Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

We willen Andrew Lim, Ph.D. en Giles Best, Ph.D. bedanken voor hun hulp bij het opzetten van de flow cytometer. Dit project werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) toegekend aan PH.

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee heeft alle procedures goedgekeurd die in dit protocol worden genoemd. Muizen worden gehuisvest en verzorgd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Voor alle experimenten 10-12 weken-oude, mannelijke C57BL/6 muizen werden gebruikt.
LET OP: Om posttraumatische OA te induceren, werd chirurgische destabilisatie v...

<ol>
	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

De methoden beschreven in dit protocol zijn ontworpen en getest om betrouwbaar te identificeren verschillende subsets van zowel monocyten / macrofagen en T-cellen binnen de murine milt, beenmerg, lymfeklieren, en synoviale weefsel in een murine model van artrose (OA). Het huidige protocol kan eenvoudig worden gewijzigd om verschillende weefseltypen, of andere celtypen te onderzoeken door antilichamen uit te wisselen, en kan worden gebruikt voor alternatieve murinemodellen van OA. Bij het testen van andere weefseltypen is...

Artrose (OA) is een slopende en pijnlijke ziekte waarbij verschillende pathologieën van alle weefsels geassocieerd met het gewricht1. Het beïnvloeden van ongeveer 3,8% van de wereldbevolking2, OA is een van de meest voorkomende spier- en skeletaandoeningen en het is om de4e belangrijkste oorzaak van invaliditeit wereldwijd in 20203. Posttraumatische OA treedt op na een gewrichtsletsel en is goed voor ten minste 12% van alle OA en tot 25% van OA in gevoelige gewrichten zoals de knie4,5. Bovendien verhoogt gewrichtsletsel het levensrisico van OA met meer dan vijf keer6. Niet alle verwondingen met schijnbaar vergelijkbare instabiliteit zal gaan om OA te ontwikkelen, en dus het definiëren van factoren die rijden de lange termijn OA-risico blijft een uitdaging. Het is van cruciaal belang om effectieve behandelingen te ontwikkelen om posttraumatische OA te voorkomen en/of te behandelen, om de letselspecifieke pathologie, oorzaken en mechanismen die vatbaar zijn voor OA1te onderzoeken en beter te definiëren.
OA en de bepalende vernietiging van kraakbeen werden voorheen volledig toegeschreven aan mechanische stress en dus werd OA beschouwd als een niet-inflammatoire ziekte2. Recentere studies hebben echter een ontstekingsinfiltratie van synoviale membranen en een toename van ontstekingscellen in het synoviale weefsel bij patiënten met OA aangetoond in vergelijking met gezonde controles2, licht werpen op een ontstekingscomponent als een potentiële drijvende kracht in OA. Verdere studies wezen uit dat afwijkingen in zowel het CD4+ als cd8+ T-celprofiel en monocyten/macrofagen van het aangeboren immuunsysteem kunnen bijdragen tot de pathogenese van OA2,7. Gedetailleerde onderzoeken naar deze afwijkingen toonden relevante rollen aan voor verschillende T-celsubsets2, zoals1 8th2 ,Th2 9, Th178 en T regulatory (Treg) populaties10,11. Ondanks dit overtuigende bewijs is het oorzakelijk verband tussen de wijziging van T-celreacties en de ontwikkeling en progressie van OA nog onbekend2.
Naast specifieke T-cellen die een rol spelen in OA, suggereren recente studies dat gedifferentieerd/geactiveerde macrofagen geassocieerd kunnen worden met pathogenese van OA12. In het bijzonder accumuleren macrofagen afkomstig van bloedmonocyten in het synovium en polariseren in klassiek geactiveerde macrofagen (M1) of als alternatief geactiveerde macrofagen (M2) tijdens de OA-ontwikkeling, wat een correlatie impliceert tussen monocyt afgeleide macrofagen en OA13. In tegenstelling, sommige subsets van macrofagen bevolken organen vroeg tijdens de ontwikkeling en zelf-ondersteunen hun nummers in een monocyten onafhankelijke materie14. Onlangs werd een gewrichtsbeschermende functie getoond die werd bemiddeld door een strakke barrière voor deze synoviale weefsel-ingezetene macrofagen (STRMs)14. Deze bevindingen wijzen erop dat afwijkingen in met name subsets van macrofagen een cruciale rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van OA. De interacties tussen deze ontstekingscellulaire respons en de structurele veranderingen in het gewricht na trauma zijn echter onbekend.
Historisch gezien was de analyse van immuuncellen in het synoviale weefsel beperkt tot immunohistochemie (IHC) of mRNA-expressie door reverse-transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) benaderingen15,16. Zowel IHC als RT-PCR missen echter de mogelijkheid om meerdere verschillende celtypen en hun subsets tegelijkertijd te identificeren, waardoor de toepasbaarheid van deze methoden wordt beperkt. Bovendien is IHC beperkt tot analyse van kleine monsters van weefsel en kan focale ontstekingscelophopingen missen. In de afgelopen jaren zijn een groot aantal oppervlaktemarkers voor verschillende celtypen ontwikkeld, en subsets van immuuncellen kunnen nu betrouwbaar worden geïdentificeerd door verschillende combinaties van deze markers. Als gevolg van gestage technische vooruitgang, stroom cytometers zijn nu in staat het identificeren van een veelheid van verschillende fluorchromen tegelijkertijd waardoor de analyse van grote veelkleurige antilichaam panelen.
Flow cytometrie biedt onderzoekers een krachtige techniek die gelijktijdige identificatie en kwantificering van een veelheid van immuuncellen en hun subsets op het niveau van eencellige mogelijk maakt. We hebben zowel een extracellulaire kleurtest ontwikkeld en geoptimaliseerd om monocyten/macrofagen en hun subsets te identificeren, evenals een extra/intracellulaire kleuringstest om T-cellen en hun subsets te identificeren in murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synovial weefsel. Elke stap van dit protocol werd geoptimaliseerd en getest wat resulteert in een zeer reproduceerbare test die kan worden gebruikt voor andere chirurgische en niet-chirurgische OA muismodellen17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

Artrose (OA) is een van de meest voorkomende aandoeningen van het bewegingsapparaat, die patiënten die lijden aan pijn en lichamelijke beperkingen. Recent bewijs wijst op een potentiële ontstekingscomponent van de ziekte, met zowel T-cellen als monocyten/macrofagen die mogelijk geassocieerd kunnen worden met de pathogenese van OA. Verdere studies postuleerden een belangrijke rol voor subsets van beide inflammatoire cellijnen, zoals Th1, Th2, Th17 en T-regulerende lymfocyten, en M1, M2 en synovium-weefsel-resident macrofagen. De interactie tussen de lokale synoviale en systemische ontstekingscellulaire respons en de structurele veranderingen in het gewricht is echter onbekend. Om volledig te begrijpen hoe T-cellen en monocyten/macrofagen bijdragen aan OA, is het belangrijk om deze cellen en hun subsets gelijktijdig te kunnen identificeren in synoviale weefsel, secundaire lymfeorganen en systemisch (de milt en het beenmerg). Tegenwoordig kunnen de verschillende inflammatoire celsubsets worden geïdentificeerd door een combinatie van celoppervlaktemarkers die multi-color flow cytometrie maken tot een krachtige techniek bij het onderzoeken van deze cellulaire processen. In dit protocol beschrijven we gedetailleerde stappen met betrekking tot de oogst van synoviale weefsel en secundaire lymfeorganen en het genereren van eencellige suspensies. Verder presenteren we zowel een extracellulaire kleurtest om monocyten / macrofagen en hun subsets te identificeren, als een extra- en intracellulaire kleurtest om T-cellen en hun subsets te identificeren in de murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel. Elke stap van dit protocol werd geoptimaliseerd en getest, wat resulteert in een zeer reproduceerbare test die kan worden gebruikt voor andere chirurgische en niet-chirurgische OA-muismodellen.

Representatieve resultaten van zowel het subsetpaneel monocyte als het subsetpaneel van T-cel worden hieronder beschreven.
Figuur 1 illustreert de hiërarchische gatingstrategie voor het monocyten subset panel op immuuncellen verzameld uit beenmerg van DMM behandelde dieren. Dezelfde strategie werd gebruikt en geverifieerd in alle andere weefselsoorten. Bij het opzetten van het experiment werd voor elk weefseltype het Forward Scatter Area (FSC-A) en Side Scatter A...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Hier beschrijven we een gedetailleerd en reproduceerbaar stroomcytometrieprotocol om monocyten/macrofaag en T-celsubsets te identificeren met behulp van zowel extra- als intracellulaire kleuringstesten in de murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synovaal weefsel, gebruikmakend van een gevestigd chirurgisch model van murineartrose.

Flow Cytometrie Analyse van immune cell subsets binnen de Murine Milt, Beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel in een artrose model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Ons protocol maakt de gedetailleerde identificatie en analyse van monocyten en macrofagen en T-cellen en hun relevante subsets binnen de neuronen en ovium en diverse andere weefsels van het immuunsysteem mogelijk. Onze techniek vergemakkelijkt de betrouwbare oogst van leven immuuncellen uit het synovium en andere relevante weefsels voor een uitgebreide karakterisering van de osteoarthritische immuunrespons. Voor de isolatie van weefsels van belang van een artrose model muis, met de muis in een supine positie, veeg de borst, buik en benen met 70%ethanol.Gebruik een schaar om de huid voorzichtig te openen langs de middellijn van de buik terwijl de buikholte intact blijft. En trek voorzichtig de huid aan de rechterkant van het dier uit de buurt van de onderliggende spier, waardoor het onderhuidse vetweefsel aan de huid wordt bevestigd. Plaats de muis onder een dissecerende microscoop en gebruik twee gebogen fijne tangen om het vetweefsel dat zich aan de dij bevindt voorzichtig uit te plagen.Na het identificeren van de drie kruisvaten, gebruik fijne ontleden tangen om de inguinale lymfeklier gelegen op het kruispunt van de vaten te verwijderen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de capsule niet scheurt. Gebruik de tangen om het resterende vet van het oppervlak van de lymfeklier te verwijderen en de buikholte te openen. Als er geen resterend vet kan worden gezien, plaats de lymfeklier onmiddellijk in een eerder voorbereide en gelabelde zes goed plaat gevuld met 0,5 milliliter RPMI-media.Maak hierna de buikholte open. Gebruik fijne schaar om de milt weg te nemen en om de darmen voorzichtig te extraheren om de aorta en de splitsing ervan bloot te leggen. Plaats de milt hierna onmiddellijk in een eerder voorbereide en gelabelde zes goed gespeelde zes met 0,5 milliliter RPMI-media.Verwijder de iliacale lymfeklier gelegen op het terminale segment van de abdominale aorta en de oorsprong van de gemeenschappelijke iliacale slagader en verwijder de huid voorzichtig uit beide achterste ledematen. Plaats onmiddellijk de lymfeklier in een eerder voorbereide en gelabelde zes putplaat gebouwd met 0,5 milliliter RPMI-media die alle lymfeklieren van twee dieren bundelen. Met behulp van fijne schaar of een scalpel schoon het linker dijbeen van de bijgevoegde spierweefsel en zorgvuldig losgekoppeld zowel de verstikkende en het heupgewricht, waardoor het hele bot intact tijdens het verwijderen van het dijbeen.Vervolgens plaatste het dijbeen in een eerder voorbereide en gelabeld zes goed plaat gevuld met 0,5 milliliter RPMI media. Identificeer de patellapees van het rechter verstikkende gewricht en gebruik fijne schaar om het aangrenzende spierweefsel proximaal te verwijderen tot ongeveer vijf milliliter quadriceps pees proximale aan de knieschijf worden blootgesteld. Snijd door de quadriceps pees ongeveer drie tot vier millimeter proximale aan de knieschijf om een handvat te vormen en gebruik fijne tangen om voorzichtig trek de spanning uit de buurt van het gewricht om de randen van de gezamenlijke capsule bevestiging bloot te stellen.Beginnend met het dijbeen en bewegen in de richting van het scheenbeen, gebruik een scalpel om zorgvuldig te snijden langs de randen van de gezamenlijke capsule aan beide zijden met behoud van een zachte tractie op de quadriceps pees. Wanneer het synoviale weefselblok alleen aan het scheenbeen is bevestigd, moet het intraarticulaire vetkussen duidelijk zichtbaar zijn op de knieschijf en kan het voorzichtig worden losgemaakt van het gewrichts- en voorste aspect van de Minsky. Snijd vervolgens langs het resterende deel van de gezamenlijke capsule om het synoviale weefselblok te verwijderen en plaats het onmiddellijk in een eerder voorbereide en gelabelde zes putplaat gevuld met 1,5 milliliter RPMI-media.Wanneer alle weefsels zijn verzameld, plaats twee gepoolde milt per aandoening op een 70 micrometer cel zeef in een 15 milliliter buis en gebruik een steriele drie milliliter spuit plunger om zachtjes massa tarief van de weefsels door het mesh filter spoelen de zeef vaak met een totaal van zes milliliter RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS. Sediment de cellen door centrifugatie, en opnieuw op te schorten de pellet in vijf milliliter van rode bloedcel lysis puffer. Na vijf minuten stopt u de reactie met 10 milliliter PBS en centrifugeert u de cellen.Wanneer er geen rode bloedcellen meer worden waargenomen, opnieuw opschorten de pellet in een milliliter verse PBS voor het tellen. Voor lymfeklier verwerking plaats alle vier lymfeklieren op een 70 micrometer cel zeef in een nieuwe 15 milliliter buis en gebruik een nieuwe steriele drie milliliter zuiger om voorzichtig plagen de lymfeklieren door het net in een enkele cel suspensie, dan centrifugeren de cellen op 500 keer G gedurende vijf minuten, gooi de supernatant en opnieuw schorsen de pellet in 500 microliter pbs voor het tellen. Om het beenmerg te isoleren, gebruik een weefsel duim tang om zorgvuldig te grijpen het intacte dijbeen en gebruik scherpe schaar af te snijden het einde van het proximale dijbeen.Steek een 23-meter naald in het midden van de intercondylar inkeping van het dijbeen en draai de naald terwijl u zachte druk uitoefent om een gat in de inkeping te boren. Het veranderen van de naald indien nodig, spoel de inhoud van het bot met zes milliliter RPMI aangevuld met 10%FBS op een 70 micrometer cel zeef op een nieuwe 15 milliliter buis en gebruik een nieuwe drie milliliter spuit zuiger om voorzichtig druk het beenmerg door het gaas. Voer hierna de RBC-stap uit zoals aangetoond voor de milt.Wanneer er geen rode bloedcellen meer worden waargenomen, opnieuw opschorten de pellet in een milliliter verse PBS voor het tellen. Voor de verwerking van het synoviale weefsel gebruik fijne chirurgische schaar om dobbelstenen de twee synoviale weefsel blokken in kleine stukjes en breng de monsters in een nieuwe 15 milliliter buis. Spoel de opvangcontainer af met 500 microliter medium om de resterende cellen en synoviale weefsels te verzamelen en trek de was in de monsteropvangbuis.Voeg vervolgens een voldoende volume enzym toe om in een één eenheid per milliliter uiteindelijke concentratie te bereiken en verteer het synoviale weefselmonster bij 37 graden Celsius in een couveuse gedurende twee uur van een rotator. Zorg voor voldoende beweging bij het plaatsen van de buizen in de rotator. Aan het einde van de incubatie, stop de spijsvertering met acht milliliter RPMI aangevuld met 10%FBS en filter de cel suspensie door een 70 micrometer celzeef in een nieuwe 15 milliliter buis.Spoel de oude 15 milliliter buis met vijf milliliter medium en gebruik dit om het filter te wassen. Vervolgens, sediment de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in 500 microliters van PBS voor het tellen. Om levensvatbaarheid kleuring van de geïsoleerde immuuncellen uit te voeren, voeg vijf keer 10 aan de vijf cellen van elke cel suspensie aan de juiste putten van twee verschillende 96 goed U-bodem platen en het verzamelen van de cellen aan de onderkant van elke put.Altijd voldoende niet-gekleurde cellen van elk weefseltype als negatieve controles. Was cellen met 200 microliter PBS en schort de pellets opnieuw op in 100 microliter cel in permeant amine reactieve kleurstof per put gedurende een incubatie van 15 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatiewas de cellen twee keer in 200 microliters van FACS buffer per wasbeurt en opnieuw opschorten elke pellet in 100 microliters van de juiste antilichaam van belang of controle cocktail.Als zowel intra- als extracellulaire kleuring wordt uitgevoerd in dezelfde uitvoeren van de extracellulaire kleuring stap nu. Na 30 minuten incubatie bij vier graden Celsius beschermd tegen licht wassen de cellen twee keer met 200 microliter FACS buffer per goed en opnieuw op te schorten de cellen en de monocyten subset paneelplaat in 250 microliters van FACS buffer aangevuld met een millimolar EDTA. Voer deze stap alleen uit als er geen intracellulaire kleuring is gepland, ga anders verder naar het intracellulaire kleuringsaspect van het protocol.Breng vervolgens elk monocyt subsetmonster over in de desbetreffende overeenkomstige FACS-buis op ijs dat tegen licht is beschermd. Voor intercellulaire kleuring van de T-cel subset paneelcellen, opnieuw schorsen de pellets in 200 microliter van fixatie buffer van een passende fixatie en permeabilisatie kit voor een 40 minuten incubatie op vier graden Celsius beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatiewas de cellen twee keer met 200 microliters permeabilisatie wasbuffer en opnieuw opschorten de pellets in 100 microliters van de juiste antilichaam van belang of controle cocktail voor een 40 minuten incubatie bij vier graden Celsius beschermd tegen licht.Dan, was de cellen twee keer in 200 microliters van permeabilisatie wassen buffer per wasbeurt. En schort de cellen opnieuw op in 250 microliter facs plus EDTA-buffer voordat de monsters worden overgebracht naar de desbetreffende FACS-buizen op ijs dat tegen licht is beschermd. Hier kan de hiërarchische gatingstrategie voor het monocytenubsetpanel op immuuncellen die uit het beenmerg van DMM behandelde dieren zijn verzameld, worden waargenomen.Onbevlekte trollen kunnen worden gebruikt om de ware negatieven voor de dode levende vlek te bepalen en de poorten kunnen worden aangepast telkens wanneer het experiment wordt uitgevoerd als dat nodig is. In deze representatieve analyse werden immuuncellen geïsoleerd uit de synoviale weefsels en gekleurd met extracellulaire oppervlaktemarkers, zes weken na DMM of schijnbestrijdingsoperatie. Een hoger percentage van Ly-SC positieve MHC2 negatieve en M2 macrofagen worden waargenomen bij DMM behandelde dieren in vergelijking met de cel populaties waargenomen in schijnchirurgie muizen.Hier kan de hiërarchische gatingstrategie voor het extra en intracellulaire T-celpaneel op immuuncellen, geïsoleerd door de milt van met DMM behandelde dieren, worden waargenomen. Een hoger percentage TH1-cellen wordt waargenomen in de lymfeklieren en synoviale weefsels van DMM-dieren, evenals hogere aantallen T-regulerende cellen en TH17-cellen. Om de verwerving van monsters van hoge kwaliteit te garanderen, moeten de weefsels snel, nauwgezet en consistent worden geoogst.Zodra de immuuncellen zijn geïsoleerd, kan andere downstream-analyse worden uitgevoerd, zoals RTPCR, celcultuur en rust op bloed om een licht te schijnen op moleculaire processen van belang.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Hoge-frequentie Ultrasound Imaging van de muis cervicale lymfeklieren

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Beeldverwerking en flowcytometrie-gebaseerde analyse van de Cel standpunt en de celcyclus in 3D Melanoom Sferoïden

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolatie en Cellulaire fenotypering van mesenchymale stamcellen afkomstig van de gewrichtsvloeistof en beenmerg van minivarkens

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

Laparoscopische techniek voor seriële Verzameling van lever en mesenteriale lymfeklieren in makaken

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Database-geleide Flow-cytometry voor evaluatie van het beenmerg myeloïde cel rijping

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

De onderlichaam positieve druk loopband voor knie artrose revalidatie

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...