов не было обнаружено и не было уменьшено срок службы флуоресценции в штамме N'40CFP. Для этого штамма, были только тонкие незначительные незначительные изменения в среднем флуоресценции жизни при старении.После того, как модель нематод установлена, количество собранных фотона имеет первостепенное значение для получения хорошей жизни подходят. Метод можно далее соединять с различными методами, такими как передача резонансной энергии Форстера, FRET, восстановление флуоресценции после фотоблейлинга, FRAP или измерения. Все эти приспособления дают дополнительную информацию о свойствах белковых исследований и их агрегированной форме.В области агрегации белка и белка гомеостаза, техника позволила исследовать любые возмущения, наложенные на систему, распределение различных видов белка, и торговли и в целом разница и значение растворимых и нерастворимых белковых фракций в живом организме. Обезболивающее азид натрия является токсичным и должны быть обработаны перчатками и очками и разбавленной под капотом дыма. Поскольку метод основан на микроскопии, важно следовать всем предупреждениям, связанным с работой с лазерами.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging амилоида тканей витражи с светящиеся конъюгированных Oligothiophenes путем использования гиперспектральных конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Структурные характеристики Маннан полисахаридов клеточной стенки в растений с использованием ПАСЕ

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Использование двух мерных полу денатурируя стирального геля агарозы подтвердить размер неоднородность волокон амилоида или амилоид как

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Быстрое на основе флуоресценции характеристика одной внеклеточного везикулы в крови человека с анализом наночастиц отслеживание

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-обязательные организации (SUBEs) как инструменты для обогащения, изоляции, идентификации и характеристики ПРОтеоме СУМО при раке печени

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...