著者らは、霊長類植物食品のエストロゲン活性を決定するために一過性トランスフェクションアッセイを使用した最初のトレーニングのためにデール・リートマンに感謝しています。ブラッドフォード・ウェストリッチとC.エリック・ジョンソンが実験室機器の設置を手伝い、抽出方法で学生を訓練してくれたので、ありがとう。最後に、この研究に資金を提供してくれたインディアナ大学に感謝します。

1. 植物材料の製造
<ol><li>凍結乾燥した植物を凍結乾燥剤を使用して新鮮に採取した。<ol>
<li>光からサンプルを保護するために、乾燥プロセスの間にアルミニウムホイルで部屋をカバーしなさい。</li>
		<li>サンプルが完全に乾燥していることを確認するには、チャンバーが触れる寒さを感じなくなるまで凍結乾燥し、重量を量ると材料を植え付け、もはや質量を失いません。</li>
		<li>乾燥し?...

<ol>
	<li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+plant+consumption+predicts+red+colobus+monkey+(Procolobus+rufomitratus)+hormonal+state+and+behavior.">Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior.</a> Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).</li><li>Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+phytoestrogens+in+primate+ecology+and+evolution.">The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution.</a> International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).</li><li>DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Estrogenic+Chemicals+and+Phytoestrogens+with+Estrogen+Receptor+&#946;.">Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor &#946;.</a> Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).</li><li>Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).</li><li>Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+consequences+of+developmental+phytoestrogen+exposure.">Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure.</a> Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).</li></ol>

個別にスクリーニングする医薬品をスクリーニングするために開発されたERβレポーターアッセイは、ERβを介して生物学的に活性な植物エストロゲンの植物性食品のスクリーニングにも適しています。プロトコルにおける重要な考慮事項は、植物試料を注意して処理することを含む:新鮮な植物材料は、成形または他の生物学的劣化を防ぐために迅速に乾燥する必要があり、化合物<sup class="xref...

植物は、生存、再生、成長、発達、行動に不可欠なカロリーと栄養素を提供する多くの動物にとって必要な食料源です。植物は、独自の成長、ストマチックメンテナンス、および生殖のための適応として、多くの化学物質を生成します。植物二次代謝産物(PSM)とみなされる他の化合物は、毒性が低く、草藻および寄生虫に対する防御として使用される可能性が高いが、あまり明確ではない機能を有する(例えば、アルカロイド、タンニン)2、3。これらの化学物質の中には、内分泌機能などの動物の長期的な生理学的プロセスに影響を与える能力を有するものもありますが、なぜこれらの内分泌活性植物化学物質が脊椎動物内分泌系と相互作用するのかは不明である2,4。
フィトエストロゲンは、最もよく研究された内分泌活性植物化学物質であり、構造的および機能的にエストロゲンを模倣するポリフェノールPSMであり、脊椎動物内分泌系5の低冠下垂体性腺軸と直接相互作用する。ヒトの食事における植物エストロゲンの摂取は、いくつかの癌、心臓病、更年期症状に対する保護に関連しているが、他の効果には不妊の問題が含まれる。実際、これらの化合物の生理学的効果は、羊の不妊が植物エストロゲンが豊富なクローバー(トリフォリウム地下)6に放牧に起因した1940年代に発見された。摂取すると、植物エストロゲンは細胞に渡され、エストロゲンの効果を模倣することができます。植物エストロゲンは羊の生殖能力に悪影響を及ぼしましたが、植物エストロゲンと生理学の関係は単純ではありません。羊のように、南部の白いサイは、大豆とアルファルファの大量に由来する飼料中のエストロゲン化合物に対する感受性を示す。妊娠中にこの食事を与えられた女性の娘は7を再現する可能性が低いです.しかし、他の研究では、古いマウス8における卵巣卵胞の成熟、特定の癌の予防、抗酸化活性、および抗増殖作用9を含む、植物エストロゲンが同様に肯定的な効果を有する可能性があることを示している。
植物エストロゲンの効果の幅は、エストロゲンが成長、発達、および生殖および中枢神経系の調節を含む幅広い生物学的機能に影響を与えることを考えると驚くべきことではない10。多くの作用機序がありますが、植物エストロゲンは、多くの場合、核内エストロゲン受容体αおよびベータ(ERαおよびERβ)のリガンドとして作用する能力を通じてエストロゲンシグナル伝達を修飾、増強、または破壊する能力を有する。多くの植物エストロゲンは、エストロゲン受容体に結合することを可能にするエストロゲンに類似したフェノールリング構造を有する。エストロゲン様に作用するアゴニスト性エストロゲン活性を有するものは、エストロゲン応答要素(ERE)を二量体化して結合し、遺伝子転写をトリガすることができる活性化ERリガンド複合体を形成する。したがって、エストロゲンおよび植物エストロゲンは、転写因子としての作用を通じて細胞活性およびシステム機能を調節する。
ここでは、エストロゲンの生物学的活性を有する化合物の存在に対する植物抽出物をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイの新しい使用を提示する。このアッセイは、EREプロモーター12に結合したホタル(ホチヌス・ピラリス)にトランスフェクションされたERβを高発現するように設計された中国のハムスター卵巣CHO細胞を使用する。エストロゲン性化合物が存在すると、それらはERに結合し、二量体化し、EREに結合し、ルシファーゼ遺伝子の転写をもたらす。基質溶液を添加すると、ルシファーゼは光子放出をもたらす反応を触媒する。したがって、正のサンプルは光を生成し、負のサンプルは生成しません。
この市販のアッセイは、レポーター遺伝子とエストロゲン受容体13,14を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトする実験室の必要性を排除する。このアッセイは、植物が受容体結合を介してエストロゲン活性を有するかどうかを迅速かつ単に決定することを可能にする安定したトランスフェクションプラットフォームを提供する。
我々は、大豆が地元の食料品店からのヒト食品を使用してエストロゲンイソフラボン15 の既知の濃度を与えられた他のすべての食品よりも高いエストロゲン活性を有するという仮説をテストする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:721px;" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1000 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">200 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">37 &#8451; water bath</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">37 &#8451;, humidified 5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">analytical balance</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">cell culture-rated laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">disposable media basin, sterile</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">drip filtration system</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Erlenmeyer flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>125 mL and 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Human ER&#946; Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays</td>
			<td style="width:80px;">Indigo Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">IB00411</td>
			<td>Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">lyophilizer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">multi-channel pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">plate-reading luminometer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ex. Bioteck Synergy HTX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">rotory evaporator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">round bottom flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mL and 300 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">sterile tips</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 &#181;L and 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Whatman grade 1 paper</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">whirl-pak bags</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile polyethylene bags</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for phytoestrogens using a cell-based estrogen receptor  &#946; reporter assay

植物は多くの動物にとって食料の源であり、何千もの化学物質を生産することができます。これらの化合物のいくつかは、それらを消費する脊椎動物の生理学的プロセスに影響を与えます, 例えば内分泌機能.植物エストロゲンは、最もよく研究された内分泌活性植物化学物質で、脊椎動物内分泌系の視床下部下垂体性腺軸と直接相互作用する。ここでは、エストロゲンの生物学的活性を有する化合物の存在に対する植物抽出物をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイの新しい使用を提示する。このアッセイは、エストロゲン受容体ベータ(ERβ)を高発現するように設計された哺乳類細胞を使用し、ルシファーゼ遺伝子を導入したものである。エストロゲン活性を有する化合物への暴露は、光を産生する細胞に生じる。このアッセイは、生物学的エストロゲン活性をテストするための信頼性の高い、簡単な方法です。それは一過性トランスフェクションアッセイ、特に、使いやすさ、細胞の安定性、およびアッセイの感度に対していくつかの改善を有する。

ヒトの食事によく見られる果物や野菜の22の抽出物は、エストロゲン性化合物の存在のためにスクリーニングされました。豆科は植物エストロゲン16の既知の供給源であり、イチジク、日付、トウモロコシ、ニンジン、リンゴ、バナナ、イチゴ、トマト、ケール、キャベツなど、豆類、スノーエンドウ、スナップエンドウなどの豆類を含む様々な食品をアッセイしました。内...

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Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

市販のエストロゲン受容体βレポーターアッセイを最適化し、エストロゲン活性に対するヒトおよび非ヒト霊長類食品をスクリーニングしています。我々は、既知のエストロゲンヒト食品大豆が高く登録されているのに対し、他の食品は活性を示さないことを示すことによって、このアッセイを検証した。

レポーターアッセイによる細胞ベースのエストロゲン受容体β使用したフィトエストロゲンのスクリーニング

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

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Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

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低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

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Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

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Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

β-アレプチンの並列尋問2 PRESTOタンゴアッセイを用いたGPCR規模でのリガンドスクリーニングの募集

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

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NMRベースのフラグメントスクリーニングは、最小サンプルで最大限の自動化モードで

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...