Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Wir danken Andrew Lim, Ph.D. und Giles Best, Ph.D. für ihre Hilfe beim Aufbau des Durchflusszytometers. Unterstützt wurde das Projekt von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) an die PH.

Die Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee hat alle in diesem Protokoll genannten Verfahren genehmigt. Mäuse werden gemäß dem Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010) untergebracht und gepflegt. Für alle Experimente wurden 10-12 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse eingesetzt.
HINWEIS: Um posttraumatische OA zu induzieren, wurde eine chirurgische Destabilisierung des me...

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	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden entwickelt und getestet, um verschiedene Teilmengen sowohl aus Monozyten/Makrophagen als auch aus T-Zellen innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes in einem murinen Modell der Arthrose (OA) zuverlässig zu identifizieren. Das aktuelle Protokoll kann leicht geändert werden, um verschiedene Gewebetypen oder andere Zelltypen durch Austausch von Antikörpern zu untersuchen, und kann für alternative murine Modelle von OA verwe...

Osteoarthritis (OA) ist eine schwächende und schmerzhafte Krankheit mit verschiedenen Pathologien aller Gewebe, die mit dem Gelenk1verbunden sind. OA betrifft etwa 3,8 % der Weltbevölkerung2, OA ist eine der am weitesten verbreiteten Muskel-Skelett-Erkrankungen und es soll die4. führende Ursache von Behinderungen weltweit bis 20203werden. Posttraumatische OA tritt nach einer Gelenkverletzung auf und macht mindestens 12% aller OA und bis zu 25% der OA in anfälligen Gelenken wie dem Knie4,5aus. Darüber hinaus erhöht Gelenkverletzung das Lebenslange Risiko von OA um mehr als das Fünffachevon 6. Nicht alle Verletzungen mit scheinbar ähnlicher Instabilität werden OA entwickeln, und daher bleiben die Definition von Faktoren, die das langfristige OA-Risiko antreiben, herausfordernd. Es ist von entscheidender Bedeutung, um wirksame Behandlungen zu entwickeln, um posttraumatische OA zu verhindern und/oder zu behandeln, die verletzungsspezifische Pathologie, Ursachen und Mechanismen zu untersuchen und besser zu definieren, die OA1prädisponieren.
OA und seine definierende Knorpelzerstörung wurde früher vollständig auf mechanische Beanspruchung zurückgeführt und oA wurde daher als nicht-entzündliche Erkrankung angesehen2. Jedoch, neuere Studien haben gezeigt, eine entzündliche Infiltration von Synovialmembranen und eine Zunahme der entzündlichen Zellen im Synovialgewebe bei Patienten mit OA im Vergleich zu gesunden Kontrollen2, Licht auf eine entzündliche Komponente als potenzielle treibende Kraft in OA. Weitere Studien zeigten, dass Anomalien sowohl im CD4+ als auch im CD8+ T-Zell-Profil sowie Monozyten/Makrophagen des angeborenen Immunsystems zur Pathogenese von OA2,7beitragen können. Detaillierte Untersuchungen dieser Anomalien ergaben relevante Rollen für verschiedene T-Zell-Teilmengen2, wie Th18, Th29, Th178 und T regulatorische (Treg) Populationen10,11. Trotz dieser überzeugenden Beweise ist der kausale Zusammenhang zwischen der Veränderung der T-Zell-Antworten und der Entwicklung und Progression von OA noch unbekannt2.
Zusätzlich zu bestimmten T-Zellen, die eine Rolle in OA spielen, deuten neuere Studien darauf hin, dass differenziell polarisierte/aktivierte Makrophagen mit der Pathogenese von OA12in Verbindung gebracht werden können. Insbesondere akkumulieren Makrophagen aus Blutmonozyten im Synovium und polarisieren entweder in klassisch aktivierte Makrophagen (M1) oder alternativ aktivierte Makrophagen (M2) während der OA-Entwicklung, was eine Korrelation zwischen monozytenabgeleiteten Makrophagen und OA13impliziert. Im Gegensatz dazu bevölkern bestimmte Teilmengen von Makrophagen Organe früh während der Entwicklung und unterstützen ihre Zahl in einer monozytenunabhängigen Materie14. Kürzlich wurde eine gemeinsame Schutzfunktion gezeigt, die durch eine enge Kreuzungsbarriere vermittelt wurde, für diese synovial-geweberesidenten Makrophagen (STRMs)14. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Anomalien in bestimmten Makrophagen-Teilmengen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von OA spielen können. Die Wechselwirkungen zwischen dieser entzündlichen zellulären Reaktion und den strukturellen Veränderungen im Gelenk nach dem Trauma sind jedoch unbekannt.
Historisch gesehen beschränkte sich die Analyse von Immunzellen im Synovialgewebe auf die Immunhistochemie (IHC) oder mRNA-Expression durch Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Ansätze15,16. Sowohl IHC als auch RT-PCR sind jedoch nicht in der Lage, mehrere verschiedene Zelltypen und deren Teilmengen gleichzeitig zu identifizieren, wodurch die Anwendbarkeit dieser Methoden eingeschränkt wird. Darüber hinaus beschränkt sich IHC auf die Analyse von kleinen Gewebeproben und kann fokale entzündliche Zellansammlungen verpassen. In den letzten Jahren wurden unzählige Oberflächenmarker für verschiedene Zelltypen entwickelt, und Untermengen von Immunzellen können nun durch unterschiedliche Kombinationen dieser Marker zuverlässig identifiziert werden. Aufgrund des stetigen technischen Fortschritts sind Durchflusszytometer nun in der Lage, eine Vielzahl verschiedener Fluorchrome gleichzeitig zu identifizieren, was die Analyse großer mehrfarbiger Antikörperplatten ermöglicht.
Die Durchflusszytometrie bietet den Forschern eine leistungsstarke Technik, die die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung einer Vielzahl von Immunzellen und deren Teilmengen auf Einzelzellebene ermöglicht. Wir haben sowohl einen extrazellulären Färbetest zur Identifizierung von Monozyten/Makrophagen und deren Teilmengen als auch einen extra-intrazellulären Färbetest entwickelt und optimiert, um T-Zellen und ihre Untergruppen in muriner Milz, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe zu identifizieren. Jeder Schritt dieses Protokolls wurde optimiert und getestet, was zu einem hochreproduzierbaren Assay führte, der für andere chirurgische und nicht-chirurgische OA-Mausmodelle17verwendet werden kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

Osteoarthritis (OA) ist eine der häufigsten Muskel-Skelett-Erkrankungen, die Patienten mit Schmerzen und körperlichen Einschränkungen betrifft. Jüngste Erkenntnisse deuten auf eine mögliche entzündliche Komponente der Krankheit hin, wobei sowohl T-Zellen als auch Monozyten/Makrophagen potenziell mit der Pathogenese von OA in Verbindung gebracht werden können. Weitere Studien postulierten eine wichtige Rolle für Teilmengen der beiden entzündlichen Zelllinien, wie Th1, Th2, Th17 und T-regulatorische Lymphozyten, und M1, M2, und Synovium-Gewebe-residenten Makrophagen. Die Wechselwirkung zwischen der lokalen synovialen und systemischen entzündlichen zellulären Reaktion und den strukturellen Veränderungen im Gelenk ist jedoch unbekannt. Um vollständig zu verstehen, wie T-Zellen und Monozyten/Makrophagen zu OA beitragen, ist es wichtig, diese Zellen und ihre Teilmengen gleichzeitig in Synovialgewebe, sekundären Lymphorganen und systemisch (Milz und Knochenmark) quantitativ identifizieren zu können. Heutzutage können die verschiedenen entzündlichen Zelluntermengen durch eine Kombination von Zell-Oberflächen-Markern identifiziert werden, was die mehrfarbige Durchflusszytometrie zu einer leistungsstarken Technik bei der Untersuchung dieser zellulären Prozesse macht. In diesem Protokoll beschreiben wir detaillierte Schritte zur Gewinnung von Synovialgewebe und sekundären lymphatischen Organen sowie zur Erzeugung von einzelzelligen Suspensionen. Darüber hinaus präsentieren wir sowohl einen extrazellulären Färbetest zur Identifizierung von Monozyten/Makrophagen und deren Teilmengen als auch einen extra- und intrazellulären Färbetest zur Identifizierung von T-Zellen und deren Teilmengen innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovials. Jeder Schritt dieses Protokolls wurde optimiert und getestet, was zu einem hochreproduzierbaren Assay führte, der für andere chirurgische und nicht-chirurgische OA-Mausmodelle verwendet werden kann.

Repräsentative Ergebnisse sowohl aus dem Monozyten-Teilmengenbereich als auch aus dem T-Zell-Teilmengenbereich werden unten beschrieben.
Abbildung 1 zeigt die hierarchische Gating-Strategie für das Monozyten-Untersatzpanel auf Immunzellen, die aus Knochenmark von DMM-behandelten Tieren gewonnen wurden. Die gleiche Strategie wurde in allen anderen Gewebetypen verwendet und verifiziert. Beim Einrichten des Experiments wurde für jeden Gewebetyp die Spannung des Vo...

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Hier beschreiben wir ein detailliertes und reproduzierbares Flusszytometrieprotokoll zur Identifizierung von Monozyten-Makrophagen- und T-Zell-Subsets mit extra- und intrazellulären Färbetests innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes unter Verwendung eines etablierten chirurgischen Modells der murinen Arthrose.

Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Unser Protokoll ermöglicht die detaillierte Identifizierung und Analyse von Monozyten und Makrophagen und T-Zellen und deren relevanten Teilmengen innerhalb der Neuronen und Eizellen und verschiedener anderer Gewebe des Immunsystems. Unsere Technik erleichtert die zuverlässige Entnahme von Lebensimmunzellen aus dem Synovium und anderen relevanten Geweben für eine umfassende Charakterisierung der osteoarthritischen Immunantwort. Für die Isolierung von Geweben von Interesse von einer Arthrose Modell Maus, mit der Maus in einer Supine-Position, wischen Sie die Brust, Bauch und Beine mit 70%Ethanol.Verwenden Sie eine Schere, um die Haut entlang der Mittellinie des Bauches vorsichtig zu öffnen, während die Bauchhöhle intakt bleibt. Und ziehen Sie die Haut auf der rechten Seite des Tieres sanft vom darunter liegenden Muskel weg, so dass das subkutane Fettgewebe an der Haut befestigt bleibt. Legen Sie die Maus unter ein sezierendes Mikroskop und verwenden Sie zwei gekrümmte feine Zangen, um das Fettgewebe am Oberschenkel sanft herauszukitzeln.Nach der Identifizierung der drei Kreuzgefäße, verwenden Sie feine Sezieren Zangen, um die Leistenlymphknoten am Schnittpunkt der Gefäße zu entfernen, achten Darauf, nicht die Kapsel zu brechen. Verwenden Sie die Zange, um das restliche Fett von der Oberfläche des Lymphknotens zu entfernen und die Bauchhöhle zu öffnen. Wenn kein restliches Fett zu sehen ist, legen Sie den Lymphknoten sofort in eine zuvor vorbereitete und mit 0,5 Milliliter RPMI-Medien gefüllte welle Platte.Öffnen Sie danach die Bauchhöhle. Verwenden Sie eine feine Schere, um die Milz zu verbrauchen und den Darm sanft zu extrahieren, um die Aorta und ihre Bifurkation zu belichten. Danach legen Sie die Milz sofort in eine zuvor vorbereitete und beschriftete sechs gut gespielte gefüllte mit 0,5 Milliliter RPMI-Medien gefüllt.Entfernen Sie den iliac Lymphknoten am Terminalsegment der Bauchaorta und den Ursprung der gemeinsamen Iliasarterie und entfernen Sie vorsichtig die Haut von beiden Hinterbeinen. Legen Sie den Lymphknoten sofort in einen zuvor vorbereiteten und beschrifteten sechs Brunnenplattenbau mit 0,5 Millilitern RPMI-Medien, die alle Lymphknoten von zwei Tieren bündeln. Mit einer feinen Schere oder einem Skalpell reinigen Sie den linken Oberschenkelknochen des angehängten Muskelgewebes und trennen sorgfältig sowohl das Ersticken als auch das Hüftgelenk, so dass der gesamte Knochen intakt bleibt, während der Oberschenkelknochen entfernt wird.Legen Sie dann den Oberschenkelknochen in eine zuvor vorbereitete und beschriftete sechs Wellplatte gefüllt mit 0,5 Milliliter RPMI-Medien. Identifizieren Sie die Patellasehne des rechten Stützgelenks und verwenden Sie eine feine Schere, um das angrenzende Muskelgewebe proximal bis gelenkzustoßen, bis etwa fünf Milliliter Quadrizepssehne proximal zur Patella ausgesetzt sind. Schneiden Sie durch die Quadrizepssehne etwa drei bis vier Millimeter proximal zur Patella, um einen Griff zu bilden und verwenden Sie feine Zangen, um die Spannung sanft vom Gelenk wegzuziehen, um die Ränder der Gelenkkapselbefestigung freizulegen.Beginnend mit dem Oberschenkelknochen und in Richtung der Tibia, verwenden Sie ein Skalpell vorsichtig entlang der Ränder der Gelenkkapsel auf beiden Seiten schneiden, während eine sanfte Traktion auf der Quadrizepssehne. Wenn der Synovialgewebeblock nur an der Tibia befestigt ist, sollte das intraartikuläre Fettpolster deutlich distal gegenüber der Patella sichtbar sein und kann sanft vom Gelenk und vorderen Aspekt des Minsky gelöst werden. Dann schneiden Sie entlang des verbleibenden Teils der Gelenkkapsel, um den Synovialgewebeblock zu entfernen und legen Sie ihn sofort in eine zuvor vorbereitete und beschriftete sechs Well-Platte mit 1,5 Milliliter rpMI-Medien gefüllt.Wenn alle Gewebe gesammelt sind, legen Sie zwei gepoolte Milz pro Bedingung auf ein 70-Mikrometer-Zellsieb in einem 15-Milliliter-Rohr und verwenden Sie einen sterilen Drei-Milliliter-Spritzenkolben, um das Gewebe vorsichtig durch den Netzfilter zu massieren und das Sieb häufig mit insgesamt sechs Millilitern RPMI 1640 Medium summieren, ergänzt mit 10%FBS. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in fünf Millilitern roter Blutkörperchen Lyse Kugelfisch. Nach fünf Minuten, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliter PBS und Zentrifugieren der Zellen.Wenn keine roten Blutkörperchen mehr beobachtet werden, setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischer PBS zum Zählen wieder aus. Legen Sie für die Lymphknotenverarbeitung alle vier Lymphknoten auf ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein neues 15-Milliliter-Rohr und verwenden Sie einen neuen sterilen Drei-Milliliter-Kolben, um die Lymphknoten vorsichtig durch das Netz in eine Einzelzellsuspension zu necken, dann zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500-fachem G, entsorgen Sie das Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter PBS für die Zählung wieder auf. Um das Knochenmark zu isolieren, verwenden Sie eine Gewebe-Daumenzange, um den intakten Oberschenkelknochen sorgfältig zu greifen und verwenden Sie scharfe Schere, um das Ende des proximalen Oberschenkelknochens abzuschneiden.Setzen Sie eine 23-Spur-Nadel in die Mitte der interkondylar Kerbe des Oberschenkelknochens und drehen Sie die Nadel, während Sie sanften Druck ausüben, um ein Loch in die Kerbe zu bohren. Wechseln Sie die Nadel nach Bedarf, spülen Sie den Knocheninhalt mit sechs Millilitern RPMI, ergänzt mit 10%FBS, auf ein 70-Mikrometer-Zellsieb auf einem neuen 15-Milliliter-Rohr und verwenden Sie einen neuen Drei-Milliliter-Spritzenkolben, um das Knochenmark vorsichtig durch das Netz zu drücken. Führen Sie im Folgenden den RBC-Schritt aus, wie für die Milz demonstriert.Wenn keine roten Blutkörperchen mehr beobachtet werden, setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischer PBS zum Zählen wieder aus. Für die Verarbeitung des Synovials verwenden Sie eine feine chirurgische Schere, um die beiden Synovialgewebeblöcke in winzige Stücke zu würfeln und die Proben in ein neues 15-Milliliter-Rohr zu übertragen. Spülen Sie den Sammelbehälter mit 500 Mikrolitern Medium, um alle verbleibenden Zellen und Synovialgewebe zu sammeln und ziehen Sie die Wäsche in das Probenentnahmeröhrchen.Als nächstes fügen Sie ein ausreichendes Volumen des Enzyms hinzu, um in einer Einheit pro Milliliter Endkonzentration zu erreichen und die Synovialgewebeprobe bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator für zwei Stunden eines Rotators zu verdauen. Achten Sie beim Einlegen der Rohre in den Rotator auf ausreichende Bewegung. Am Ende der Inkubation stoppen Sie die Verdauung mit acht Millilitern RPMI, ergänzt mit 10%FBS, und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein neues 15-Milliliter-Rohr.Spülen Sie das alte 15-Milliliter-Rohr mit fünf Millilitern Medium und verwenden Sie diese, um den Filter zu waschen. Dann sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter PBS zum Zählen wieder auf. Um die Lebensfähigkeit der isolierten Immunzellen zu färben, fügen Sie fünfmal 10 zu den fünf Zellen jeder Zellsuspension zu den entsprechenden Brunnen von zwei verschiedenen 96 Well U-Bodenplatten hinzu und sammeln die Zellen an der Unterseite jedes Brunnens.Fügen Sie immer genügend ungefärbte Zellen jedes Gewebetyps als Negative Kontrollen ein. Waschen Sie Zellen mit 200 Mikroliter PBS und setzen Sie die Pellets in 100 Mikroliter Zelle in permeant Amin-reaktiven Farbstoff pro Brunnen für eine 15-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt wieder auf. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal in 200 Mikroliter FACS Puffer pro Waschmittel und setzen Sie jedes Pellet in 100 Mikroliter des entsprechenden Anti-Bio-Antikörpers oder Kontrollcocktails wieder auf.Wenn sowohl intra- als auch extrazelluläre Färbung in der gleichen durchgeführt wird, führen Sie jetzt den extrazellulären Färbungsschritt durch. Nach 30 Minuten Inkubation bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt waschen die Zellen zweimal mit 200 Mikroliter FACS Puffer pro Brunnen und setzen die Zellen und die Monozyten-Teilmengenplatte in 250 Mikroliter FACS-Puffer, ergänzt mit einem Millimolar EDTA, wieder auf. Führen Sie diesen Schritt nur, wenn keine intrazelluläre Färbung geplant ist, andernfalls gehen Sie zum intrazellulären Färbungsaspekt des Protokolls über.Übertragen Sie dann jede Monozyten-Teilmenge in die entsprechende entsprechende FACS-Röhre auf eisgeschütztem Eis. Zur interzellulären Färbung der T-Zell-Teilmengenzellen die Pellets in 200 Mikroliter Fixationspuffer aus einem geeigneten Fixierungs- und Permeabilisierungskit für eine 40-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius, die vor Licht geschützt sind, wieder aufzuhängen. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikroliter Permeabilisation Waschpuffer und setzen Sie die Pellets in 100 Mikroliter des entsprechenden Antikörpers von Interesse oder Kontrollcocktail für eine 40-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt.Dann waschen Sie die Zellen zweimal in 200 Mikroliter Permeabilisation Waschpuffer pro Wäsche. Und die Zellen in 250 Mikroliter FACS plus EDTA-Puffer wieder aussetzen, bevor die Proben in die entsprechenden FACS-Röhren auf lichtgeschütztem Eis übertragen werden. Hier kann die hierarchische Gating-Strategie für das Monozyten-Untersatzpanel auf Immunzellen beobachtet werden, die aus dem Knochenmark von DMM-behandelten Tieren gewonnen wurden.Ungefärbte Trolle können verwendet werden, um die wahren Negative für den toten lebenden Fleck zu bestimmen, und die Tore können jedes Mal angepasst werden, wenn das Experiment nach Bedarf durchgeführt wird. In dieser repräsentativen Analyse wurden Immunzellen sechs Wochen nach DMM- oder Scheinkontrolloperationen aus dem Synovialgewebe isoliert und mit extrazellulären Oberflächenmarkern befleckt. Ein höherer Prozentsatz der Ly-SC-positiven MHC2-Negativ- und M2-Makrophagen wird bei DMM-behandelten Tieren beobachtet als bei den Zellpopulationen, die bei Scheinchirurgie-Mäusen beobachtet wurden.Hierkann kann die hierarchische Gating-Strategie für das extra- und intrazelluläre T-Zell-Panel auf Immunzellen beobachtet werden, die aus der Milz von DMM-behandelten Tieren isoliert sind. Ein höherer Prozentsatz der TH1-Zellen wird in den Lymphknoten und Synovialgeweben von DMM-Tieren sowie in höheren Mengen von T-Regulierungszellen und TH17-Zellen beobachtet. Um den Erwerb hochwertiger Proben zu gewährleisten, müssen die Gewebe schnell, akribisch und konsistent geerntet werden.Sobald die Immunzellen isoliert sind, können andere nachgeschaltete Analysen wie RTPCR, Zellkultur und auf Blut ruhen, um ein Licht auf molekulare Prozesse von Interesse zu werfen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Forschung

Medizin

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der Maus Halslymphknoten

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolation und zelluläre Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet von Synovialflüssigkeit und Knochenmark von Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

Die laparoskopische Technik zur Serien Sammlung von Leber und mesenterischen Lymphknoten in Makaken

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Datenbank-geführte Durchflusszytometrie zur Auswertung von Knochenmark myeloische Zellen Reifung

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Das Unterkörper-Positivdruck-Laufband für die Knie-Osteoarthritis-Rehabilitation

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...