Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanan kas-Q40-mRFP suşu. Nöronal-Q40-CFP Morimoto Lab bir tür hediye oldu. Biz DFG (KI-1988/5-1 JK, NeuroCure Doktora Bursu MLP için Mükemmellik NeuroCure Küme tarafından), EMBO (MLP kısa vadeli burs) ve Biyologlar Şirketi (CG ve MLP seyahat hibe) finansman için kabul. Ayrıca, YFP'nin inşalarının görüntülenmesi için kurulum sağlamak için Berlin'deki Max Delbrück Moleküler Tıp Merkezi'ndeki Gelişmiş Işık Mikroskobu görüntüleme tesisini de kabul ediyoruz.

1. C. eleganların senkronizasyonu
<ol><li>Senkronize C. elegans ya alkali nhipoklorit çözeltisi tedavisi ile ya da basit yumurtlama yoluyla 4 saat 20 °C8.</li>
	<li>Standart prosedürlere göre OP50 E. coli ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM)plakalarıüzerinde 20 °C'de nematodyetiştirin ve bakımını yap. Yaş nematodlar istenilen gelişim aşaması veya güne kadar. NOT: Bu protokolde genç yetişkinler 4.</li>
</ol><p c...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease.">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58 (2016).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging.">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo.">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li><li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading.">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li><li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting.">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets.">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687 (2013).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging.">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation.">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

Burada sunulan protokol, C. elegans model sistemindeki birleştirilmiş türleri tanımlamak için mikroskopi tabanlı bir tekniği tanımlar. FLIM, floresan yaşam larındaki çürümelerinin ölçümü yoluyla bir florofora kaynaşmış hem birakadar hem de çözünen türlerin varlığını doğru bir şekilde karakterize edebilir. Bir füzyon proteini toplama başladığında, kayıtlı ortalama ömrü daha yüksek bir değerden daha düşük bir değere kayacaktır16. Toplama eğilim...

Protein toplama hem yaşlanma da hem de hastalıkta görülür. Büyük amiloidlerin veya amorf inklütiflerin oluşumuna ve birikmesine yol açan yolları takip etmek zordur ve kinetiklerinin çözülmesi de benzer şekilde zordur. Proteinler genetik hastalıklarda olduğu gibi kodlama sekanslarındaki içsel mutasyonlara bağlı olarak yanlış katlanabilirler. Proteinler de yanlış çünkü proteostaz ağ (PN) onları çözünür ve düzgün katlanmış tutar bozulmuş, yaşlanma sırasında olur. PN moleküler şaperonlar ve bozulma makineleri içerir ve biyogenez sorumludur, katlama, ticareti, ve proteinlerin bozulması1.
C. elegans kısa ömrü nedeniyle yaşlanma ve hastalık çalışma modeli olarak ortaya çıkmıştır, izojenik doğa, ve genetik manipülasyon kolaylığı. Hassas dokularda insan hastalığına neden olan proteinleri ifade eden çeşitli C. elegans transgenik suşları oluşturulmuştur. Daha da önemlisi, agregasyona eğilimli proteinler içeren suşların çoğu amiloid bozukluklarının damgasını, büyük inklütiflerin oluşumunu özetler. C. elegans 'şeffaf vücut sayesinde, bu agregalar invivo görselleştirilmiş olabilir, noninvaziv ve nondestructively2. Bir florofor ile füzyon ilgi herhangi bir protein (POI) üreten yerleri, kaçakçılık, etkileşim ağı ve genel kaderi araştırmak için izin verir.
Floresan yaşam boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) ile yaşayan ve yaşlanan C. elegans'de hastalığa neden olan proteinlerin toplanması nın izlenmesi için bir protokol sokulmaktadır. FLIM, emisyon spektrumlarından ziyade florofor ömrüne dayanan güçlü bir tekniktir. Yaşam süresi (tau, τ) bir fotonun heyecanlı durumundan yer durumuna geri çürümek için gerekli ortalama süre olarak tanımlanır. Belirli bir molekülün ömrü zaman-ilişkili tek foton sayma (TCSPC) zaman-etki alanı tekniği ile hesaplanır. TCSPC-FLIM'de floresan bozunma fonksiyonu, kısa, yüksek frekanslı lazer darbeleri ile floroforheyecan verici ve yayılan fotonun varış sürelerinin darbelerle ilgili olarak bir dedektöre göre ölçülmesi ile elde edilir. Bir örnek tararken, her piksel için üç boyutlu bir veri dizisi oluşturulur: dizi, x,y uzamsal koordinatlarındaki fotonların dağılımı ve zamansal bozunma eğrisi hakkında bilgiler içerir. Bu nedenle verilen bir örnek, proteinin yapısı, bağlanması ve çevre3,4. Her floresan protein, genellikle birkaç nanosaniye (ns) olan, fiziksel özelliklerine bağlı olarak içsel ve tam olarak tanımlanmış bir yaşam süresine sahiptir. Daha da önemlisi, bir florofor ömrü konsantrasyonu, floresan yoğunluğu ve görüntüleme metodolojisi bağımsızdır. Ancak, biyolojik bir sistem içinde, pH, sıcaklık, iyon konsantrasyonları, oksijen doygunluğu ve etkileşim ortakları gibi çevresel faktörlerden etkilenebilir. Yaşam ömürleri iç yapısal değişikliklere ve oryantasyona karşı da hassastır. Bir poi için bir florofor eritme ömrü nde bir değişiklik ve dolayısıyla erimiş proteinin davranışı hakkında bilgi sonuçlanır. Bir florofor, amiloid yapının antiparalel beta sayfaları gibi sıkıca bağlanmış bir ortamda çevrili veya kapsüllendiğinde, 5.5 Florofor un söndürülme, görünür ömrünün kısalmasıyla sonuçlanır. Çözündüğünde, bir proteinin ömrü orijinal, daha yüksek değerine daha yakın kalır. Buna karşılık, bir protein toplambaşlar, ömrü kaçınılmaz olarak daha düşük birdeğerekayacak 6,7. Bu nedenle, yaşayan C. elegansfarklı yaşlarda herhangi bir amiloid oluşturan proteinin toplama eğilimini izlemek mümkün olur.
Burada farklı poliglutamin (CAG, Q) uzanır (Q40, Q44 ve Q85) oluşan bir füzyon proteininin agregasyon analiz etmek için bir protokol açıklar. Tekniğin siyan floresan protein (CFP), sarı floresan protein (YFP) ve monomerik kırmızı floresan protein (mRFP) gibi farklı floroforlara nasıl eşit olarak uygulanabileceğini gösteriyoruz; ve C. eleganstüm dokularda , nöronlar da dahil olmak üzere, kaslar, ve bağırsak. Ayrıca, proteostaz bağlamında, FLIM moleküler şaperonların tükenmesi üzerine değişiklikleri gözlemlemek için çok yararlı bir araçtır. RNA girişim yoluyla önemli moleküler şaperon, ısı şok proteini 1(hsp-1)yıkmak proteinlerin erken yanlış bağlanmasına neden olur. Yaşlanma, hastalık veya eksik şaperonların bir sonucu olarak toplama yükündeki artış, daha sonra floresan yaşam süresinde bir azalma olarak ölçülür.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

Amiloid fibrils Huntington gibi nörodejeneratif hastalıkların bir dizi ile ilişkilidir, Parkinson, veya Alzheimer hastalığı. Bu amiloid fibrils endojen metastabil proteinlerin yanı sıra proteostaz ağı bileşenleri (PN) sequester ve bu nedenle hücrede protein misfolding şiddetlendirebilir. Bir hayvan içinde amiloid proteinlerin toplama sürecini değerlendirmek için araçlar sınırlı sayıda vardır. Floresan yaşam boyu mikroskopi (FLIM) için nöronlar gibi belirli hücrelerde amiloid fibrilizasyonun izlenmesine ve ölçülmesine olanak tanıyan bir protokol sayılarak, yaşlanmanın ilerlemesi ve PN. FLIM florofor ifade düzeylerinden bağımsızdır ve daha fazla boyama veya ağartma olmadan toplama işleminin analizini sağlar. Florofororlar amiloid yapıların yakın çevresinde olduklarında söndürülürler, bu da floresan ömrün azalmasına neden olur. Söndürme doğrudan amiloid proteininin agregasyonu ile ilişkilidir. FLIM, farklı amiloid proteinlerin fibrilizasyon sürecini karşılaştırmak için uygulanabilen çok yönlü bir tekniktir, çevresel uyaranlar, ya da in vivo genetik arka planlar non-invaziv bir şekilde.

Protokol, hem doğal yaşlanma sırasında hem de strese maruz kaldığında, yaşayan C. elegans'tatoplanan türlerin oluşumunun nasıl doğru bir şekilde izlendiğini göstermektedir. 40Q, 44Q veya 85Q tekrarpoliglutamin proteinlerini ifade eden dört farklı transgenik nematod suşları seçtik. Bu proteinler farklı dokularda sentezlenir ve farklı floroforlara kaynaşır. C. elegans suşları ya vücut duvarı kaslarında Q40-mRFP ifade (mQ40-RFP), Sinir sistemind...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Floresan yaşam boyu görüntüleme, proteinlerin yaşam, yaşlanma ve stresli C. elegans hastalık modellerinde toplama eğilimlerini ölçer, ölçer ve ayırt eder.

Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Yöntem bize açıkça çözünür ve hatta birikmiş muadilleri entegre amiloid protein yapıları ayırt etmek için izin verir. Teknik in vivo çok az veya hiç toksik yan etkisi olmayan bir şekilde gerçekleştirilir. Floroforün floresan özelliklerine bağlı olduğundan, zamanla son derece sağlam ve tekrarlanabilir.FLIM kanser tanısı alanında kullanılmaktadır. Ancak, biz gerçekten nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili protein toplama temel mekanizmaları incelemek için istihdam. Metodoloji protein toplama alanında kullanılabilir.Hastalıkla ilişkili protein floresan sonda ile etiketlendiği sürece, zaman içinde izlenebilir ve izlenebilir. Toplamayı teşvik eden veya engelleyen bileşikler ve stratejiler başarılı bir şekilde incelenebilir. Işık mikroskobu ile görüntülenmeyi sağlayan herhangi bir biyolojik sistem, örneğin hücre kültüründe, sabitlenmiş veya geçirimli numunelerde ve gerekli herhangi bir ortamda, in vivo veya ex vivo fLIM için uygundur.Deneysel veri almadan önce seçtiğiniz floroforun nematod içindeki özelliklerini test etmeyi ve ölçümleri almadan önce kurulumun tamamen işlevsel olduğunu test etmeyi unutmayın. Başlamak için, büyümek ve NGM plakaları üzerinde 20 santigrat derece nematodlar korumak. Yaş genç yetişkinler ve yaşlı yetişkinler olarak yaşamın sekizinci gün olarak yaşamın dördüncü gününe kadar nematodlar.Görüntüleme gününde, görüntüleme slaytları hazırlayarak başlayın. Hacim olarak% 3 ağırlık tanınArak agarose ve çift distile su yerleştirin. Eritmek için bir mikrodalga içine aktarın ve sonra biraz soğumasını bekleyin.Bir mililitrelik pipet ucunu kesin ve erimiş agarose yaklaşık 200 mikrolitre almak. Pipet temiz bir cam slayt üzerine agarose ve hemen herhangi bir kabarcıkoluşumunu kaçınarak üstüne ikinci bir yerleştirin. Slaytları kurumaya bırakın ve üstteki cam kaydırağı nazikçe çıkarın.Sonuç nematodlar konumlandırılmış olacak eşit bir agarose yüzeyi ile bir cam slayt. Görüntüleme kurulumu kullanıma hazır olduğunda, stereo mikroskop altında çalışarak, 10 mikrolitrelik bir anestezik bileşiğin damlasını agarose pedin üzerine yerleştirin ve yavaşça içine 5 ila 10 nematod aktarın. Nematodları ayırmak için kirpik ucu kullanın.Görüntü edinimi sırasında nematodların daha kolay yerelleştirilmesine olanak sağlamak için onları birbirine yakın tutun, ancak dokunmadan tutun. Dikkatle bir coverslip ile nematodlar bindirme. Montajdan sonra bir saat içinde, ölçümler alın.Nematodların tamamen hareketsiz olduğundan emin ol. FLIM satın alma yazılımını açın. Sekme düğmesini bulun ve etkinleştirme çıktılarına basın.Sahneye monte edilmiş C.elegans ile slayt yerleştirin ve iletim modunda 10X büyütme lens kullanarak, slayt üzerinde nematodların konumunu yerelleştirmek. Slağı çıkarın, hedefi 63X büyütme merceğiile çevirin ve gerekli daldırma ortamını uygulayın. Slaytı sahneye yerleştirin ve nematodları yerelleştirin.Örneği taramaya başlayın. İlgi çekici bir bölge seçin ve maksimum projeksiyon düzlemine odaklanın. FLIM yazılımının arabiriminde, algılanan foton sayısını önizleyin.ADC değeri bir kere 10 ile dördüncü arasında, 10-5 arasında olmalıdır. Gerekirse, farklı bir düzlemde odak kayması veya daha fazla foton toplamak için lazer gücünü artırmak. Eğer foton kazık önlemek ama iyi bir ömür boyu uyum ve ölçüm oluşturmak için fotonyeterli miktarda toplamak emin olun.Menü çubuğunda, edinme parametrelerini ayarlamak için sekmeyi seçin. Tek bir foton algılamasına izin vermek için scan eşitle'yi seçin. Edinmeyi sabit bir zaman miktarına veya sabit sayıda fotona ayarlayın.Basın satın almaya başlamak için başlar. Yazılımı açın ve Dosya üzerinden FLIM veri dosyalarını aktarın, FLIM verilerini yükleyin. Farklı seanslarda ve farklı biyolojik tekrarlardan elde edilebilse bile tüm numuneleri tek bir koşuldan yükleyin.Gerekirse, segmentasyon, segmentasyon yöneticisi ile birçok FLIM resim için sinyal nematod segment. Kırpma aracını vurgulanana kadar ilgi alanının etrafına sürükleyin. Tamamlandıktan sonra Tamam'a basın. C.elegans'ın yoğunluk tabanlı görüntüsünün göründüğü küçük bir bölge seçin.Bu bölgenin bozunma eğrisi arabirimin sağ tarafındaki büyük bozunma penceresinde görünür. Veri sekmesinde, kullanım ömrünü tahmin etmek için, iyi bir uyum sağlamak için çok loş pikselleri hariç tutmak için 40 ila 300 arasında rasgele tümleşik bir minimum değer ayarlayın. FLIM sinyalini bu değerlerle sınırlamak için en az bir zaman ve en uzun süre numarası seçin.Önceden ayarlanmış sayımları değiştirmeyin foton. Satın alma sırasında kullanılan lazer megahertz tekrarlama oranı giriş. Tüm doymuş pikselleri hariç tutmak için bir kapı maksimum değeri girişi.Ömür boyu sekmesinde, kullanılacak genel bir montaj seçin. Seçilen floresan bozunma çok üstel olduğu ve tek bir yaşam süresinden daha fazla sergilediği biliniyorsa, üstel seçim sayısı dışında başka bir parametredeğiştirmeyin. IRF menüsünden IRF'yi yükleyin.IRF kaymasını tahmin etmek için IRF'yi seçin, IRF değişimini tahmin edin. IRF sekmesinde otomatik olarak bir değer kümesi görüntülenir. Bu kurulduktan sonra, bu sekmenin diğer parametrelerini değiştirmeyin.Tüm parametreler ayarlandıktan sonra uygun veri kümesine basın. Mavi çizgide vurgulanan ortaya çıkan sığması tüm olaylarla çakışmalıdır. Tüm olaylar uyum boyunca hizalandığında iyi bir uyum elde edilir.Yazılımın arabiriminin sağ üst menülerinde bulunan parametreler sekmesini tıklatın ve istatistik, ağırlıklı ortalamaseçin ve ki kare değerinin mümkün olduğunca yakın olup olmadığını kontrol edin. Böylece seçilen görüntünün yaşam boyu değeri tau bir olarak ortaya edilir. Dosya, ihracat yoğunluğu görüntüleri, uygun sonuç tablosu, görüntüler, histogramlar aracılığıyla ilgi herhangi bir bilgi dışa aktarın.C.elegans'ın yaşamın dördüncü veya sekizinci gününde kaslı Q40 RFP'yi ifade eden temsili haritaları burada gösterilmiştir. IQ85'in uzun Q uzantısı agregasyona daha yatkındı ve yaşamın dördüncü gününde histogramda floresan ömür boyu değişim sergiledi. Aslında, dördüncü günde IQ44'te yokken IQ85 için foci oluşumu gözlendi.Yaşlanma üzerine, Ancak, IQ44 de fosi oluşumu ve böylece azaltılmış floresan ömrü sergiledi. Son olarak, nq40CFP suşunda fosi oluşumu saptanmadı ve floresan ömrü azaltıldı. Bu gerginlik için, yaşlanma üzerine ortalama floresan ömür boyu sadece ince olmayan önemli değişiklikler vardı.Nematod modeli kurulduktan sonra, toplanan foton miktarı iyi bir ömür boyu uyum elde etmek için çok önemlidir. Yöntem, forster rezonans enerji transferi, FRET, fotobeyazrlama sonrası floresan geri kazanımı, FRAP veya ölçüm gibi farklı tekniklerle daha da birleştirilmiş olabilir. Tüm bu adaptasyonlar protein çalışmalarının özellikleri ve birleştirilmiş formu hakkında ekstra bilgi sağlar.Protein toplama ve protein homeostazı alanında, sistemde uygulanan herhangi bir tedirginliğin, farklı protein türlerinin dağılımının, insan ticaretinin ve genel olarak canlı organizmadaki çözünmez ve çözünmez protein fraksiyonlarının farkını ve önemini araştırmasına olanak sağladı. Anestezik sodyum azit toksiktir ve eldiven ve gözlük ile ele alınmalıdır ve bir duman başlık altında seyreltilmiş. Teknik mikroskopi tabanlı olduğundan lazerlerle ilgili tüm uyarıları takip etmek önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Karaciğer Kanserinde SUMO Proteomunun Zenginleştirilmesi, İzolasyon, Tanımlama ve Karakterizasyonu Için Araçlar Olarak SUMO Bağlayıcı Varlıklar (SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...