Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

我们要感谢安德鲁林，博士和吉尔斯贝斯特，博士，他们在建立流动细胞仪的帮助。该项目得到了授予PH的德国 Forschungsgemeinschaft （DFG-HA 8481/1-1） 的支持。

北悉尼当地卫生区动物伦理委员会已批准本协议中提到的所有程序。根据《实验室动物护理和使用指南》（澳大利亚国家健康和医学研究理事会2010年修订版）对小鼠进行安置和护理。在所有实验中，10-12周大，使用雄性C57BL/6小鼠。
注： 为了诱导创伤后OA，手术破坏右半月板（DMM）在右窒息关节的稳定。有关这种动物模型的详细资料由格拉森等人18日...

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	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

本协议中描述的方法经过设计和测试，能够可靠地识别骨髓脾脏、骨髓、淋巴结和骨髓（OA）骨髓模型中的单细胞/巨噬细胞和T细胞的各种子集。通过交换抗体，可以方便地修改当前协议，以研究不同的组织类型或其他细胞类型，并可用于OA的替代穆林模型。在测试其他组织类型时，由于免疫细胞的表面标记在20组织中不同，因此测试每个抗体的特异性至关重要。此外，在交换抗?...

骨关节炎（OA）是一种使人衰弱和痛苦的疾病，涉及与关节1相关的所有组织的各种病理。OA是最常见的肌肉骨骼疾病之一，到2020年成为全球第四大残疾病因。创伤后OA发生在关节损伤后，在易感关节（如膝关节4、5）中，至少占所有OA的12%和OA的25%。此外，关节损伤使OA的终生风险增加5倍以上。并非所有明显类似的伤害都会继续发展OA，因此，驱动长期OA风险的决定性因素仍然具有挑战性。为了开发预防和治疗创伤后OA的有效治疗方法，调查和更好地定义容易患OA 1的损伤特异性病理学、病因和机制，这一点至关重要。
OA及其定义软骨破坏以前完全归因于机械应力，因此，OA被认为是一种非炎症性疾病2。然而，最近的研究表明，与健康对联2相比，OA患者的突触膜的炎症渗透和炎症细胞的增加，使炎症成分成为OA的潜在驱动力。2进一步的研究表明，CD4+和CD8+T细胞型的异常以及先天免疫系统的单核细胞/巨噬细胞都可能导致OA2，7的发病机制。详细调查这些异常发现各种T细胞子集2的相关作用，如Th1 8，Th29，Th178和T调控（特雷格）群体910，11。10,11尽管有这种令人信服的证据，T细胞反应的改变与OA的发展与进展之间的因果关系仍然不为人知。
除了在OA中发挥作用的特定T细胞外，最近的研究表明，分化的极化/激活的巨噬细胞可能与OA12的发病机制有关。特别是，来自血液单核细胞的巨噬细胞在合成中积累并极化成经典激活的巨噬细胞（M1）或OA发育期间的替代激活巨噬细胞（M2），这意味着单细胞衍生巨噬细胞和OA13之间的相关性。相比之下，某些巨噬细胞的子集在发育早期填充器官，并在单核细胞独立物质14中自我维持其数量。最近，这些突触组织-居民巨噬细胞（STRMs）14显示由紧密结阻屏障调解的关节保护功能。这些发现表明，异常，特别是巨噬细胞子集，可能在OA的发育过程中发挥关键作用。然而，这种炎症性细胞反应和创伤后关节的结构变化之间的相互作用是未知的。
从历史上看，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法15，16，对突触组织中免疫细胞的分析仅限于免疫组织化学（IHC）或mRNA,表达。然而，IHC和RT-PCR都缺乏同时识别多个不同细胞类型及其子集的能力，因此限制了这些方法的适用性。此外，IHC仅限于分析小组织样本，并可能错过焦点炎症细胞积累。在过去的几年中，已经开发出了各种细胞类型的无数表面标记，免疫细胞的子集现在可以通过这些标记的不同组合可靠地识别出来。由于技术的进步，流动细胞计现在能够同时识别多种不同的氟化物，从而能够分析大型多色抗体面板。
流细胞学为研究者提供了一种强大的技术，允许在单细胞水平上同时识别和量化大量免疫细胞及其子集。我们开发和优化了细胞外染色分析，以识别单细胞/巨噬细胞及其子集，以及额外的/细胞内染色检测，以识别T细胞及其子集在骨髓脾脏，骨髓，淋巴结和合成组织。该协议的每一步都进行了优化和测试，结果一个高度可重复的检测，可用于其他手术和非手术OA小鼠模型17。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

骨关节炎 （OA） 是最常见的肌肉骨骼疾病之一，影响患者遭受疼痛和身体限制。最近的证据表明，该病的潜在炎症成分，T细胞和单核细胞/巨噬细胞可能与OA的发病机制有关。进一步的研究假设了炎症细胞系子集（如Th1、Th2、Th17和T-调节淋巴细胞）以及M1、M2和合成组织驻留巨噬细胞的重要作用。然而，局部突触和全身炎症细胞反应与关节结构变化之间的相互作用尚不得而知。为了充分了解T细胞和单细胞/巨噬细胞如何对OA的贡献，重要的是能够在突触组织、继发淋巴器官和系统（脾脏和骨髓）中同时大量识别这些细胞及其子集。如今，不同的炎症细胞子集可以通过细胞表面标记的组合来识别，使多色流细胞仪成为研究这些细胞过程的有力技术。在该协议中，我们描述了有关合成组织和继发淋巴器官的收获以及单细胞悬浮液的生成的详细步骤。此外，我们同时提供细胞外染色测定，以识别单细胞/巨噬细胞及其子集，以及一个细胞外染色和细胞内染色检测，以识别T细胞及其子集内的骨髓脾脏，骨髓，淋巴结和合成组织。该协议的每一步都经过优化和测试，结果可以进行高度可重复的检测，可用于其他手术和非手术 OA 小鼠模型。

下面介绍了单核子集面板和 T 细胞子面板的代表性结果。
图1 说明了从DMM治疗动物骨髓中采集的免疫细胞上单细胞子集面板的分层浇注策略。在所有其他组织类型中都使用了同样的策略并验证了这种策略。在设置实验时，确定了每种组织类型的前射散区 （FSC-A） 和侧散射区 （SSC-A） 电压，以识别单细胞/巨噬细胞并排除 T 细胞和碎屑 （G1）。在每个实验...

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

在这里，我们描述了一个详细和可重复的流细胞学方案，利用穆林骨关节炎的既定手术模型，使用细胞外和细胞内染色测定，确定单细胞/巨噬细胞和T细胞子集。

骨关节炎模型中骨髓、骨髓、淋巴结和合成组织内免疫细胞子集的流动细胞测量分析

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

我们的协议能够详细识别和分析单细胞和巨噬细胞和T细胞及其相关的子集内的神经元和卵巢和各种其他组织的免疫系统。我们的技术有助于从合成器和其他相关组织中可靠地收获生命免疫细胞，以便全面描述骨关节炎免疫反应。对于从骨关节炎模型小鼠分离感兴趣的组织，用鼠标在超活位置，用70%乙醇擦拭胸部、腹部和腿部。使用剪刀小心地打开腹部中线的皮肤，同时保持腹腔完好无损。轻轻地将动物右侧的皮肤从底层肌肉中拉离，使皮下脂肪组织附着在皮肤上。将鼠标放在解剖显微镜下，使用两个弯曲的细钳轻轻梳理出位于大腿上的脂肪组织。识别出三个交叉血管后，使用精细解剖钳子去除位于血管交汇处的内结淋巴结，注意不要破裂胶囊。使用钳子从淋巴结表面去除剩余的脂肪，并打开腹腔。如果无法看到剩余的脂肪，请立即将淋巴结放在先前准备的六个井板中，并标有 0.5 毫升的 RPMI 介质。此后，打开腹腔。使用细剪刀切除脾脏，轻轻提取肠道，露出大阳高及其分叉。此后，立即将脾脏放在先前准备的六个播放良好、充满 0.5 毫升 RPMI 介质的标记中。切除位于腹部主动脉终端段的伊利亚克淋巴结和常见腹腔动脉的起源，并小心地从两个后肢上去除皮肤。立即将淋巴结放在先前准备的六井板中，并标有 0.5 毫升的 RPMI 介质，将来自两个动物的所有淋巴结集中。使用细剪刀或手术刀清洁附着肌肉组织的左股骨，并小心地断开窒息和臀部关节，使整个骨骼完好无损，同时去除股骨。然后将股骨放在先前准备的六个井板中，并加注了 0.5 毫升的 RPMI 介质。识别右侧扼杀关节的肌腱，并使用细剪刀将相邻的肌肉组织近到关节，直到约五毫升的四头肌肌腱近向关节暴露。切开四头肌肌腱约三到四毫米近到帕泰拉形成一个手柄，并使用细钳轻轻地拉开关节的张力，以暴露关节胶囊附件的边缘。从股骨开始，向头骨移动，使用手术刀小心地沿着两侧的关节胶囊的边缘切割，同时保持四头肌肌腱的温和牵引力。当突触组织块仅附着在头骨上时，关节内脂肪垫应清晰可见，并且可以轻轻地与明斯基的关节和前部分离。然后，沿着关节胶囊的剩余部分切割，取出突触组织块，并立即将其放在先前准备的六井板中，并加注了1.5毫升的RPMI介质。收集所有组织后，将每个条件的两个池状的池状物放在 15 毫升管中的 70 微米细胞过滤器上，并使用无菌的 3 毫升注射器柱塞通过网状过滤器频繁冲洗应变器，总共用 10%FBS 补充 6 毫升的 RPMI 1640 介质。通过离心沉淀细胞，并在五毫升红血球解泡河豚中重新悬浮颗粒。五分钟后，停止与10毫升PBS的反应，并离心机。当不再观察到红血球时，将颗粒重新悬浮在一毫升新鲜PBS中进行计数。对于淋巴结处理，将所有四个淋巴结放在一个新的15毫升管中的70微米细胞过滤器上，并使用新的无菌三毫升柱塞通过网格轻轻戏弄淋巴结到单个细胞悬浮液中，然后以500次G离心细胞5分钟，丢弃上清液，并在500微升PBS中重新悬浮颗粒进行计数。要分离骨髓，请使用组织拇指钳小心地抓住完整的股骨，并使用锋利的剪刀切断近端股骨的端。将 23 测量针插入股骨的凹槽中间，旋转针头，同时施加温和压力，将孔钻入凹口。必要时更换针头，用六毫升的 RPMI 将骨内容物冲洗，并辅以 10%FBS，将骨质填充剂冲洗到新的 15 毫升管上的 70 微米细胞过滤器上，并使用新的 3 毫升注射器柱塞轻轻按压骨髓通过网。此后，执行 RBC 步骤，如脾脏所证明的。当不再观察到红血球时，将颗粒重新悬浮在一毫升新鲜PBS中进行计数。对于合成组织的处理，使用精细的手术剪刀将两个突触组织块切成小块，将样品转移到新的15毫升管中。用500微升的介质冲洗收集容器，收集剩余的细胞和合成组织，并在样品收集管中拉洗。接下来，加入足够量的酶，以达到每毫升一个单位的最终浓度，并在37摄氏度的培养箱中消化突触组织样本，在旋转器中消化两个小时。将管子放在旋转器中时，确保有足够的运动。在孵育结束时，停止消化与8毫升的RPMI补充10%FBS，并通过70微米细胞过滤器过滤细胞悬浮液到一个新的15毫升管。用五毫升的介质冲洗旧的 15 毫升管，然后用它来清洗过滤器。然后，通过离心沉淀细胞，将颗粒重新悬浮在500微升PBS中进行计数。为了对分离的免疫细胞进行生存能力染色，将五倍10添加到每个细胞悬浮液的五个细胞中，加入到两个不同的96孔U底板的适当孔中，并将细胞收集到每个孔的底部。始终将每种组织类型的足够未污染细胞作为负对联。用200微升PBS洗涤细胞，并在每井渗透胺反应染料中重新悬浮100微升细胞中的颗粒，在4摄氏度下孵育15分钟，不受光线影响。在孵育结束时，每次洗涤时用200微升的FACS缓冲液洗两次细胞，并在100微升的适当抗体或控制鸡尾酒中重新悬浮每个颗粒。如果同时进行细胞内和细胞外染色，现在执行细胞外染色步骤。在4摄氏度下孵育30分钟后，每井用200微升的FACS缓冲液两次清洗细胞，并在250微升的FACS缓冲液中重新悬浮细胞和单细胞子板，并辅以1毫摩尔EDTA。仅计划未计划细胞内染色时执行此步骤，否则将转到协议的细胞内染色方面。然后，将每个单细胞子集样品转移到适当的相应的 FACS 管中，防止光线。对于T细胞子板细胞的细胞间染色，从适当的固定和渗透试剂盒中重新悬浮200微升固定缓冲液中的颗粒，在4摄氏度下孵育40分钟，不受光线影响。在孵育结束时，用200微升的渗透洗涤缓冲液两次清洗细胞，并在100微升的适当抗体或控制鸡尾酒的100微升中重新悬浮，在4摄氏度的高温下进行40分钟的孵育。然后，每次洗涤用200微升的渗透洗涤缓冲液洗两次细胞。在将样品转移到适当的FACS管中防止光线扩散之前，将250微升的FACS和EDTA缓冲液中的细胞重新悬浮。在这里，可以观察到从DMM治疗动物骨髓收集的免疫细胞上单细胞子集面板的分层浇注策略。未染色的巨魔可用于确定活活死亡污渍的真实底片，并且每次根据需要进行实验时，都可以调整门。在这个具有代表性的分析中，免疫细胞从突触组织分离，并在DMM或假对照手术六周后被染色，并染上细胞外表面标记。与在假手术小鼠中观察到的细胞数量相比，在DMM治疗的动物中观察到的Ly-SC阳性MHC2阴性及M2巨噬细胞的百分比较高。在这里，可以观察到从DMM治疗动物脾脏分离的免疫细胞上额外和细胞内T细胞面板的分层浇注策略。在DMM动物的淋巴结和突触组织中观察到的TH1细胞比例较高，T调节细胞和TH17细胞的数量也较高。为了确保获得高质量的样品，必须迅速、细致和一致地采集组织。一旦免疫细胞被分离，其他下游分析可以进行，如RTPCR，细胞培养和休息在血液中，以照亮感兴趣的分子过程。

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

采用实时定量PCR检测供体细胞植入一个具有竞争力的小鼠骨髓移植模型

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

科研

医学

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

高通量流式细胞仪检测细胞为基础的试验检测抗体，以N-甲基-D-天冬氨酸受体或多巴胺2受体在人血清

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

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三维组织培养模型研究人类原发性骨髓和恶性肿瘤

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High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

鼠标颈淋巴结高频超声成像

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

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单元位置的Imaging-和流式细胞仪为基础的分析和3D球体黑色素瘤细胞周期

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

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从小型猪关节液和骨髓间充质干细胞的分离和细胞表型

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The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

下体正压跑步机用于膝关节骨关节炎康复

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...