Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Nous tenons à remercier Andrew Lim, Ph.D. et Giles Best, Ph.D. pour leur aide dans la mise en place du cytomètre de flux. Ce projet a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) décernée à PH.

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee a approuvé toutes les procédures mentionnées dans ce protocole. Les souris sont logées et soignées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Pour toutes les expériences 10-12-semaine-vieux, mâle C57BL/6 souris ont été utilisées.
REMARQUE : Pour induire l’OA post-traumatique, la déstabilisation chirurgicale ...

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	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

Les méthodes décrites dans ce protocole ont été conçues et testées pour identifier de manière fiable divers sous-ensembles des monocytes/macrophages et des lymphocytes T dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques, et le tissu synovial dans un modèle murin de l’arthrose (OA). Le protocole actuel peut facilement être modifié pour étudier différents types de tissus, ou d’autres types de cellules en échangeant des anticorps, et peut être utilisé pour d’autres modèles muriniques d...

L’arthrose (OA) est une maladie débilitante et douloureuse impliquant diverses pathologies de tous les tissus associés à l’articulation1. Affectant environ 3,8% de la population mondiale2, l’arthrose est l’une des maladies musculo-squelettiques les plus répandues et elle deviendra la4ème cause d’invalidité dans le monde d’ici 20203. L’arthrose post-traumatique survient après une blessure articulaire et représente au moins 12 % de l’ensemble de l’arthrose et jusqu’à 25 % de l’arthrose dans les articulations sensibles comme le genou4,,5. En outre, les lésions articulaires augmentent le risque de OA à vie de plus de cinq fois6. Toutes les blessures ayant une instabilité apparemment similaire ne développeront pas d’arthrose, et par conséquent, il demeure difficile de définir les facteurs qui déterminent le risque d’arthrose à long terme. Il est crucial de mettre au point des traitements efficaces pour prévenir et/ou traiter l’arthrose post-traumatique, d’étudier et de mieux définir la pathologie, les causes et les mécanismes spécifiques aux blessures qui prédisposent à l’arthrose1.
L’arthrose et sa destruction du cartilage a été précédemment attribuée entièrement au stress mécanique et, par conséquent, l’arthrose a été considérée comme une maladie non inflammatoire2. Cependant, des études plus récentes ont montré une infiltration inflammatoire des membranes synoviales et une augmentation des cellules inflammatoires dans le tissu synovial dans les patients présentant l’OA comparé aux contrôles sains2,jetant la lumière sur un composant inflammatoire comme force motrice potentielle dans l’OA. D’autres études ont indiqué que des anomalies dans le profil de cellules T CD4+ et CD8+ ainsi que dans les monocytes/macrophages du système immunitaire inné peuvent contribuer à la pathogénie de l’OA2,7. Des études détaillées sur ces anomalies ont révélé des rôles pertinents pour divers sous-ensembles de lymphocytes T2, tels que Th18, Th29, Th178 et T régulateur (Treg) populations10,11. Malgré ces preuves convaincantes, la relation causale entre l’altération des réponses des lymphocytes T et le développement et la progression de l’arthrose est encore inconnue2.
En plus des lymphocytes T spécifiques ayant un rôle dans l’arthrose, des études récentes suggèrent que les macrophages polarisés/activés différentiellement peuvent être associés à la pathogénie de l’OA12. En particulier, les macrophages provenant des monocytes sanguins s’accumulent dans le synovium et se polarisent dans les macrophages à activation classique (M1) ou les macrophages activés alternativement (M2) pendant le développement de l’OA, ce qui implique une corrélation entre les macrophages dérivés des monocytes et l’OA13. En revanche, certains sous-ensembles de macrophages peuplent les organes tôt pendant le développement et soutiennent eux-mêmes leur nombre dans une matière indépendante monocyte14. Récemment, une fonction de protection commune médiée par une barrière à jonction serrée a été montrée pour ces macrophages synovial-tissu-résidents (STRMs)14. Ces résultats indiquent que des anomalies dans des sous-ensembles de macrophage particuliers peuvent jouer un rôle crucial pendant le développement de l’OA. Cependant, les interactions entre cette réponse cellulaire inflammatoire et les changements structurels dans l’articulation suivant le trauma sont inconnues.
Historiquement, l’analyse des cellules immunitaires dans le tissu synovial a été limitée à l’immunohistorichemisme (IHC) ou à l’expression de l’ARNm par réaction en chaîne de polymérase inverse-transcription (RT-PCR)approches 15,16. Cependant, l’IHC et le RT-PCR n’ont pas la capacité d’identifier plusieurs types de cellules différents et leurs sous-ensembles simultanément, limitant ainsi l’applicabilité de ces méthodes. En outre, iHC est limitée à l’analyse de petits échantillons de tissu et peut manquer des accumulations de cellules inflammatoires focales. Au cours des dernières années, une myriade de marqueurs de surface pour divers types de cellules ont été développés, et des sous-ensembles de cellules immunitaires peuvent maintenant être identifiés de manière fiable par des combinaisons distinctes de ces marqueurs. En raison de progrès techniques réguliers, les cytomètres de flux sont maintenant capables d’identifier une multitude de fluorochromes différents permettant simultanément l’analyse de grands panneaux d’anticorps multicolores.
La cytométrie de flux fournit aux chercheurs une technique puissante qui permet l’identification simultanée et la quantification d’une multitude de cellules immunitaires et de leurs sous-ensembles au niveau des cellules uniques. Nous avons développé et optimisé à la fois un test de coloration extracellulaire pour identifier les monocytes/macrophages et leurs sous-ensembles ainsi qu’un test de coloration extra/intracellulaire pour identifier les lymphocytes T et leurs sous-ensembles dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial. Chaque étape de ce protocole a été optimisée et testée, ce qui a donné lieu à un test hautement reproductible qui peut être utilisé pour d’autres modèles chirurgicaux et non chirurgicaux de souris OA17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

L’arthrose est l’une des maladies musculo-squelettiques les plus répandues, affectant les patients souffrant de douleur et de limitations physiques. Des preuves récentes indiquent un composant inflammatoire potentiel de la maladie, avec les cellules T et les monocytes/macrophages potentiellement associés à la pathogénie de l’OA. D’autres études ont postulé un rôle important pour des sous-ensembles des deux lignées cellulaires inflammatoires, telles que Th1, Th2, Th17, et lymphocytes T-régulateurs, et M1, M2, et synovium-tissu-résidents macrophages. Cependant, l’interaction entre la réponse cellulaire inflammatoire synoviale et systémique locale et les changements structurels dans l’articulation est inconnue. Pour bien comprendre comment les lymphocytes T et les monocytes/macrophages contribuent à l’arthrose, il est important de pouvoir identifier ces cellules et leurs sous-ensembles simultanément dans les tissus synoviaux, les organes lymphatiques secondaires et systémiquement (la rate et la moelle osseuse). De nos jours, les différents sous-ensembles de cellules inflammatoires peuvent être identifiés par une combinaison de marqueurs de surface cellulaire faisant de la cytométrie de flux multicolore une technique puissante dans l’étude de ces processus cellulaires. Dans ce protocole, nous décrivons des étapes détaillées concernant la récolte du tissu synovial et des organes lymphatiques secondaires ainsi que la génération de suspensions unicellulaires. En outre, nous présentons à la fois un test de coloration extracellulaire pour identifier les monocytes/macrophages et leurs sous-ensembles aussi bien qu’un test de coloration extra- et intra-cellulaire pour identifier les lymphocytes T et leurs sous-ensembles dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial. Chaque étape de ce protocole a été optimisée et testée, ce qui a donné lieu à un test hautement reproductible qui peut être utilisé pour d’autres modèles chirurgicaux et non chirurgicaux de souris OA.

Les résultats représentatifs du panneau de sous-ensemble de monocytes et du panneau de sous-ensemble de cellules T sont décrits ci-dessous.
La figure 1 illustre la stratégie hiérarchique de gating pour le panneau de sous-ensemble de monocytes sur les cellules immunitaires recueillies à partir de la moelle osseuse des animaux traités par DMM. La même stratégie a été utilisée et vérifiée dans tous les autres types de tissus. Lors de la mise en place de...

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Ici, nous décrivons un protocole détaillé et reproductible de cytométrie de flux pour identifier les sous-ensembles monocytes/macrophage et t-cell utilisant des essais de coloration extra- et intracellulaire dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial, utilisant un modèle chirurgical établi de l’arthrose murine.

Analyse de cytométrie de flux des sous-ensembles de cellules immunitaires dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial dans un modèle d’arthrose

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Notre protocole permet l’identification et l’analyse détaillées des monocytes et macrophages et des lymphocytes T et de leurs sous-ensembles pertinents dans les neurones et l’ovium et divers autres tissus du système immunitaire. Notre technique facilite la récolte fiable des cellules immunitaires de la vie à partir du synovium et d’autres tissus pertinents pour une caractérisation complète de la réponse immunitaire arthrose. Pour l’isolement des tissus d’intérêt d’une souris modèle d’arthrose, avec la souris dans une position supine, essuyer la poitrine, l’abdomen et les jambes avec 70% d’éthanol.Utilisez des ciseaux pour ouvrir soigneusement la peau le long de la ligne médiane de l’abdomen tout en laissant la cavité abdominale intacte. Et tirez doucement la peau sur le côté droit de l’animal loin du muscle sous-jacent, laissant le tissu adipeux sous-cutané attaché à la peau. Placez la souris sous un microscope disséquant et utilisez deux forceps fins incurvés pour taquiner doucement le tissu adipeux situé à la cuisse.Après avoir identifié les trois vaisseaux croisés, utilisez de fines forceps disséquants pour enlever le ganglion lymphatique inguinal situé à l’intersection des vaisseaux, en prenant soin de ne pas rompre la capsule. Utilisez les forceps pour enlever le reste de la graisse de la surface du ganglion lymphatique et ouvrir la cavité abdominale. Si aucune graisse restante ne peut être vue, placez immédiatement le ganglion lymphatique dans une plaque de six puits préalablement préparée et étiquetée remplie de 0,5 millilitres de média RPMI.Par la suite, ouvrez la cavité abdominale. Utilisez des ciseaux fins pour exciser la rate et extraire doucement les intestins pour exposer l’aorte et sa bifurcation. Par la suite, placez la rate immédiatement dans un six précédemment préparé et étiqueté rempli de 0,5 millilitres de médias RPMI.Enlever le ganglion lymphatique iliaque situé au segment terminal de l’aorte abdominale et l’origine de l’artère iliaque commune et retirer soigneusement la peau des deux membres postérieurs. Placez immédiatement le ganglion lymphatique dans une construction de six plaques de puits préparées et étiquetées précédemment avec 0,5 millilitres de média RPMI mettant en commun tous les ganglions lymphatiques de deux animaux. À l’aide de ciseaux fins ou d’un scalpel nettoyer le fémur gauche du tissu musculaire attaché et soigneusement déconnecté à la fois l’étouffement et l’articulation de la hanche, laissant l’os entier intact tout en enlevant le fémur.Puis placé le fémur dans une plaque de six puits préalablement préparé et étiqueté rempli de 0,5 millilitres de médias RPMI. Identifier le tendon rotulien de l’articulation droite étouffer et utiliser des ciseaux fins pour enlever le tissu musculaire adjacent proximal à l’articulation jusqu’à environ cinq millilitres de tendon quadriceps proximal à la rotule sont exposés. Couper à travers le tendon quadriceps environ trois à quatre millimètres proximal à la rotule pour former une poignée et utiliser des forceps fins pour tirer doucement la tension loin de l’articulation pour exposer les bords de la fixation de la capsule articulaire.En commençant par le fémur et en se déplaçant vers le tibia, utilisez un scalpel pour couper soigneusement le long des bords de la capsule articulaire des deux côtés tout en maintenant une traction douce sur le tendon du quadriceps. Lorsque le bloc de tissu synovial n’est fixé qu’au tibia, la garniture de graisse intraarticulaire doit être clairement visible distal à la rotule et peut être doucement détachée de l’aspect articulaire et antérieur du Minsky. Ensuite, coupez le long de la partie restante de la capsule articulaire pour enlever le bloc de tissu synovial et placez-le immédiatement dans une plaque de six puits préalablement préparée et étiquetée remplie de 1,5 millilitres de rpmi media.Lorsque tous les tissus ont été recueillis, placez deux rates en commun par condition sur une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube de 15 millilitres et utilisez un piston stérile de seringue de trois millilitres pour évaluer doucement les tissus à travers le filtre à mailles rinçant fréquemment la passoire avec un total de six millilitres de RPMI 1640 moyen complété par 10% FBS. Sédimenter les cellules par centrifugation, et re-suspendre la pastille en cinq millilitres de puffer de lyse globule rouge. Après cinq minutes, arrêter la réaction avec 10 millilitres de PBS et centrifuger les cellules.Lorsqu’on n’observe plus de globules rouges, suspendez la pastille en un millilitre de PBS frais pour le comptage. Pour le traitement des ganglions lymphatiques placer les quatre ganglions lymphatiques sur une passoire à cellules de 70 micromètres dans un nouveau tube de 15 millilitres et utiliser un nouveau piston stérile de trois millilitres pour taquiner doucement les ganglions lymphatiques à travers le maillage dans une suspension à cellule unique, puis centrifuger les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes, jeter le supernatant et re-suspendre la pastille dans 500 microlitres de PBS pour le comptage. Pour isoler la moelle osseuse, utilisez un pouce en tissu forceps pour saisir soigneusement le fémur intact et utiliser des ciseaux pointus pour couper l’extrémité même du fémur proximal.Insérez une aiguille de calibre 23 au milieu de l’encoche intercondylle du fémur et faites pivoter l’aiguille tout en appliquant une pression douce pour percer un trou dans l’encoche. En changeant l’aiguille au besoin, rincer le contenu osseux avec six millilitres de RPMI complété par 10% FBS sur une passoire à cellules de 70 micromètres sur un nouveau tube de 15 millilitres et utiliser un nouveau piston à seringues de trois millilitres pour appuyer doucement sur la moelle osseuse à travers le maillage. Par la suite, effectuez l’étape RBC comme démontré pour la rate.Lorsqu’on n’observe plus de globules rouges, suspendez la pastille en un millilitre de PBS frais pour le comptage. Pour le traitement du tissu synovial utiliser de fines ciseaux chirurgicaux pour couper les deux blocs de tissu synovial en petits morceaux et transférer les échantillons dans un nouveau tube de 15 millilitres. Rincer le récipient de collecte avec 500 microlitres de milieu pour recueillir les cellules restantes et les tissus synoviaux et tirer le lavage dans le tube de collecte de l’échantillon.Ensuite, ajoutez un volume suffisant d’enzymes à atteindre dans une unité par concentration finale millilitre et digérer l’échantillon de tissu synovial à 37 degrés Celsius dans un incubateur pendant deux heures d’un rotateur. Assurer un mouvement suffisant lorsque vous placez les tubes dans le rotateur. À la fin de l’incubation, arrêter la digestion avec huit millilitres de RPMI complété par 10%FBS et filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un nouveau tube de 15 millilitres.Rincez l’ancien tube de 15 millilitres avec cinq millilitres de milieu et utilisez-le pour laver le filtre. Ensuite, sédimenter les cellules par centrifugation et réutiliser la pastille dans 500 microlitres de PBS pour le comptage. Pour effectuer la coloration de viabilité des cellules immunitaires isolées, ajouter cinq fois 10 aux cinq cellules de chaque suspension cellulaire aux puits appropriés de deux différentes plaques de 96 puits U-fond et de recueillir les cellules au fond de chaque puits.Incluez toujours suffisamment de cellules non tachées de chaque type de tissu comme témoins négatifs. Laver les cellules avec 200 microlitres de PBS et re-suspendre les granulés dans 100 microlitres de cellules dans le colorant réactif à l’amine perméante par puits pendant une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius protégés de la lumière. À la fin de l’incubation laver les cellules deux fois dans 200 microlitres de tampon FACS par lavage et re-suspendre chaque granulé dans 100 microlitres de l’anticorps approprié d’intérêt ou de contrôle cocktail.Si la coloration intra et extracellulaire est effectuée dans le même effectuer l’étape de coloration extracellulaire maintenant. Après 30 minutes d’incubation à quatre degrés Celsius protégés de la lumière laver les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon FACS par puits et de suspendre à nouveau les cellules et la plaque de panneau sous-ensemble monocyte dans 250 microlitres de tampon FACS complété par un millimolaire EDTA. Effectuez cette étape seulement si aucune coloration intracellulaire n’est prévue, passez autrement à l’aspect de coloration intracellulaire du protocole.Ensuite, transférez chaque échantillon de sous-ensemble de monocytes dans le tube FACS correspondant approprié sur la glace protégée de la lumière. Pour la coloration intercellulaire des cellules du panneau de sous-ensemble des cellules T, suspendez à nouveau les granulés dans 200 microlitres de tampon de fixation à partir d’une trousse appropriée de fixation et de perméabilisation pour une incubation de 40 minutes à quatre degrés Celsius protégée de la lumière. À la fin de l’incubation laver les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage de perméabilisation et de suspendre à nouveau les granulés dans 100 microlitres de l’anticorps approprié d’intérêt ou cocktail de contrôle pour une incubation de 40 minutes à quatre degrés Celsius protégé de la lumière.Ensuite, lavez les cellules deux fois en 200 microlitres de tampon de lavage de permeabilisation par lavage. Et re-suspendre les cellules dans 250 microlitres de FACS plus tampon EDTA avant de transférer les échantillons dans les tubes FACS correspondants appropriés sur la glace protégée de la lumière. Ici, la stratégie hiérarchique de gating pour le panneau de sous-ensemble de monocyte sur des cellules immunisées rassemblées à partir de la moelle des animaux traités de DMM peut être observée.Les trolls non tachés peuvent être utilisés pour déterminer les vrais négatifs pour la tache vivante morte et les portes peuvent être ajustées chaque fois que l’expérience est menée au besoin. Dans cette analyse représentative, les cellules immunitaires ont été isolées des tissus synovial et tachées avec des marqueurs extracellulaires de surface, six semaines après la chirurgie de contrôle de DMM ou de feinte. Un pourcentage plus élevé de macrophages MHC2 positifs Ly-SC et M2 sont observés chez les animaux traités par DMM par rapport aux populations cellulaires observées chez les souris de chirurgie simulée.Ici, la stratégie hiérarchique de gating pour le panneau extra et intracellulaire de T-cellule sur des cellules immunisées isolées de la rate des animaux traités de DMM peut être observée. Un pourcentage plus élevé de cellules TH1 sont observées dans les ganglions lymphatiques et les tissus synoviaux des animaux atteints de DMM, ainsi qu’un plus grand nombre de lymphocytes T et de cellules TH17. Pour assurer l’acquisition d’échantillons de haute qualité, les tissus doivent être récoltés d’une manière rapide, méticuleuse et cohérente.Une fois que les cellules immunitaires ont été isolées, d’autres analyses en aval peuvent être menées telles que le RTPCR, la culture cellulaire et se reposer sur le sang pour éclairer les processus moléculaires d’intérêt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Utilisation quantitative PCR en temps réel pour déterminer prise de greffe de donneurs de cellules dans un modèle murin concurrentiel greffe de moelle osseuse

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Recherche

Médecine

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

A Tissue Culture Modèle tridimensionnel pour étudier primaire moelle osseuse humaine et de ses affections malignes

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Haute fréquence imagerie par ultrasons de souris cervicales ganglions lymphatiques

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

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Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Caractérisation des cellules immunitaires dans les tissus adipeux humains à l’aide de cytométrie en flux

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The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

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Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...