Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

ברצוננו להודות לאנדרו לים, Ph.D. וג'יילס בסט, Ph.D. על עזרתם בהקמת ציטומטר זרימה. פרויקט זה נתמך על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) הוענק PH.

ועדת האתיקה של בעלי החיים של מחוז הבריאות המקומי של צפון סידני אישרה את כל ההליכים המוזכרים בפרוטוקול זה. עכברים מאוקרנים ולטפל בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה תוקן 2010). עבור כל הניסויים בני 10-12 שבועות, עכברים זכרים C57BL/6 נוצלו.
<p class="j...

<ol>
	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה תוכננו ונבדקו כדי לזהות באופן אמין תת-קבוצות שונות הן מונוציטים / מקרופאגים T-תאים בתוך הטחול murine, מח עצם, בלוטות הלימפה, רקמת סינוביאלית במודל murine של דלקת מפרקים ניוונית (OA). הפרוטוקול הנוכחי ניתן לשנות בקלות כדי לחקור סוגי רקמות שונים, או סוגי תאים אחרים על ידי ...

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלה מתישה וכואבת מעורבים פתולוגיות שונות של כל הרקמות הקשורות למפרק1. OA היא אחת ממחלות השלד והקודמותהנפוצותביותר, והיא תהפוך לגורם הרביעי המוביללנכות ברחבי העולם עד 20203. OA פוסט טראומטי מתרחש לאחר פציעה משותפת ומחשבונות לפחות 12% של כל OA ועד 25% של OA במפרקים רגישים כגוןהברך 4,5. יתר על כן, פציעה משותפת מגבירה את הסיכון לכל החיים של OA על ידי יותר מחמשפעמים 6. לא כל הפציעות עם חוסר יציבות דומה לכאורה ימשיך לפתח OA, ולכן הגדרת גורמים המניעים את הסיכון לטווח ארוך OA נשאר מאתגר. זה חיוני על מנת לפתח טיפולים יעילים כדי למנוע ו / או לטפל OA פוסט טראומטי, כדי לחקור ולהגדיר טוב יותר את הפתולוגיה ספציפית לפציעה, גורמים, ומנגנונים הנטייה OA1.
OA והרס הסחוס המגדיר שלה יוחס בעבר כולו ללחץ מכני, ולכן, OA נחשב מחלה לא דלקתית2. עם זאת, מחקרים עדכניים יותר הראו חדירה דלקתית של קרום synovial ועלייה של תאים דלקתיים ברקמת synovial בחולים עם OA לעומתפקדים בריאים 2, שפיכת אור על רכיב דלקתי ככוח מניע פוטנציאלי בOA. מחקרים נוספים הראו כי חריגות הן CD4+ ו CD8+ T-cell פרופיל, כמו גם מונוציטים / מקרופאגים של המערכת החיסונית המולדת עשוי לתרום פתוגנזה של OA2,7. חקירות מפורטות של חריגות אלה חשפו תפקידים רלוונטיים עבור קבוצות משנה שונות של תאי T2, כגון Th18, Th29, Th178 ו- T רגולציה (Treg)אוכלוסיות 10,11. למרות ראיות משכנעות אלה, הקשר סיבתי בין שינוי של תגובות T-cell לבין הפיתוח וההתקדמות של OA עדיין לא ידוע2.
בנוסף לתאי T ספציפיים שיש תפקיד בOA, מחקרים אחרונים מראים כי מקרופאגים מקוטבים/מופעלים באופן דיפרנציאלי עשויים להיות משויכים פתוגנזה של OA12. בפרט, מקרופאגים שמקורם מונוציטים בדם מצטברים בסינוביום ומקוטבים לקרופאגים המופעלים באופן קלאסי (M1) או לחילופין מקרופאגים מופעלים (M2) במהלך פיתוח OA, מה המרמז על מתאם בין מקרופאגים נגזרים מונוציטים לבין מקרופאגיםOA 13. לעומת זאת, קבוצות משנה מסוימות של מקרופאגים מאכלסות איברים בשלב מוקדם במהלך הפיתוח ומקיים את מספרן בעניין עצמאימונוצייט 14. לאחרונה, פונקציית הגנה משותפת בתיווך מחסום צומת הדוק הוצגה עבור מקרופאגים אלה תושב רקמות synovial (STRMs)14. ממצאים אלה מצביעים על כך שחריגות מסוימות בתת-ערכות מקרופאג' עשויות לשחק תפקיד מכריע במהלך הפיתוח של OA. עם זאת, האינטראקציות בין תגובה תאית דלקתית זו לבין השינויים המבניים במפרק בעקבות טראומה אינן ידועות.
מבחינה היסטורית, ניתוח של תאים חיסוניים ברקמת הסינוביאלי הוגבל לביטוי חיסוני (IHC) או mRNA על ידי תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך (RT-PCR)מתקרב 15,16. עם זאת, הן IHC והן RT-PCR חסר את היכולת לזהות סוגי תאים שונים מרובים ואת קבוצות המשנה שלהם בו זמנית, ובכך, הגבלת הישימות של שיטות אלה. יתר על כן, IHC מוגבל לניתוח של דגימות קטנות של רקמות, עלול לפספס הצטברויות תאים דלקתיים מוקד. במהלך השנים האחרונות, מספר עצום של סמני פני השטח עבור סוגי תאים שונים פותחו, ותת קבוצות של תאים חיסוניים כעת ניתן לזהות באופן אמין על ידי שילובים ברורים של סמנים אלה. בשל התקדמות טכנית יציבה, ציטומטר זרימה מסוגלים כעת לזהות מספר רב של fluorochromes שונים בו זמנית המאפשר ניתוח של לוחות נוגדנים צבעוניים גדולים.
ציתום זרימה מספק לחוקרים טכניקה רבת עוצמה המאפשרת זיהוי וכמות בו-זמנית של מספר רב של תאים חיסוניים ותת-ערכות שלהם ברמת התא היחיד. פיתחנו ואופטימל גם תסה כתמים חוץ תאיים כדי לזהות מונוציטים / מקרופאגים ואת subsets שלהם, כמו גם תסיסה כתם נוסף / תאי כדי לזהות T-תאים ואת תת קבוצות שלהם בתוך טחול מורין, מח עצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial. כל שלב של פרוטוקול זה היה אופטימיזציה ונבדק וכתוצאה מכך אחסון לשחזור מאוד שניתן להשתמש עבור מודלים אחרים של עכבר OA כירורגי ולא כירורגי17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא אחת המחלות הנפוצות ביותר של השלד והגוף, המשפיעה על חולים הסובלים מכאב ומגבלות פיזיות. ראיות אחרונות מצביעות על מרכיב דלקתי פוטנציאלי של המחלה, עם שני תאי T ו monocytes / מקרופאגים פוטנציאל הקשורים פתוגנזה של OA. מחקרים נוספים הניחו תפקיד חשוב עבור ערכות משנה של תוחומים תאי דלקתיים, כגון Th1, Th2, Th17, ו לימפוציטים T-רגולטוריים, ו M1, M2, ו סינוביום-רקמת-תושב מקרופאגים. עם זאת, האינטראקציה בין התגובה הסלולרית המקומית והמערכתית והשינויים המבניים במפרק אינה ידועה. כדי להבין באופן מלא כיצד תאי T ומונוציטים/מקרופאגים תורמים ל-OA, חשוב להיות מסוגלים לזהות באופן כמותי תאים אלה ואת תת-התת-סטים שלהם בו זמנית ברקמת סינוביאלית, באיברים לימפה משניים ובאופן שיטתי (הטחול ומח העצם). כיום, ניתן לזהות את תת-קבוצות המשנה של תאים דלקתיים שונים על-ידי שילוב של סמנים של פני תא, מה שהופך את ציטומטריית זרימה מרובת צבעים לטכניקה רבת עוצמה בחקירת תהליכים תאיים אלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים צעדים מפורטים לגבי הקציר של רקמת סינוביאלית ואיברים לימפה משניים, כמו גם דור של מתלים תא יחיד. יתר על כן, אנו מציגים גם תסיסה כתמים חוץ תאית כדי לזהות מונוציטים / מקרופאגים ואת תת-ערכות שלהם, כמו גם תסיסה כתם חוץ-תאי נוסף כדי לזהות T-תאים ואת תת-ערכות שלהם בתוך הטחול murine, מח העצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial. כל שלב בפרוטוקול זה היה אופטימיזציה ונבדק, וכתוצאה מכך תוואי מאוד לשחזור שניתן להשתמש בו עבור דגמי עכבר OA כירורגיים ולא כירורגיים אחרים.

תוצאות מייצגות הן מהחלונית 'ערכת משנה מונוצייט' והן מחלונית קבוצת המשנה T-cell מתוארות להלן.
איור 1 ממחיש את אסטרטגיית ההתארגנות ההיררכית עבור לוח תת-הזמן החד-צייטי על תאים חיסוניים שנאספו ממח העצם של בעלי חיים שטופלו ב-DMM. אותה אסטרטגיה שימשה ו אומתה בכל סוגי הר...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ציטומיטרי זרימה מפורט ושחזור כדי לזהות מונוציט / מקרופאג ותת-תאים T-ערכות באמצעות שניהם אקסטרה-ותוך תאי כתמים כתמים בתוך הטחול murine, מח עצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial, ניצול מודל כירורגי מבוסס של דלקת מפרקים ניוונית מורין.

ניתוח ציתום זרימה של תת-סטים של תאים חיסוניים בתוך הטחול מורין, מח העצם, בלוטות הלימפה ורקמות Synovial במודל דלקת מפרקים ניוונית

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר זיהוי וניתוח מפורטים של מונוציטים ומאקרופגים ותאי T ותת-קבוצות הרלוונטיות שלהם בתוך הנוירונים והלוביום ורקמות שונות אחרות של המערכת החיסונית. הטכניקה שלנו מקלה על הקציר האמין של תאי החיסון בחיים מהסינוביום ורקמות רלוונטיות אחרות לאפיון מקיף של התגובה החיסונית האוסטיאו-ארטריטית. לבידוד של רקמות מעניינות מעכבר מודל דלקת מפרקים ניוונית, עם העכבר במצב עלוב, לנגב את החזה, הבטן והרגליים עם 70% אתנול.השתמש מספריים כדי לפתוח בזהירות את העור לאורך קו האמצע של הבטן תוך השארת חלל הבטן שלם. ובעדינות למשוך את העור בצד ימין של החיה מן השריר הבסיסי, משאיר את רקמת השומן תת עורית מחובר לעור. מניחים את העכבר תחת מיקרוסקופ חיטוי ולהשתמש שני מדפים דקים מעוגלים בעדינות להקניט את רקמת השומן הממוקם בירך.לאחר זיהוי שלושת כלי ההצלבה, השתמש במטלות ניתוח עדינות כדי להסיר את בלוטות הלימפה ההמומות הממוקמות בצומת של כלי הדם, דואג לא לקרוע את הקפסולה. השתמש במטחנים כדי להסיר את השומן הנותר מפני השטח של בלוטות הלימפה ולפתוח את חלל הבטן. אם לא ניתן לראות שומן שנותר, למקם את בלוטות הלימפה מיד מוכן בעבר שכותרתו שש צלחת גם מלא 0.5 מיליליטר של מדיה RPMI.לאחר מכן, פתח את חלל הבטן. השתמש מספריים עדין כדי להוציא את הטחול בעדינות לחלץ את המעיים כדי לחשוף את aorta ואת bifurcation שלה. לאחר מכן, מניחים את הטחול מיד שהוכן בעבר ותויג שישה שיחק היטב מלא 0.5 מיליליטר של מדיה RPMI.הסר את בלוטות הלימפה iliac הממוקם בחלק הטרמינל של בית הישעור הבטן ואת המקור של עורק איליאק נפוץ בזהירות להסיר את העור משני הגפיים האחוריות. מיד למקם את בלוטות הלימפה בצלחת מוכנה בעבר שכותרתו שש צלחת היטב לבנות עם 0.5 מיליליטר של מדיה RPMI איגינג כל בלוטות הלימפה משני בעלי חיים. באמצעות מספריים עדינים או אזמל לנקות את עצם הירך השמאלית של רקמת השריר המצורפת וניתק בזהירות הן את מחניקה ואת מפרק הירך, משאיר את העצם כולה שלם תוך הסרת עצם הירך.לאחר מכן הניח את עצם הירך בצלחת מוכנה בעבר ותייג שש צלחת היטב מלא 0.5 מיליליטר של מדיה RPMI. זהה את גיד הפטה של מפרק החנק הימני ולהשתמש מספריים עדינים כדי להסיר את רקמת השריר הסמוכה proximal למפרק עד כחמישה מיליליטר של גיד quadriceps proximal כדי patella נחשפים. חותכים דרך גיד הארבע ראשי כשלושה עד ארבעה מילימטרים קרובים לפטלה כדי ליצור ידית ולהשתמש במלקבעים עדינים כדי למשוך בעדינות את המתח מהמפרק כדי לחשוף את הקצוות של הקובץ המצורף לכמוסה המשותפת.החל מעצם הירך ותנועה לכיוון השוקה, השתמש באזמל כדי לחתוך בזהירות לאורך הקצוות של כמוסה משותפת משני הצדדים תוך שמירה על מתיחה עדינה על גיד quadriceps. כאשר בלוק הרקמה הסינוביאלית מחובר רק השוקה, כרית השומן תוך-רחמי צריך להיות גלוי בבירור דיסטלי patella והוא יכול להיות מנותק בעדינות מן ההיבט המפרקי והקודם של מינסקי. לאחר מכן, לחתוך לאורך החלק הנותר של כמוסה משותפת כדי להסיר את בלוק רקמת סינוביאלי מיד למקם אותו מוכן בעבר שכותרתו שש צלחת גם מלא 1.5 מיליליטר של מדיה RPMI.כאשר כל הרקמות נאספו, למקם שני טחול מאגר לכל תנאי על מסננת תא 70 מיקרומטר בצינור 15 מיליליטר ולהשתמש בוכנה סטרילית שלושה מיליליטר מזרק כדי קצב המוני בעדינות את הרקמות דרך מסנן רשת שטיפה מסננת לעתים קרובות עם סך של שישה מיליליטר של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS. להרוס את התאים על ידי צנטריפוגה, ולהשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של פחזנית תמוגה תא דם אדום. לאחר חמש דקות, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגה התאים.כאשר לא יותר כדוריות דם אדומות נצפו, להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS טרי לספירה. עבור עיבוד בלוטות הלימפה מקום כל ארבעת בלוטות הלימפה על מסננת תא 70 מיקרומטר בצינור חדש 15 מיליליטר ולהשתמש בוכנה סטרילית חדשה שלושה מיליליטר כדי להקניט בעדינות את בלוטות הלימפה דרך רשת לתוך מתלה תא יחיד, ואז צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G במשך חמש דקות, להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה ב 500 microliters כדי לבודד את מח העצם, השתמש במלקחיים אגודל רקמה כדי לתפוס בזהירות את עצם הירך שלם ולהשתמש מספריים חדים כדי לחתוך את הקצה של עצם הירך proximal.הכנס מחט 23 מד לתוך אמצע הרץ intercondylar של עצם הירך ולסובב את המחט תוך הפעלת לחץ עדין לקדוח חור לתוך הרץ. שינוי המחט לפי הצורך, לשטוף את תכולת העצם עם שישה מיליליטר של RPMI בתוספת 10% FBS על מסננת תא 70 מיקרומטר על צינור חדש 15 מיליליטר ולהשתמש בוכנה חדשה שלושה מיליליטר מזרק ללחוץ בעדינות את מח העצם דרך רשת. להלן, לבצע את הצעד RBC כפי שהוכח עבור הטחול.כאשר לא יותר כדוריות דם אדומות נצפו, להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS טרי לספירה. לעיבוד רקמת הסינוביאלית השתמש במספריים כירורגיים עדין כדי לקוביות את שני בלוקי רקמת הסינוביאלית לחתיכות זעירות ולהעביר את הדגימות לצינור חדש של 15 מיליליטר. לשטוף את מיכל האיסוף עם 500 microliters של מדיום כדי לאסוף את כל התאים הנותרים ורקמות סינוביאלי ולמשוך את הכביסה בצינור איסוף מדגם.לאחר מכן, להוסיף נפח מספיק של אנזים כדי להשיג ביחידה אחת לכל ריכוז סופי מיליליטר ולעכל את דגימת רקמת הסינוביאלית ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך שעתיים של מסובב. להבטיח תנועה מספקת בעת הצבת הצינורות במסובב. בסוף הדגירה, לעצור את העיכול עם שמונה מיליליטר של RPMI בתוספת 10% FBS ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש 15 מיליליטר.לשטוף את הצינור הישן 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של מדיום ולהשתמש בזה כדי לשטוף את המסנן. לאחר מכן, להרוס את התאים על ידי צנטריפוגה לשימוש חוזר את גלולה ב 500 microliters של PBS לספירה. כדי לבצע כתמי כדאיות של תאי החיסון המבודדים, הוסיפו חמש פעמים 10 לחמשת התאים של כל מתלה תא ל הבאר המתאימה של שתי צלחות שונות של 96 בארות U-bottom ואספו את התאים לתחתית כל באר.כלול תמיד מספיק תאים לא מזוהמים של כל סוג רקמה כפקדים שליליים. לשטוף תאים עם 200 microliters של PBS ולהשעות מחדש את כדורי 100 microliters של תאים בצבע תגובתי אמין מחלחל ל הבאר עבור דגירה 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. בסוף הדגירה לשטוף את התאים פעמיים 200 microliters של חיץ FACS לכל לשטוף מחדש להשעות כל גלולה ב 100 microliters של הנוגדן המתאים של עניין או קוקטייל שליטה.אם גם הכתמים החוץ-תאיים וגם הכתמים החוץ-תאיים מתבצעים באותו שלב ביצוע של הכתמים החוץ-תאיים כעת. לאחר דגירה של 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס המוגן מפני שטיפה קלה של התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטרים של מאגר FACS ל הבאר ולהשעות מחדש את התאים ואת צלחת לוח תת-קבוצה מונוציטים ב 250 microliters של חיץ FACS בתוספת EDTA מילימולרי אחד. לבצע שלב זה רק אם לא מתוכנן כתמים תאיים, אחרת לעבור להיבט הכתמים תאיים של הפרוטוקול.לאחר מכן, העבר כל דגימת תת-קבוצה של מונוציטים לצינור FACS המתאים המתאים על קרח המוגן מפני אור. עבור כתמים בין תאיים של תאי לוח תת-קבוצה של תאי T, השהה מחדש את כדורי ב-200 מיקרוליטרים של מאגר קיבעון מערכת קיבעון וסלמיביליזציה מתאימה עבור דגירה של 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס המוגנות מפני אור. בסוף הדגירה לשטוף את התאים פעמיים עם 200 microliters של חיץ שטיפת permeabilization ולהשעות מחדש את כדורי 100 microliters של הנוגדן המתאים של עניין או קוקטייל שליטה עבור דגירה 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים ב 200 microliters של חיץ שטיפת permeabilization לכל לשטוף. ולהשעות מחדש את התאים ב 250 microliters של FACS בתוספת מאגר EDTA לפני העברת הדגימות לתוך צינורות FACS המתאימים על קרח מוגן מפני אור. כאן, ניתן לראות את אסטרטגיית הגתה ההיררכית של תת-הקבוצה המונוצטית על תאים חיסוניים שנאספו ממח העצם של בעלי חיים שטופלו ב- DMM.טרולים לא מזוהמים יכולים לשמש כדי לקבוע את התשלילים האמיתיים לכתם המתים בחיים ואת השערים ניתן להתאים בכל פעם הניסוי נערך לפי הצורך. בניתוח מייצג זה, תאי החיסון היו מבודדים מרקמות הסינוביאליות ומוכתמים בסמני משטח חוץ-תאיים, שישה שבועות לאחר ניתוח שליטה ב- DMM או מזויפים. אחוז גבוה יותר של Ly-SC חיובי MHC2 שלילי M2 מקרופאגים נצפו בבעלי חיים שטופלו DMM בהשוואה לאוכלוסיות התא שנצפו בעכברים ניתוח מזויפים.כאן, ניתן לראות את אסטרטגיית הגתה ההיררכית עבור לוח תאי T הנוסף והמעקבי על תאי החיסון המבודדים מטחולם של בעלי חיים שטופלו ב- DMM. אחוז גבוה יותר של תאי TH1 נצפו בבלוטות הלימפה ורקמות סינוביאליות של בעלי חיים DMM, כמו גם מספרים גבוהים יותר של תאים רגולטוריים T ותאי TH17. כדי להבטיח רכישה של דגימות באיכות גבוהה, יש לקצור את הרקמות בצורה מהירה, קפדנית ועקבית.לאחר תאי החיסון בודדו, ניתוח במורד הזרם יכול להתבצע כגון RTPCR, תרבות התא לנוח על הדם כדי להאיר אור על תהליכים מולקולריים של עניין.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

בתדירות גבוהה אולטראסאונד הדמיה של בלוטות לימפה עכבר צוואר הרחם

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

בידוד נייד phenotyping של בתאי גזע mesenchymal נגזר הסינוביאלי נוזל מח עצם של Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

טכניקה לפרוסקופית עבור אוסף סידורי של צומת כבדים Mesenteric הלימפה קופי מקוק

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

אפיון של תאים חיסוניים בתוך רקמת שומן אנושי באמצעות Cytometry זרימה

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Cytometry זרימה מונחה מסד הנתונים להערכה של התבגרות התא מיאלואידית מח עצם

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

הגוף התחתון חיובי לחץ הליכון עבור שיקום אוסטיאוארתריטיס ברך

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...