Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Andrew Lim, Ph.D. og Giles Best, Ph.D. for deres hjelp til å sette opp flytcytometeret. Dette prosjektet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) tildelt PH.

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee har godkjent alle prosedyrer nevnt i denne protokollen. Mus er plassert og tatt vare på i samsvar med Guide for omsorg og bruk av laboratoriedyr (National Health and Medical Research Council of Australia Revidert 2010). For alle eksperimenter 10-12 uker gamle, mannlige C57BL/6 mus ble brukt.
MERK: For å indusere posttraumatisk OA ble kirurgisk destabilisering av den mediale menisken (DMM) i høyre kvelende ledd ut...

<ol>
	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

Metodene som er beskrevet i denne protokollen er utformet og testet for å pålitelig identifisere ulike undergrupper fra både monocytter / makrofager og T-celler i murin milten, benmargen, lymfeknuter og synovialt vev i en murinmodell av slitasjegikt (OA). Den nåværende protokollen kan enkelt endres for å undersøke ulike vevstyper, eller andre celletyper ved å utveksle antistoffer, og kan brukes til alternative murine modeller av OA. Når du tester andre vevstyper, er det viktig å teste spesifisiteten til hvert a...

Artrose (OA) er en ødeleggende og smertefull sykdom som involverer ulike patologier i alle vev forbundet med ledd1. Påvirker ca 3,8% av den globalebefolkningen 2, OA er en av de mest utbredte muskel-skjelettsykdommer, og det er å bli den fjerde ledende årsaken tilfunksjonshemming over hele verden innen 20203. Posttraumatisk OA oppstår etter en leddskade og står for minst 12% av alle OA og opptil 25% av OA i mottakelige ledd som kneet4,5. Videre øker leddskaden livstidsrisikoen for OA med mer enn fem ganger6. Ikke alle skader med tilsynelatende lignende ustabilitet vil fortsette å utvikle OA, og derfor er det fortsatt utfordrende å definere faktorer som driver den langsiktige OA-risikoen. Det er avgjørende for å utvikle effektive behandlinger for å forebygge og/ eller behandle posttraumatisk OA, for å undersøke og bedre definere den skadespesifikke patologien, årsakene og mekanismene som predisponerer for OA1.
OA og dens definerende bruskødeleggelse ble tidligere tilskrevet helt og holdent til mekanisk stress, og dermed ble OA ansett som en ikke-inflammatorisk sykdom2. Nyere studier har imidlertid vist en inflammatorisk infiltrasjon av synovialmer og en økning av inflammatoriske celler i synovialvevet hos pasienter med OA sammenlignet med friske kontroller2, kaster lys over en inflammatorisk komponent som en potensiell drivkraft i OA. Videre studier indikerte at abnormiteter i både CD4 + og CD8 + T-celleprofil samt monocytter / makrofager i det medfødte immunsystemet kan bidra til patogenesen av OA2,7. Detaljerte undersøkelser av disse abnormitetene viste relevante roller for ulike T-celleundergrupper2, for eksempel Th18, Th29, Th178 og T regulatoriske (Treg)populasjoner 10,11. Til tross for dette overbevisende beviset er årsakssammenhenget mellom endringen av T-celleresponser og utviklingen og utviklingen av OA fortsatt ukjent2.
I tillegg til at spesifikke T-celler har en rolle i OA, tyder nyere studier på at differensialt polariserte /aktiverte makrofager kan være forbundet med patogenese av OA12. Spesielt akkumuleres makrofager som stammer fra blodmonocytter i synoviumet og polariserer til enten klassisk aktiverte makrofager (M1) eller alternativt aktiverte makrofager (M2) under OA-utvikling, noe som innebærer en sammenheng mellom monocyttavledede makrofager og OA13. I motsetning, visse undergrupper av makrofager fylle organer tidlig under utvikling og selvoppholde sine tall i en monocytt uavhengig sak14. Nylig ble en felles beskyttende funksjon mediert av en tett veikryssbarriere vist for disse synovial-vev-resident makrofager (STRMs)14. Disse funnene tyder på at abnormiteter spesielt makrofagsundersett kan spille en avgjørende rolle under utviklingen av OA. Interaksjonene mellom denne inflammatoriske cellulære responsen og de strukturelle endringene i leddet etter traumer er imidlertid ukjent.
Historisk sett var analyse av immunceller i synovialvevet begrenset til immunohistokjemi (IHC) eller mRNA-uttrykk ved omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) nærmerseg 15,,16. Imidlertid mangler både IHC og RT-PCR muligheten til å identifisere flere forskjellige celletyper og deres undergrupper samtidig, og dermed begrense anvendeligheten til disse metodene. Videre er IHC begrenset til analyse av små prøver av vev og kan gå glipp av fokale inflammatoriske celleakkumuleringer. I løpet av de siste årene har en myriade av overflatemarkører for ulike celletyper blitt utviklet, og undergrupper av immunceller kan nå identifiseres pålitelig ved forskjellige kombinasjoner av disse markørene. På grunn av jevn teknisk fremgang er strømningssytometre nå i stand til å identifisere en rekke forskjellige fluorokromer samtidig som det muliggjør analyse av store flerfargede antistoffpaneler.
Flow cytometri gir etterforskerne en kraftig teknikk som tillater samtidig identifisering og kvantifisering av en rekke immunceller og deres undergrupper på enkeltcellenivå. Vi har utviklet og optimalisert både en ekstracellulær fargingsanalyse for å identifisere monocytter / makrofager og deres undergrupper, samt en ekstra / intracellulær fargingsanalyse for å identifisere T-celler og deres undergrupper innen murin milt, benmarg, lymfeknuter og synovialt vev. Hvert trinn i denne protokollen ble optimalisert og testet, noe som resulterte i en svært reproduserbar analyse som kan brukes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA-musemodeller17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

Artrose (OA) er en av de mest utbredte muskel- og skjelettsykdommene, som påvirker pasienter som lider av smerte og fysiske begrensninger. Nyere bevis indikerer en potensiell inflammatorisk komponent av sykdommen, med både T-celler og monocytter / makrofager potensielt forbundet med patogenesen av OA. Videre studier postulerte en viktig rolle for undergrupper av begge inflammatoriske celleavsnæringer, som Th1, Th2, Th17 og T-regulatoriske lymfocytter, og M1, M2, og synovium-vev-bosatt makrofager. Interaksjonen mellom den lokale synovial og systemisk inflammatorisk cellulær respons og de strukturelle endringene i leddet er imidlertid ukjent. For å fullt ut forstå hvordan T-celler og monocytter / makrofager bidrar mot OA, er det viktig å kunne kvantifisere disse cellene og deres undergrupper samtidig i synovialvev, sekundære lymfatiske organer og systemisk (milten og benmargen). I dag kan de forskjellige inflammatoriske celleundersettene identifiseres ved en kombinasjon av celleoverflatemarkører som gjør multi-fargeflytcytometri til en kraftig teknikk for å undersøke disse cellulære prosessene. I denne protokollen beskriver vi detaljerte trinn om høsting av synovialt vev og sekundære lymfatiske organer, samt generering av enkeltcellesuspensjoner. Videre presenterer vi både en ekstracellulær fargingsanalyse for å identifisere monocytter / makrofager og deres undergrupper, samt en ekstra- og intracellulær fargingsanalyse for å identifisere T-celler og deres undergrupper innenfor murinspleten, benmargen, lymfeknuter og synovialt vev. Hvert trinn i denne protokollen ble optimalisert og testet, noe som resulterte i en svært reproduserbar analyse som kan brukes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA-musemodeller.

Representative resultater fra både monocyttdelpanel og T-celledelsettpanel er beskrevet nedenfor.
Figur 1 illustrerer den hierarkiske gating strategien for monocytt undergruppe panel på immunceller samlet fra benmarg av DMM behandlet dyr. Den samme strategien ble brukt og verifisert i alle andre vevstyper. Når du konfigurerer eksperimentet, ble spenningen Forward Scatter Area (FSC-A) og Side Scatter Area (SSC-A) bestemt for hver vevstype for å identifisere mon...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Her beskriver vi en detaljert og reproduserbar strømningscytometriprotokoll for å identifisere monocytt/makrofag og T-celleundergrupper ved hjelp av både ekstra- og intracellulære fargingsanalyser innenfor murinsplitten, benmargen, lymfeknuter og synovialvev, ved hjelp av en etablert kirurgisk modell av murinslitasjegikt.

Flow Cytometry Analyse av immuncelle undergrupper innenfor Murine Milten, Benmarg, Lymfeknuter og synovialvev i en slitasjegikt modell

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Vår protokoll muliggjør detaljert identifisering og analyse av monocytter og makrofager og T-celler og deres relevante undergrupper i nevroner og egg og ulike andre vev i immunsystemet. Vår teknikk letter pålitelig høsting av livs immunceller fra synovium og andre relevante vev for en omfattende karakterisering av osteoarthritic immunrespons. For isolering av vev av interesse fra en slitasjegikt modell mus, med musen i liggende stilling, tørk brystet, magen og bena med 70% etanol.Bruk saks til å åpne huden forsiktig langs midtlinjen av magen mens du forlater bukhulen intakt. Og trekk forsiktig huden på høyre side av dyret bort fra den underliggende muskelen, slik at det subkutane fettvevet er festet til huden. Plasser musen under et disseksjonsmikroskop og bruk to buede fine tang for å forsiktig erte ut fettvevet som ligger på låret.Etter å ha identifisert de tre kryssfartøyene, bruk fine dissekerings tang for å fjerne inngangslymfeknuten som ligger i skjæringspunktet mellom fartøyene, og ta vare på ikke å bryte kapselen. Bruk tangen til å fjerne det gjenværende fettet fra overflaten av lymfeknuten og åpne bukhulen. Hvis det ikke kan ses gjenværende fett, plasserer du lymfeknuten umiddelbart i en tidligere forberedt og merket seks brønnplate fylt med 0,5 milliliter RPMI-medier.Deretter åpner du bukhulen. Bruk fin saks for å avgiftsdirektoratet milten og å forsiktig trekke ut tarmene for å eksponere aorta og bifurcation. Deretter plasserer milten umiddelbart i en tidligere forberedt og merket seks godt spilt fylt med 0,5 milliliter RPMI media.Fjern iliac lymfeknute som ligger på terminalsegmentet av abdominal aorta og opprinnelsen til den vanlige iliac arterien og fjern forsiktig huden fra begge baklemmer. Plasser umiddelbart lymfeknuten i en tidligere forberedt og merket seks brønnplatebygg med 0,5 milliliter RPMI-medier som samlet alle lymfeknuter fra to dyr. Ved hjelp av fin saks eller en skalpell rengjør venstre lårben av det vedlagte muskelvevet og koblet forsiktig fra både kveleren og hofteleddet, slik at hele beinet er intakt mens du fjerner lårbenet.Deretter plasserte lårbenet i en tidligere forberedt og merket seks godt plate fylt med 0,5 milliliter RPMI media. Identifiser patella senen i høyre kvele ledd og bruk fin saks for å fjerne tilstøtende muskelvev proksimalt til ledd til ca fem milliliter quadriceps sene proksimalt til patella er utsatt. Skjær gjennom quadriceps senen omtrent tre til fire millimeter proksimal til patella å danne et håndtak og bruke fine tang for å forsiktig trekke spenningen bort fra leddet for å utsette kantene av felles kapsel vedlegg.Start med lårbenet og beveger seg mot tibia, bruk en skalpell til å forsiktig kutte langs kantene av felleskapselen på begge sider samtidig som du opprettholder en mild trekkraft på quadriceps-senen. Når synovialvevsblokken bare er festet til tibia, bør den intraartikulære fettputen være tydelig synlig distal til patella og kan forsiktig løsnes fra leddet og fremre aspektet av Minsky. Deretter skjærer du langs den gjenværende delen av felleskapselen for å fjerne synovialvevsblokken og plasserer den umiddelbart i en tidligere forberedt og merket seks brønnplate fylt med 1,5 milliliter RPMI-medier.Når alle vevene er samlet, plasser to samlede milter per tilstand på en 70 mikrometercellesil i et 15 milliliter rør og bruk et sterilt tre milliliter sprøytestempel for å forsiktig massehastighet vevet gjennom nettingfilteret skylle silen ofte med totalt seks milliliter RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS. Sediment cellene ved sentrifugering, og re-suspendere pellet i fem milliliter av røde blodlegemer lysis puffer. Etter fem minutter, stopp reaksjonen med 10 milliliter PBS og sentrifuge cellene.Når det ikke observeres flere røde blodlegemer, må pelleten suspenderes på nytt i én milliliter fersk PBS for telling. For lymfeknutebehandling plasserer alle fire lymfeknuter på en 70 mikrometercellesil i et nytt 15 milliliter rør og bruker et nytt sterilt tre milliliter stempel for å forsiktig erte lymfeknutene gjennom nettet til en enkelt cellesuspensjon, og sentrifuger cellene ved 500 ganger G i fem minutter, kast den overnaturlige og re-suspendere pelleten i 500 mikroliter PBS for telling. For å isolere benmargen, bruk en vevstommel tang for å forsiktig gripe den intakte lårbenet og bruk skarp saks for å kutte av selve enden av den proksimale lårbenet.Sett en 23 gauge nål inn i midten av det intercondylar hakket på lårbenet og roter nålen mens du bruker mildt trykk for å bore et hull i hakket. Endre nålen etter behov, skyll beininnholdet med seks milliliter RPMI supplert med 10% FBS på en 70 mikrometercellesil på et nytt 15 milliliter rør og bruk et nytt tre milliliter sprøytestempel for å trykke benmargen forsiktig gjennom nettet. Utfør deretter RBC-trinnet som demonstrert for milten.Når det ikke observeres flere røde blodlegemer, må pelleten suspenderes på nytt i én milliliter fersk PBS for telling. For behandling av synovialvevet bruk fin kirurgisk saks for å terninger de to synovialvevsblokkene i små biter og overføre prøvene til et nytt 15 milliliter rør. Skyll oppsamlingsbeholderen med 500 mikroliter medium for å samle eventuelle gjenværende celler og synovialvev og trekk vasken i prøveoppsamlingsrøret.Deretter legger du til et tilstrekkelig volum av enzym for å oppnå i en enhet per milliliter endelig konsentrasjon og fordøye synovialvevsprøven ved 37 grader Celsius i en inkubator i to timer med en rotator. Sørg for tilstrekkelig bevegelse når du plasserer rørene i rotatoren. På slutten av inkubasjonen, stopp fordøyelsen med åtte milliliter RPMI supplert med 10% FBS og filtrere cellesuspensjonen gjennom en 70 mikrometercellesil i et nytt 15 milliliter rør.Skyll det gamle 15 milliliter røret med fem milliliter medium og bruk dette til å vaske filteret. Deretter sediment cellene ved sentrifugering og resuspend pellet i 500 mikroliter pbs for telling. For å utføre levedyktighet farging av de isolerte immunceller, legg fem ganger 10 til de fem cellene i hver celle suspensjon til de riktige brønnene av to forskjellige 96 godt U-bunnplater og samle cellene til bunnen av hver brønn.Ta alltid med tilstrekkelige uopphetede celler av hver vevstype som negative kontroller. Vask celler med 200 mikroliter PBS og re-suspendere pellets i 100 mikroliter celle i permeant amin reaktiv fargestoff per brønn i en 15 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen vask cellene to ganger i 200 mikroliter FACS buffer per vask og re-suspendere hver pellet i 100 mikroliter av riktig antistoff av interesse eller kontroll cocktail.Hvis både intra og ekstracellulær farging utføres i samme utføre ekstracellulære farging trinn nå. Etter 30 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius beskyttet mot lys vaske cellene to ganger med 200 mikroliter FACS buffer per brønn og re-suspendere cellene og monocytt subet panelplate i 250 mikroliter facs buffer supplert med en millimolar EDTA. Utukne dette trinnet bare hvis ingen intracellulær farging er planlagt, ellers gå videre til det intracellulære fargingsaspektet av protokollen.Deretter overfører du hver monocyttundersettprøve til det passende tilsvarende FACS-røret på is beskyttet mot lys. For intercellulær farging av T-celle delsettpanelceller, re-suspendere pellets i 200 mikroliter fiksering buffer fra en passende fiksering og permeabilisering kit for en 40 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen vask cellene to ganger med 200 mikroliter permeabilisering vaskebuffer og re-suspendere pellets i 100 mikroliter av riktig antistoff av interesse eller kontroll cocktail for en 40 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius beskyttet mot lys.Vask deretter cellene to ganger i 200 mikroliter permeabiliseringsvaskbuffer per vask. Og re-suspendere cellene i 250 mikroliter facs pluss EDTA buffer før du overfører prøvene til passende tilsvarende FACS rør på is beskyttet mot lys. Her kan den hierarkiske gating strategien for monocytt undergruppe panel på immunceller samlet fra benmargen av DMM behandlede dyr observeres.Uopphetede troll kan brukes til å bestemme de sanne negativene for den døde levende flekken, og portene kan justeres hver gang eksperimentet utføres etter behov. I denne representative analysen ble immunceller isolert fra synovialvevet og farget med ekstracellulære overflatemarkører, seks uker etter DMM eller sham kontroll kirurgi. En høyere prosentandel av Ly-SC positive MHC2 negative og M2 makrofager observeres hos DMM behandlede dyr sammenlignet med cellepopulasjonene observert i sham kirurgi mus.Her kan den hierarkiske gating strategien for det ekstra og intracellulære T-cellepanelet på immunceller isolert fra milten av DMM behandlede dyr observeres. En høyere prosentandel av TH1-celler observeres i lymfeknuter og synovialvev av DMM-dyr, samt høyere antall T-regulatoriske celler og TH17-celler. For å sikre oppkjøp av prøver av høy kvalitet, må vevet høstes på en rask, omhyggelig og konsekvent måte.Når immuncellene er isolert, kan andre nedstrømsanalyse utføres som RTPCR, cellekultur og hvile på blod for å skinne et lys på molekylære prosesser av interesse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Bruke kvantitativ real-time PCR fastslår Donor Cell engraftment i en konkurransedyktig Murine benmargstransplantasjon Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

En Tredimensjonal Tissue Culture modell for å studere Primær Menneskelig Bone Marrow og dets Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Høyfrekvente ultralydavbildning av Muse Cervical lymfeknuter

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- og flowcytometrisystemer basert analyse av Cell Plasser og cellesyklus i 3D melanom Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolasjon og Cellular fenotyping av stamceller Avledet fra leddvæske og benmarg av minigriser

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

Laparoskopisk teknikk for Serial Innsamling av leveren og Mesenteric lymfeknuter hos aper

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakteristikk av immunceller i menneskelig fettvev ved hjelp av flowcytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Database-guidede flowcytometri for evaluering av benmarg myelogen celle modning

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Den nedre kroppen positivt trykk tredemølle for kneet slitasjegikt rehabilitering

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...