Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

نود أن نشكر أندرو ليم، دكتوراه وجايلز بيست، دكتوراه لمساعدتهم في إعداد تدفق مقياس المقاييس. وقد دعم هذا المشروع دويتشه هـيـزنغـسجيمينشافت (DFG-HA 8481/1-1) الذي مُنح لـ PH.

وقد وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان في منطقة الصحة المحلية في شمال سيدني على جميع الإجراءات المذكورة في هذا البروتوكول. يتم إيواء الفئران ورعايتها وفقًا لدليل رعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها (المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا، المنقح لعام 2010). لجميع التجارب 10-12 أسبوعا من ا?...

<ol>
	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

وقد تم تصميم واختبار الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول لتحديد موثوق مجموعات فرعية مختلفة من كل من أحادية الخلايا / الضامة والخلايا التائية داخل الطحال مورين، نخاع العظام، والغدد الليمفاوية، والأنسجة الزليلي في نموذج مورين من هشاشة العظام (الزراعة العضوية). يمكن تعديل البروتوكول الحالي بس...

هشاشة العظام (الزراعة العضوية) هو مرض موهن ومؤلم يشمل مختلف الأمراض من جميع الأنسجة المرتبطة بالمفصل1. تؤثر على ما يقرب من 3.8٪ من سكان العالم2, الزراعة العضوية هي واحدة من أكثر الأمراض العضلية الهيكلية انتشارا وأنه من أن تصبح السببالرئيسي 4 من الإعاقة في جميع أنحاء العالم بحلول عام 20203. بعد الصدمة الزراعة العضوية يحدث بعد إصابة المفاصل وحسابات لا تقل عن 12٪ من جميع الزراعة العضوية وما يصل إلى 25٪ من الزراعة العضوية في المفاصل عرضة مثل الركبة4,5. وعلاوة على ذلك، فإن إصابة المفاصل تزيد من خطر100000000000000000000000000000000000000000000000000000 لن تستمر جميع الإصابات التي يبدو أنها غير مُتشابهة في تطوير الزراعة العضوية، وبالتالي فإن تحديد العوامل التي تدفع خطر الزراعة العضوية على المدى الطويل لا يزال يشكل تحدياً. ومن الأهمية بمكان من أجل تطوير علاجات فعالة لمنع و / أو علاج الزراعة العضوية بعد الصدمة ، للتحقيق وتحديد أفضل الأمراض المتعلقة بالإصابات ، والأسباب ، والآليات التي تهيئ لOA1.
OA والتدمير الغضروف تعريفه كان يعزى سابقا تماما إلى الإجهاد الميكانيكية، وهكذا، كان يعتبر OA مرض غير الالتهابي2. ومع ذلك، أظهرت دراسات أكثر حداثة تسلل التهابي من الأغشية الزليلية وزيادة الخلايا الالتهابية في الأنسجة الزليلية في المرضى الذين يعانون من الزراعة العضوية مقارنة مع الضوابط الصحية2، تسليط الضوء على عنصر التهابي كقوة دافعة محتملة في الزراعة العضوية. وأشارت دراسات أخرى إلى أن شذوذ في كل من CD4 + و CD8 + T-الخلية الشخصية وكذلك monocytes / الضامة من الجهاز المناعي الفطرية قد تسهم في التسبب فيOA 2,7. وكشفت التحقيقات التفصيلية في هذه التشوهات الأدوار ذات الصلة لمختلف المجموعات الفرعية خلية T2، مثل Th18، Th29، Th178 و T التنظيمية (Treg) السكان10،11. على الرغم من هذه الأدلة الدامغة ، فإن العلاقة السببية بين تغيير استجابات الخلايا التى وتطور وتطور الزراعة العضوية لا تزال غير معروفة2.
بالإضافة إلى خلايا تي محددة لها دور في الزراعة العضوية، تشير الدراسات الحديثة إلى أن الضامة المستقطبة /المنشطة قد تكون مرتبطة بتولدية OA12. على وجه الخصوص، الضامة التي تنشأ من أحاديات الدم تتراكم في السينوفيوم والاستقطاب في إما الضامة المنشطة كلاسيكيا (M1) أو بدلا من ذلك تفعيل الضامة (M2) أثناء التنمية الزراعة العضوية، مما يعني وجود علاقة بين الضامة المشتقة monocyte وOA13. في المقابل، مجموعات فرعية معينة من الضامة ملء الأعضاء في وقت مبكر أثناء التنمية والاكتفاء الذاتي أعدادهم في مادة مستقلة monocyte14. في الآونة الأخيرة، تم عرض وظيفة حماية مشتركة بوساطة حاجز ضيق الوصل لهذه الضامة الزليلية الأنسجة المقيم (STRMs)14. وتشير هذه النتائج إلى أن الشذوذ في مجموعات فرعية خاصة من الضامة قد تلعب دوراً حاسماً أثناء تطوير الزراعة العضوية. ومع ذلك، فإن التفاعلات بين هذه الاستجابة الخلوية الالتهابية والتغيرات الهيكلية في المفصل اللاحق للصدمة غير معروفة.
تاريخيا، كان يقتصر تحليل الخلايا المناعية في الأنسجة الزليلية على الكيمياء المناعية (IHC) أو التعبير مرنا عن طريق عكس النسخ تفاعل البوليمرات سلسلة (RT-PCR) النهج15،16. ومع ذلك، فإن كلا من IHC وRT-PCR تفتقر إلى القدرة على تحديد أنواع مختلفة متعددة من الخلايا و مجموعاتها الفرعية في وقت واحد، وبالتالي الحد من إمكانية تطبيق هذه الطرق. وعلاوة على ذلك، يقتصر IHC لتحليل عينات صغيرة من الأنسجة، وقد يغيب عن تراكم الخلايا الالتهابية البؤري. على مدى السنوات القليلة الماضية، تم تطوير عدد لا يحصى من علامات السطح لأنواع مختلفة من الخلايا، ويمكن الآن تحديد مجموعات فرعية من الخلايا المناعية بشكل موثوق من خلال مجموعات متميزة من هذه العلامات. بسبب التقدم التقني المطرد، أجهزة قياس التدفق قادرة الآن على تحديد العديد من الفلوروكرومات المختلفة في وقت واحد مما يتيح تحليل لوحات الأجسام المضادة متعددة الألوان الكبيرة.
يوفر قياس التدفق الخلوي للمحققين تقنية قوية تسمح بتحديد وقياس كمية العديد من الخلايا المناعية و المجموعات الفرعية الخاصة بها على مستوى الخلية المفردة. لقد طورنا وحسّنا كل من مقايسة تلطيخ خارج الخلية لتحديد أحاديات / الضامة و المجموعات الفرعية الخاصة بهم وكذلك مقايسة تلطيخ إضافية / داخل الخلايا لتحديد الخلايا التائية و مجموعاتها الفرعية داخل طحال المورين ونخاع العظام والغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلية. تم تحسين كل خطوة من هذا البروتوكول واختبارها مما أدى إلى محك قابل للاستنساخ للغاية يمكن استخدامه لنماذج أخرى ماوس OA الجراحية وغير الجراحية17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

هشاشة العظام (OA) هي واحدة من أكثر الأمراض العضلية الهيكلية انتشارا، مما يؤثر على المرضى الذين يعانون من الألم والقيود الجسدية. وتشير الأدلة الحديثة إلى وجود عنصر التهابي محتمل للمرض، مع احتمال ارتباط كل من الخلايا التائية والخلايا أحادية الخلايا/الضامة بتولدات المرض من الزراعة العضوية. وقد افترضت دراسات أخرى دوراً هاماً لكل من مجموعات فرعية من أنساب الخلايا الالتهابية، مثل Th1 وTh2 وTh17 و T-تنظيمية لللمفيات، و M1 و M2 و الضامة السينوفية للأنسجة المقيمة. ومع ذلك، فإن التفاعل بين الاستجابة الخلوية الالتهابية المحلية والنظامية والتغيرات الهيكلية في المفصل غير معروف. لفهم كامل كيف تي الخلايا monocytes / الضامة تسهم في الزراعة العضوية، من المهم أن تكون قادرة على تحديد كمي هذه الخلايا و المجموعات الفرعية الخاصة بهم في وقت واحد في الأنسجة الزليلي، والأعضاء اللمفاوية الثانوية وبشكل نظامي (الطحال ونخاع العظام). في الوقت الحاضر، يمكن تحديد المجموعات الفرعية الخلية الالتهابية المختلفة من خلال مزيج من علامات سطح الخلية مما يجعل عملية استئصال الخلايا متعددة الألوان تقنية قوية في التحقيق في هذه العمليات الخلوية. في هذا البروتوكول، ونحن وصف الخطوات التفصيلية بشأن حصاد الأنسجة الزليلي والأعضاء اللمفاوية الثانوية، فضلا عن توليد تعليق خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، نقدم كل من فحص تلطيخ خارج الخلية لتحديد أحاديات / الضامة و المجموعات الفرعية الخاصة بهم، فضلا عن فحص تلطيخ خارج وداخل الخلوية لتحديد الخلايا التائية وتفرعاتها داخل طحال المورين، نخاع العظام، الغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلية. تم تحسين كل خطوة من هذا البروتوكول واختبارها ، مما أدى إلى اختبار قابل للاستنساخ للغاية يمكن استخدامه لنماذج أخرى من ماوس الزراعة العضوية الجراحية وغير الجراحية.

يتم أدناه وصف النتائج التمثيلية من كل من لوحة المجموعة الفرعية أحادية الخلية و T-cell.
يوضح الشكل 1 استراتيجية البوابات الهرمية للوحة الفرعية أحادية الخلايا على الخلايا المناعية التي تم جمعها من نخاع العظم للحيوانات المعالجة DMM. واستخدمت نفس الاستراتيجية وتحق...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

هنا، نحن وصف مفصلة واستنساخ تدفق العلاج الخلوي بروتوكول لتحديد أحادية / الضامة والخلايا التائية باستخدام كل من خارج وداخل الخلايا تلطخ المقايسات داخل الطحال مورين، نخاع العظام، والعقد الليمفاوية والأنسجة الزليلي، وذلك باستخدام نموذج جراحية راسخة من هشاشة العظام.

تحليل تدفق الخلايا الخلوية من المجموعات الفرعية الخلية المناعية داخل الطحال مورين, نخاع العظام, الغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلي في نموذج هشاشة العظام

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

بروتوكول لدينا تمكن من تحديد مفصل وتحليل أحاديات والخلايا الضامة والخلايا التائية و المجموعات الفرعية ذات الصلة داخل الخلايا العصبية وovium ومختلف الأنسجة الأخرى في الجهاز المناعي. تقنية لدينا يسهل الحصاد موثوق بها من خلايا المناعة الحياة من synovium وغيرها من الأنسجة ذات الصلة لتوصيف شامل للاستجابة المناعية العظام. لعزل الأنسجة ذات الاهتمام من الماوس نموذج هشاشة العظام، مع الماوس في وضع سوبين، مسح الصدر والبطن والساقين مع 70٪ الإيثانول.استخدم المقص لفتح الجلد بعناية على طول خط الوسط في البطن مع ترك تجويف البطن سليمًا. وسحب بلطف الجلد على الجانب الأيمن من الحيوان بعيدا عن العضلات الكامنة، وترك الأنسجة الدهنية تحت الجلد تعلق على الجلد. ضع الفأر تحت مجهر تشريح واستخدام اثنين من ملقط ناعم المنحنية لندف بلطف خارج الأنسجة الدهنية الموجودة في الفخذ.بعد تحديد الأوعية الثلاث المتقاطعة ، استخدم ملقطًا دقيقة لإزالة العقدة الليمفاوية الإربية الموجودة عند تقاطع الأوعية ، مع الحرص على عدم تمزق الكبسولة. استخدام ملقط لإزالة الدهون المتبقية من سطح العقدة الليمفاوية وفتح تجويف البطن. إذا لم يكن هناك ما تبقى من الدهون يمكن رؤيتها، ضع العقدة الليمفاوية على الفور في لوحة أعدت سابقا ووصفت ستة جيدا مليئة 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI.بعد ذلك، افتح تجويف البطن. استخدام مقص غرامة لاستخراج الطحال واستخراج بلطف الأمعاء لفضح الشريان الأبهر وتشعب لها. بعد ذلك، ضع الطحال على الفور في أعدت سابقا ووصفت ستة لعبت بشكل جيد مليئة 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI.إزالة العقدة اللمفاوية الحرقفية الموجودة في الجزء الطرفي من الشريان الأورطي البطني وأصل الشريان الحرقفي المشترك وإزالة الجلد بعناية من كلا الطرفين الخلفيين. ضع العقدة الليمفاوية على الفور في لوحة معدة مسبقًا ووصفت بطبقة سداسية مع 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI التي تجمع جميع الغدد الليمفاوية من حيوانين. باستخدام مقص غرامة أو مشرط تنظيف عظم الفخذ الأيسر من الأنسجة العضلية المرفقة وقطع بعناية كل من خنق والورك المشترك، وترك العظام كلها سليمة أثناء إزالة عظم الفخذ.ثم وضعت عظم الفخذ في إعدادها سابقا ووصفت ستة لوحة جيدا مليئة 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI. تحديد وتر الرضفة من الحق خنق المفصل واستخدام مقص غرامة لإزالة الأنسجة العضلية المجاورة قريبة إلى مشترك حتى ما يقرب من خمسة ملليلترات من وتر رباعية وكيل الرضفة يتعرض. قطع من خلال وتر رباعية ما يقرب من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات قريبة إلى الرضفة لتشكيل مقبض واستخدام ملقط غرامة لسحب بلطف التوتر بعيدا عن المفصل لفضح حواف المرفق كبسولة مشتركة.بدءا من عظم الفخذ والتحرك نحو الساق، واستخدام مشرط لقطع بعناية على طول حواف كبسولة مشتركة على كلا الجانبين مع الحفاظ على الجر لطيف على وتر رباعية. عندما يتم إرفاق كتلة الأنسجة الزليلي فقط إلى الساق، وينبغي أن تكون لوحة الدهون داخل العين واضحة إلى الرضفة ويمكن فصل بلطف من الجانب المشترك والمرئي من مينسكي. ثم, قطع على طول الجزء المتبقي من كبسولة مشتركة لإزالة كتلة الأنسجة الزليلي ووضعها على الفور في لوحة أعدت سابقا ووصفت ستة جيدا مليئة 1.5 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI.عندما تم جمع جميع الأنسجة، ضع طحالين مجمعين لكل حالة على مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 15 ملليلتر واستخدم ممسحة حقنة معقمة تبلغ ثلاث ملليلتر لمعدل الكتلة بلطف للأنسجة من خلال مرشح الشبكة الذي ينظف المصفاة بشكل متكرر مع ما مجموعه ستة ملليلترات من RPMI 1640 متوسطة مكمّلة بنسبة 10٪ FBS. رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من تحلل خلايا الدم الحمراء. بعد خمس دقائق، ووقف رد فعل مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وطاردة مركزية الخلايا.عندما لا يتم ملاحظة المزيد من خلايا الدم الحمراء، إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد للعد. لمعالجة العقدة الليمفاوية مكان جميع الغدد الليمفاوية الأربع على مصفاة خلية ميكرومتر 70 في أنبوب جديد 15 ملليلتر واستخدام جديد معقمة ثلاثة المليلتر المكبس ندف بلطف الغدد الليمفاوية من خلال شبكة في تعليق خلية واحدة، ثم الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة G لمدة خمس دقائق، والتخلص من السوبر وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني للعد. لعزل نخاع العظم، استخدم ملقط إبهام الأنسجة لإدراك عظم الفخذ السليم بعناية واستخدام مقص حاد لقطع نهاية عظم الفخذ القريب.أدخل إبرة قياس 23 في منتصف الشق بين الأوعية من عظم الفخذ وتدوير الإبرة أثناء تطبيق ضغط لطيف لحفر ثقب في الشق. تغيير الإبرة حسب الضرورة، طرد محتويات العظام مع ستة ملليلتر من RPMI تكملها 10٪ FBS على مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنبوب جديد 15 ملليلتر واستخدام جديد ثلاثة ملليلتر المكبس حقنة للضغط بلطف نخاع العظم من خلال شبكة. بعد ذلك، تنفيذ خطوة RBC كما هو موضح بالنسبة الطحال.عندما لا يتم ملاحظة المزيد من خلايا الدم الحمراء، إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد للعد. لمعالجة الأنسجة الزليلي استخدام مقص الجراحية غرامة لنرد كتل النسيج الزليلي اثنين إلى قطع صغيرة ونقل العينات إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. شطف حاوية جمع مع 500 ميكرولترات من المتوسطة لجمع أي الخلايا المتبقية والأنسجة الزليلي وسحب الغسيل في أنبوب جمع العينة.بعد ذلك، إضافة كمية كافية من الانزيم لتحقيق في وحدة واحدة لكل ملليلتر التركيز النهائي وهضم عينة الأنسجة الزليلي في 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة ساعتين من الدوار. ضمان حركة كافية عند وضع الأنابيب في الدوار. في نهاية الحضانة، ووقف الهضم مع ثمانية ملليلتر من RPMI تستكمل مع 10٪ FBS وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب جديد 15 ملليلتر.شطف أنبوب 15 ملليلتر القديمة مع خمسة ملليلتر من المتوسطة واستخدام هذا لغسل مرشح. ثم، رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني للعد. لأداء تلطيخ البقاء للخلايا المناعية المعزولة، إضافة خمس مرات 10 إلى الخلايا الخمس من كل تعليق خلية إلى الآبار المناسبة من اثنين من مختلف 96 جيدا يو القاع لوحات وجمع الخلايا إلى الجزء السفلي من كل بئر.وتشمل دائما الخلايا غير المطّوعة كافية من كل نوع الأنسجة والضوابط السلبية. غسل الخلايا مع 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من الخلايا في صبغة تفاعلية أمين permeant في البئر لاحتضان 15 دقيقة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في نهاية الحضانة يغسل الخلايا مرتين في 200 ميكرولترات من FACS العازلة في غسل وإعادة تعليق كل بيليه في 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة المناسبة من الفائدة أو السيطرة كوكتيل.إذا تم إجراء كل من داخل وخارج الخلية تلطيخ في نفس أداء خطوة التلطيخ خارج الخلية الآن. بعد 30 دقيقة حضانة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء غسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولترات من FACS العازلة في البئر وإعادة تعليق الخلايا ولوحة لوحة فرعية monocyte في 250 ميكرولترات من FACS العازلة تستكمل مع EDTA EDTA واحد ملليمولار. إجراء هذه الخطوة فقط إذا لم يتم التخطيط لتلطيخ داخل الخلايا، وإلا انتقل إلى جانب تلوين داخل الخلايا من البروتوكول.ثم، نقل كل عينة فرعية أحادية إلى أنبوب FACS المقابل المناسب على الجليد المحمي من الضوء. بالنسبة للتلوين بين الخلايا لخلايا اللوحة الفرعية T-cell، قم بإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولترات من عازل التثبيت من مجموعة التثبيت والنفاذ المناسبة لاحتضان لمدة 40 دقيقة عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في نهاية الحضانة غسل الخلايا مرتين مع 200 microliters من permeabilization غسل العازلة وإعادة تعليق الكريات في 100 microliters من الأجسام المضادة المناسبة من الفائدة أو السيطرة كوكتيل لاحتضان 40 دقيقة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء.ثم، وغسل الخلايا مرتين في 200 ميكرولتر من permeabilization غسل العازلة في غسل. وإعادة تعليق الخلايا في 250 ميكرولتردات من FACS بالإضافة إلى مخزن EDTA قبل نقل العينات إلى أنابيب FACS المناسبة على الجليد المحمية من الضوء. هنا ، يمكن ملاحظة استراتيجية البوابات الهرمية للوحة الفرعية أحادية الخلايا على الخلايا المناعية التي تم جمعها من نخاع العظم للحيوانات المعالجة DMM.يمكن استخدام المتصيدون غير الملطخة لتحديد السلبيات الحقيقية للثوّل الحي الميت ويمكن تعديل البوابات في كل مرة يتم فيها إجراء التجربة حسب الضرورة. في هذا التحليل التمثيلي، تم عزل الخلايا المناعية من الأنسجة الزليلية وملطخة بعلامات سطحية خارج الخلية، بعد ستة أسابيع من جراحة DMM أو التحكم الصوري. ولوحظت نسبة أعلى من Ly-SC إيجابية MHC2 السلبية و الضامة M2 في الحيوانات المعالجة DMM مقارنة مع مجموعات الخلايا لوحظت في الفئران جراحة صورية.هنا، يمكن ملاحظة استراتيجية التراتبية الهرمية للوحة الخلايا التائية الإضافية والخلية داخل الخلايا على الخلايا المناعية المعزولة عن طحال الحيوانات المعالجة DMM. ويلاحظ نسبة أعلى من خلايا TH1 في الغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلية للحيوانات DMM فضلا عن أعداد أكبر من الخلايا التنظيمية T وخلايا TH17. لضمان الحصول على عينات عالية الجودة ، يجب حصاد الأنسجة بطريقة سريعة ودقيقة ومتسقة.مرة واحدة وقد تم عزل الخلايا المناعية، يمكن إجراء تحليل المصب الأخرى مثل RTPCR، وثقافة الخلية والراحة على الدم لتسليط الضوء على العمليات الجزيئية ذات الاهتمام.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

الإنتاجية العالية التدفق الخلوي القائم على الفحص لكشف خلية أضداد N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات الدوبامين-2 أو مستقبلات في مصل الإنسان

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

ثقافة الأنسجة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الابتدائية نخاع العظم الإنسان والأورام الخبيثة في

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

عالية التردد التصوير بالموجات فوق الصوتية للماوس عنق الرحم الغدد الليمفاوية

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

تحليل يستند الخلوي-Imaging- وتدفق الوظيفة خلية ودورة الخلية في 3D الميلانوما الأجسام الشبه الكروية

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

العزلة والخلوية Phenotyping من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع الزلالية السائل والعظام من Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

تقنية المناظير لجمع المسلسل من الكبد والغدد الليمفاوية مساريقي في قرود المكاك

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

تحديد خصائص الخلايا المناعية في الأنسجة الدهنية البشرية باستخدام التدفق الخلوي

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

قاعدة البيانات--تسترشد التدفق الخلوي لتقييم نضج الخلية النقوي نخاع العظام

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

المطحنة الضغط الإيجابي السفلي للجسم لإعادة التأهيل هشاشة العظام الركبة

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...