Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Vi vil gerne takke Andrew Lim, Ph.D. og Giles Best, Ph.D. for deres hjælp til at oprette flow cytometer. Dette projekt blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1), der blev tildelt PH.

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee har godkendt alle procedurer, der er nævnt i denne protokol. Mus er opstuderet og plejes i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr (National Health and Medical Research Council of Australia Revideret 2010). For alle eksperimenter blev 10-12 uger gamle, mandlige C57BL/6 mus udnyttet.
BEMÆRK: At fremkalde post-traumatisk OA, kirurgisk destabilisering af den mediale menisk (DMM) i højre...

<ol>
	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

De metoder, der er beskrevet i denne protokol er designet og testet til pålideligt at identificere forskellige delmængder fra både monocytter / makrofager og T-celler i murine milten, knoglemarv, lymfeknuder, og synovialvæv i en murine model af slidgigt (OA). Den nuværende protokol kan nemt ændres til at undersøge forskellige vævstyper, eller andre celletyper ved at udveksle antistoffer, og kan bruges til alternative murine modeller af OA. Ved test af andre vævstyper er det afgørende at teste hvert antistofs sp...

Slidgigt (OA) er en invaliderende og smertefuld sygdom, der involverer forskellige patologier af alle væv forbundet med ledt1. OA, der berører ca. 3,8 % af verdensbefolkning 2, er en af de mest udbredte muskel - og skeletsygdomme,og det skal blive den 4. Posttraumatisk OA opstår efter en ledskade og tegner sig for mindst 12 % af al OA og op til 25 % af OA i modtagelige led såsomknæet 4,5. Desuden øger fælles skade levetidsrisikoen for OA med mere end fem gange6. Ikke alle skader med tilsyneladende lignende ustabilitet vil fortsætte med at udvikle OA, og derfor definere faktorer, der driver den langsigtede OA-risiko er fortsat udfordrende. Det er afgørende for at udvikle effektive behandlinger til forebyggelse og/eller behandling af posttraumatisk OA, for at undersøge og bedre definere den skadesspecifikke patologi, årsager og mekanismer, der prædisponerer for OA1.
OA og dens definerende brusk ødelæggelse blev tidligere udelukkende tilskrevet mekanisk stress, og dermed OA blev betragtet som en ikke-inflammatorisk sygdom2. Men, nyere undersøgelser har vist en inflammatorisk infiltration af synovial membraner og en stigning i inflammatoriske celler i synovialvæv hos patienter med OA sammenlignet med sunde kontroller2, kaste lys over en inflammatorisk komponent som en potentiel drivkraft i OA. Yderligere undersøgelser viste, at abnormiteter i både CD4+ og CD8+ T-celleprofilen samt monocytter/makrofager i det medfødte immunsystem kan bidrage til patogenesen af OA2,7. Detaljerede undersøgelser af disse abnormiteter afslørede relevante roller for forskellige8T-celledelmængder28 ,såsom91.11 På trods af denne overbevisende dokumentation er årsagssammenhængen mellem ændringen af T-celleresponser og udviklingen og udviklingen af OA stadig ukendt2.
Ud over specifikke T-celler, der har en rolle i OA, tyder nylige undersøgelser på, at differentieret polariserede/aktiverede makrofager kan være forbundet med patogenese af OA12. Makrofager fra blodmoncytter ophobes i synoviummet og polariseres i enten klassisk aktiverede makrofager (M1) eller alternativt aktiverede makrofager (M2) under udviklingen af OA, hvilket indebærer en sammenhæng mellem monocytafledte makrofager og OA13. I modsætning hertil befolker visse undergrupper af makrofager organer tidligt under udvikling og selv opretholde deres antal i en monocyt uafhængig sag14. For nylig, en fælles beskyttende funktion medieret af en stram-junction barriere blev vist for disse synovial-væv-hjemmehørende makrofager (STRMs)14. Disse resultater tyder på, at abnormiteter i særdeleshed makrofag delmængder kan spille en afgørende rolle under udviklingen af OA. Men samspillet mellem denne inflammatoriske cellulære reaktion og de strukturelle ændringer i den fælles efter traumer er ukendt.
Historisk set var analysen af immunceller i synovialvævet begrænset til immunhisistokemi (IHC) eller mRNA-ekspression ved omvendt transskription polymerase kædereaktion (RT-PCR)tilgange 15,16. Både IHC og RT-PCR mangler imidlertid evnen til at identificere flere forskellige celletyper og deres delmængder samtidigt, hvilket begrænser anvendeligheden af disse metoder. Desuden er IHC begrænset til analyse af små prøver af væv og kan gå glip af fokale inflammatoriske celleakkumulering. I løbet af de sidste mange år er der udviklet et utal af overflademarkører for forskellige celletyper, og delmængder af immunceller kan nu pålideligt identificeres ved hjælp af forskellige kombinationer af disse markører. På grund af den konstante tekniske udvikling er flowcytometre nu i stand til at identificere et væld af forskellige fluorkromer samtidigt, hvilket muliggør analyse af store flerfarvede antistofpaneler.
Flow cytometri giver efterforskere med en kraftfuld teknik, der tillader samtidig identifikation og kvantificering af et væld af immunceller og deres delmængder på enkelt celleniveau. Vi har udviklet og optimeret både en ekstracellulær farvningsanalyse til at identificere monocytter / makrofager og deres delmængder samt en ekstra / intracellulær farvning analyse til at identificere T-celler og deres delmængder inden murine milt, knoglemarv, lymfeknuder og synovialvæv. Hvert trin i denne protokol blev optimeret og testet resulterer i en meget reproducerbar analyse, der kan udnyttes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA mus modeller17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

Slidgigt (OA) er en af de mest udbredte muskel-og skeletsygdomme, der påvirker patienter, der lider af smerte og fysiske begrænsninger. Nylige beviser tyder på en potentiel inflammatorisk komponent af sygdommen, med både T-celler og monocytter / makrofager potentielt forbundet med patogenesen af OA. Yderligere undersøgelser postulerede en vigtig rolle for delmængder af både inflammatoriske celle slægter, såsom Th1, Th2, Th17, og T-regulerende lymfocytter, og M1, M2, og synovium-væv-hjemmehørende makrofager. Samspillet mellem det lokale synovial og systemisk inflammatorisk cellulære respons og de strukturelle ændringer i leddet er imidlertid ukendt. For fuldt ud at forstå, hvordan T-celler og monocytter/ makrofager bidrager til OA, er det vigtigt at være i stand til at metantal identificere disse celler og deres delmængder samtidig i synovialvæv, sekundære lymfeorganer og systemisk (milten og knoglemarven). I dag kan de forskellige inflammatoriske celleundersæt identificeres ved en kombination af celle-overflade markører gør multi-farve flow cytometri en kraftfuld teknik i at undersøge disse cellulære processer. I denne protokol beskriver vi detaljerede trin vedrørende høst af synovialvæv og sekundære lymfeorganer samt generering af enkeltcellesuspensioner. Desuden præsenterer vi både en ekstracellulær farvningsanalyse for at identificere monocytter/makrofager og deres undersæt samt en ekstra- og intracellulær farvningsanalyse for at identificere T-celler og deres delmængder i murin-milten, knoglemarven, lymfeknuderne og synovialvæv. Hvert trin i denne protokol blev optimeret og testet, hvilket resulterer i en meget reproducerbar analyse, der kan udnyttes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA musemodeller.

Repræsentative resultater fra både det monocytdelsætpanel og T-celle-delsætpanelet er beskrevet nedenfor.
Figur 1 illustrerer den hierarkiske gatingstrategi for det monocyt-delsætpanel på immunceller, der er indsamlet fra knoglemarven hos DMM-behandlede dyr. Den samme strategi blev anvendt og verificeret i alle andre vævstyper. Ved opsætning af eksperimentet blev FSC-A-spændingen (Forward Scatter Area) og Side Scatter Area (SSC-A) bestemt for hver vævsty...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Her beskriver vi en detaljeret og reproducerbar flow cytometri protokol til at identificere monocyt / makrofag og T-celle delmængder ved hjælp af både ekstra- og intracellulære farvning assays inden for murine milten, knoglemarv, lymfeknuder og synovialvæv, ved hjælp af en etableret kirurgisk model af murin slidgigt.

Flow Cytometri Analyse af immuncelledelmængder i Murine Milten, Knoglemarv, Lymfeknuder og synovialvæv i en osteokhritis model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Vores protokol muliggør detaljeret identifikation og analyse af monocytter og makrofager og T-celler og deres relevante delmængder inden for neuroner og æg og forskellige andre væv i immunsystemet. Vores teknik letter pålidelig høst af liv immunceller fra synovium og andre relevante væv for en omfattende karakterisering af osteoarthritic immunrespons. For isolering af væv af interesse fra en slidgigt model mus, med musen i en liggende position, tørre brystet, maven og benene med 70% ethanol.Brug saks til omhyggeligt at åbne huden langs midterlinjen af maven, mens du forlader bughulen intakt. Og forsigtigt trække huden på højre side af dyret væk fra den underliggende muskel, forlader subkutane fedtvæv knyttet til huden. Placer musen under en dissekerende mikroskop og bruge to buede fine kraftaffekt til forsigtigt at drille ud fedtvæv placeret på låret.Efter at have identificeret de tre kors fartøjer, bruge fine dissekere kraftog for at fjerne lyskelymfeknude placeret i skæringspunktet mellem fartøjerne, passe på ikke at sprænge kapslen. Brug de vicess til at fjerne de resterende fedt fra overfladen af lymfeknuden og åbne bughulen. Hvis der ikke kan ses resterende fedt, skal lymfeknuden straks i en tidligere forberedt og mærket seks godt plade fyldt med 0,5 milliliter RPMI medier.Herefter skal du åbne bughulen. Brug fin saks til punktafgifter milten og til forsigtigt at udtrække tarmene til at afsløre aorta og dens bifurcation. Herefter skal milten straks i en tidligere forberedt og mærket seks velspillet fyldt med 0,5 milliliter RPMI medier.Fjern iliaca lymfeknude placeret på terminalen segment af abdominal aorta og oprindelsen af den fælles iliaca arterie og forsigtigt fjerne huden fra begge bagben. Umiddelbart placere lymfeknude i en tidligere forberedt og mærket seks godt plade bygget med 0,5 milliliter RPMI medier samle alle lymfeknuder fra to dyr. Ved hjælp af fine saks eller en skalpel rense venstre lårben af den vedhæftede muskelvæv og omhyggeligt afbrudt både kvæle og hofteleddet, forlader hele knoglen intakt, mens du fjerner lårbenet.Derefter placeres lårbenet i en tidligere forberedt og mærket seks godt plade fyldt med 0,5 milliliter RPMI medier. Identificer patella senen af højre kvæle fælles og bruge fine saks til at fjerne den tilstødende muskelvæv proksimalt til fælles, indtil ca. fem milliliter quadriceps sene proksimale til patella er udsat. Skær gennem quadriceps senen cirka tre til fire millimeter proksimalt til patella at danne et håndtag og bruge fine pincet til forsigtigt at trække spændingen væk fra leddet til at udsætte kanterne af den fælles kapsel vedhæftet fil.Begyndende med lårbenet og bevæger sig mod skinnebenet, skal du bruge en skalpel til omhyggeligt at skære langs kanterne af ledkapslen på begge sider og samtidig opretholde en blid trækkraft på quadriceps senen. Når den synoviale vævsblok kun er fastgjort til skinnebenet, skal den intraartikulære fedtpude være klart synlig distalt for patellaen og kan forsigtigt løsrevne fra det fælles og forreste aspekt af Minsky. Derefter skæres langs den resterende del af ledkapslen for at fjerne synovial vævsblokken og straks placere den i en tidligere forberedt og mærket seks brøndplade fyldt med 1,5 milliliter RPMI-medier.Når alle væv er blevet indsamlet, skal du placere to poolede milter pr tilstand på en 70 mikrometercelles si i et 15 milliliterrør og bruge et sterilt tre milliliter sprøjtestemple til forsigtigt at massesumgøre vævene gennem meshfilteret, der skyller ssilakten ofte med i alt seks milliliter RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS. Sediment cellerne ved centrifugering, og re-suspendere pellet i fem milliliter røde blodlegemer lysis puffer. Efter fem minutter stoppes reaktionen med 10 milliliter PBS og centrifugeres cellerne.Når der ikke observeres flere røde blodlegemer, skal pelletsen igen suspenderes i en milliliter frisk PBS til optælling. For lymfeknude behandling placere alle fire lymfeknuder på en 70 mikrometer celle si i en ny 15 milliliter rør og bruge en ny steril tre milliliter stemplet til forsigtigt at drille lymfeknuder gennem masken i en enkelt celle suspension, derefter centrifuge cellerne på 500 gange G i fem minutter, kassér supernatant og re-suspendere pellet i 500 mikrolitere af PBS til optælling. For at isolere knoglemarven, skal du bruge en væv tommelfinger kraftafgængebånd til omhyggeligt at forstå den intakte lårben og bruge skarpe saks til at afskære den allergende af proksimale lårben.Sæt en 23 gauge nål ind i midten af det intercondylar hak af lårbenet og drej nålen, mens du anvender blidt tryk for at bore et hul i hakket. Ændring af nålen efter behov, skyl knogleindholdet med seks milliliter RPMI suppleret med 10% FBS på en 70 mikrometercellesting på et nyt 15 milliliterrør, og brug et nyt tre milliliter sprøjtestempl til forsigtigt at presse knoglemarven gennem masken. Herefter udføre RBC trin som vist for milten.Når der ikke observeres flere røde blodlegemer, skal pelletsen igen suspenderes i en milliliter frisk PBS til optælling. Til behandling af synovialvævet bruge fine kirurgiske saks til at terninger de to synovial væv blokke i bittesmå stykker og overføre prøverne i en ny 15 milliliter rør. Skyl opsamlingsbeholderen med 500 mikroliter medium for at indsamle eventuelle resterende celler og synovialvæv og træk vasken i prøveopsamlingsrøret.Dernæst tilsættes en tilstrækkelig mængde enzym til at opnå i en enhed pr. milliliter endelig koncentration og fordøje synovial vævsprøven ved 37 grader Celsius i en inkubator i to timer af en rotator. Sørg for tilstrækkelig bevægelse, når rørene anbringes i rotatoren. Ved slutningen af inkubationen stoppes fordøjelsen med otte milliliter RPMI suppleret med 10% FBS, og cellesuspensionen filtreres gennem en 70 mikrometercelles si i et nyt 15 milliliterrør.Skyl det gamle 15 milliliterrør med fem milliliter medium og brug dette til at vaske filteret. Derefter sediment cellerne ved centrifugering og resuspend pellet i 500 mikroliter af PBS til optælling. For at udføre levedygtighed farvning af de isolerede immunceller, tilføje fem gange 10 til de fem celler i hver celle suspension til de relevante brønde af to forskellige 96 godt U-bund plader og indsamle cellerne til bunden af hver brønd.Medtag altid tilstrækkelige uopgroede celler af hver vævstype som negative kontroller. Cellerne vaskes med 200 mikroliter PBS, og pelletsene i 100 mikroliter af celler i ametant aminreaktivt farvestof pr. brønd i en 15 minutters inkubation ved fire grader Celsius beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne to gange i 200 mikroliter FACS-buffer pr. vask, og hver pellet suspenderes igen i 100 mikroliter af passende antistof af interesse eller kontrolcocktail.Hvis både intra og ekstracellulær farvning udføres i samme udføre den ekstracellulære farvning trin nu. Efter 30 minutters inkubation ved fire grader Celsius beskyttet mod lys vask cellerne to gange med 200 mikroliter FACS buffer pr brønd og re-suspendere cellerne og monocyt delsæt panel plade i 250 mikroliter af FACS buffer suppleret med en millimolar EDTA. Udbet kun dette trin, hvis der ikke er planlagt nogen intracellulær farvning, ellers skal du gå videre til protokollens intracellulære farvningsaspekt.Derefter overføres hver monocytdelprøve i det relevante tilsvarende FACS-rør på is, der er beskyttet mod lys. Til intercellulær farvning af T-celle-delgruppepanelcellerne skal pellets igen suspenderes i 200 mikroliter af fikseringsbuffer fra et passende fikserings- og permeabiliseringssæt til en 40 minutters inkubation ved fire grader Celsius beskyttet mod lys. Ved slutningen af inkubationen vaskes cellerne to gange med 200 mikroliter af permeabilization vaskebuffer og re-suspendere pellets i 100 mikroliter af passende antistof af interesse eller kontrol cocktail for en 40 minutters inkubation ved fire grader Celsius beskyttet mod lys.Vask derefter cellerne to gange i 200 mikroliter af permeabiliseringsvaskebuffer pr. vask. Og re-suspendere cellerne i 250 mikroliter af FACS plus EDTA buffer, før du overfører prøverne i de relevante tilsvarende FACS rør på is beskyttet mod lys. Her kan den hierarkiske gatingstrategi for monocytdelsættet panel på immunceller indsamlet fra knoglemarven hos DMM-behandlede dyr observeres.Uindgroede trolde kan bruges til at bestemme de sande negativer for de døde levende plet og portene kan justeres, hver gang eksperimentet udføres efter behov. I denne repræsentative analyse blev immuncellerne isoleret fra synovialvævet og farves med ekstracellulære overflademarkører, seks uger efter DMM eller fingeret kontrolkirurgi. En højere procentdel af Ly-SC positive MHC2 negative og M2 makrofager er observeret i DMM behandlede dyr i forhold til de cellepopulationer observeret i fingeret kirurgi mus.Her kan den hierarkiske gatingstrategi for det ekstra og intracellulære T-cellepanel på immunceller, der er isoleret fra milten af DMM-behandlede dyr, observeres. En højere procentdel af TH1 celler er observeret i lymfeknuder og synovial væv af DMM dyr samt højere antal T regulerende celler og TH17 celler. For at sikre erhvervelse af prøver af høj kvalitet skal vævene høstes hurtigt, omhyggeligt og konsekvent.Når immuncellerne er blevet isoleret, kan andre downstream-analyser udføres, såsom RTPCR, cellekultur og hvile på blod for at kaste lys over molekylære processer af interesse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Brug af kvantitativ real-time PCR til Bestem donorcelle indpodning i en konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flowcytometri cellebaseret assay til påvisning af antistoffer til N-methyl-D-aspartat-receptor eller dopamin-2-receptoren i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Et tredimensionalt Tissue Culture Model til Study Primary human knoglemarv og dens Maligne

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Højfrekvente Ultrasound Imaging af Mouse Cervikal lymfeknuder

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- og flowcytometri-baserede Analyse af Cell holdning og Cell Cycle i 3D Melanom Sfæroider

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolering og Cellulær Fænotype af mesenchymal stamceller fra Synovialvæske og knoglemarv af minigrise

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

Laparoskopisk Teknik for Serial Indsamling af Lever og mesenteriallymfeknuder i makakaber

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakterisering af immunceller i menneskers fedtvæv ved hjælp af flowcytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Database-styrede flowcytometri for evaluering af knoglemarven myeloide celle modning

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Den nedre krop positive tryk løbebånd for knæ slidgigt rehabilitering

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...