Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Эндрю Лим, доктор философии и Джайлс Бест, доктор философии за помощь в создании цитометра потока. Этот проект был поддержан Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1), присужденным PH.

Северный Сидней Местный район здравоохранения животных комитет по этике одобрил все процедуры, упомянутые в этом протоколе. Мыши размещаются и заботятся в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Национальный совет по здравоохранению и медицинским...

<ol>
	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

Методы, описанные в этом протоколе, были разработаны и протестированы для надежного выявления различных подмножей как из моноцитов / макрофагов и Т-клеток в селезенке мурина, костного мозга, лимфатических узлов и синовиальной ткани в муриной модели остеоартрита (ОА). Текущий протокол м?...

Остеоартрит (ОА) является изнурительным и болезненным заболеванием, включающим различные патологии всех тканей, связанных с суставом1. Затрагивающие примерно 3,8% мировогонаселения 2, ОА является одним из наиболее распространенных заболеваний опорно-двигательного мозга и она станет 4-йведущей причиной инвалидности во всем мире к 2020году 3. Посттравматический ОА происходит после травмы сустава и составляет не менее 12% всех ОА и до 25% ОА в восприимчивых суставов, таких какколено 4,5. Кроме того, повреждение суставов увеличивает пожизненный риск ОА более чем в пять раз6. Не все травмы с явно аналогичной нестабильности будет продолжать развиваться ОА, и поэтому определяющие факторы, которые управляют долгосрочной ОА-риск остается сложной задачей. Это имеет решающее значение для того, чтобы разработать эффективные методы лечения для профилактики и / или лечения посттравматического ОА, для расследования и лучше определить травмы конкретных патологии, причины и механизмы, которые предрасполагают кОА 1.
ОА и его определяющее разрушение хряща ранее было полностью связано с механическим стрессом и, таким образом, ОА считалась невоспалительноезаболевание 2. Тем не менее, более поздние исследования показали воспалительное проникновение синовиальных мембран и увеличение воспалительных клеток в синовиальной ткани у пациентов с ОА посравнению со здоровыми контроля 2, проливая свет на воспалительный компонент в качестве потенциальной движущей силы в ОА. Дальнейшие исследования показали, что аномалии как в CD4 "и CD8" Т-клеточный профиль, а также моноцитов / макрофагов врожденной иммунной системы может способствовать патогенеза ОА2,7. Детальные исследования этих аномалий выявили соответствующие роли для различныхподмножей Т-клеток 2,таких как Th18,Th29,Th178 и T нормативных (Treg)популяций 10,11. Несмотря на это убедительные доказательства, причинно-следственная связь между изменением Т-клеток ответы и развитие и прогрессирование ОА до сих пор неизвестно2.
В дополнение к конкретным Т-клеток, имеющих роль в ОА, последние исследования показывают, что дифференцированно поляризованных / активированных макрофагов могут быть связаны с патогенезом ОА12. В частности, макрофаги, происходящие из моноцитов крови, накапливаются в синовии и поляризуются либо в классически активированные макрофаги (М1), либо в альтернативно активированные макрофаги (М2) во время развития ОА, подразумевая корреляцию между моноцитами, полученными макрофагами, иОА 13. В отличие от этого, некоторые подмножества макрофагов населяют органы на ранних стадиях развития и самостоятельно поддерживают их численность в моноците независимойматерии 14. Недавно, совместная защитная функция опосредованная плотно-развязным барьером была показана для этих синовиально-тканевых резидентов макрофагов (STRMs)14. Эти выводы свидетельствуют о том, что аномалии, в частности подмножества макрофагов, могут играть решающую роль при разработке ОА. Однако взаимодействие между этой воспалительной клеточной реакцией и структурными изменениями в суставе после травмы неизвестно.
Исторически анализ иммунных клеток в синовиальной ткани был ограничен иммуногистохимией (IHC) или экспрессией мРНК путем обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR)подходов 15,16. Однако и IHC, и RT-PCR не имеют возможности одновременно идентифицировать несколько различных типов клеток и их подмножего, что ограничивает применимость этих методов. Кроме того, IHC ограничивается анализом небольших образцов тканей и может пропустить очаговых воспалительных накоплений клеток. За последние несколько лет было разработано множество поверхностных маркеров для различных типов клеток, и подмножества иммунных клеток теперь могут быть надежно идентифицированы различными комбинациями этих маркеров. Благодаря устойчивому техническому прогрессу, цитометры потока теперь способны идентифицировать множество различных фторхромов, одновременно позволяющих анализ больших многоцветных панелей антител.
Цитометрия потока предоставляет следователям мощный метод, который позволяет одновременной идентификации и количественной оценки множества иммунных клеток и их подмножества на уровне одной клетки. Мы разработали и оптимизировали как внеклеточный анализ окрашивания для выявления моноцитов/макрофагов и их подмножестей, так и дополнительный/внутриклеточный анализ окрашивания для выявления Т-клеток и их подмножестей в муриной селезенке, костном мозге, лимфатических узлах и синовиальной ткани. Каждый шаг этого протокола был оптимизирован и протестирован в результате чего весьма воспроизводимые анализ, который может быть использован для других хирургических и нехирургических моделейОА мыши 17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

Остеоартрит (ОА) является одним из наиболее распространенных заболеваний опорно-двигательного мозга, затрагивающих пациентов, страдающих от боли и физических ограничений. Последние данные свидетельствуют о потенциальном воспалительном компоненте заболевания, при этом Т-клетки и моноциты/макрофаги потенциально связаны с патогенезом ОА. Дальнейшие исследования постулировали важную роль подмножений обеих воспалительных клеточных линий, таких как Th1, Th2, Th17 и T-регулятивных лимфоцитов, а также макрофагов M1, M2 и синовиум-тканей-резидентов. Однако взаимодействие между локальной синовиальной и системной воспалительной клеточной реакцией и структурными изменениями в суставе неизвестно. Чтобы полностью понять, как Т-клетки и моноциты / макрофаги способствуют ОА, важно иметь возможность количественно определить эти клетки и их подмножества одновременно в синовиальной ткани, вторичных лимфатических органов и системно (селезенки и костного мозга). В настоящее время различные подмножества воспалительных клеток могут быть определены путем сочетания маркеров клеточной поверхности, что делает цитометрию многоцветного потока мощным методом в расследовании этих клеточных процессов. В этом протоколе мы описываем подробные шаги, касающиеся сбора урожая синовиальной ткани и вторичных лимфатических органов, а также генерации одноклеточных суспензий. Кроме того, мы представляем как внеклеточное окрашивание анализ для выявления моноцитов / макрофагов и их подмножего, а также экстра- и внутриклеточного окрашивания анализ для выявления Т-клеток и их подмножего в мурин селезенки, костного мозга, лимфатических узлов и синовиальной ткани. Каждый шаг этого протокола был оптимизирован и протестирован, в результате чего очень воспроизводимые анализы, которые могут быть использованы для других хирургических и нехирургических моделей ОА мыши.

Ниже описаны репрезентативные результаты как панели подмножества моноцитов, так и панели подмножества Т-клеток.
Рисунок 1 иллюстрирует иерархическую стратегию гэтинга для моноцитов подмножество панели на иммунные клетки, собранные из костного мозга DMM ?...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Здесь мы описываем подробный и воспроизводимый протокол цитометрии потока для выявления моноцитов/макрофагов и Т-клеточных подмножества с использованием как экстра-, так и внутриклеточного окрашивания анализов в муриной селезенке, костном мозге, лимфатических узлах и синовиальной ткани, используя установленную хирургическую модель муринового остеоартрита.

Цитометрия потока Анализ подмножества иммунных клеток в murine spleen, костном мозге, лимфатических узлах и синовиальной ткани в модели остеоартрита

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Наш протокол позволяет детально идентифицировать и анализ моноцитов и макрофагов и Т-клеток и их соответствующих подмножений в нейронах и яйцеклетках и различных других тканях иммунной системы. Наша методика облегчает надежный урожай иммунных клеток жизни из синовия и других соответствующих тканей для всесторонней характеристики остеоартритического иммунного ответа. Для изоляции тканей, представляющих интерес от остеоартрита модели мыши, с мышью в положении на спине, протрите грудь, живот и ноги 70% этанола.Используйте ножницы, чтобы тщательно открыть кожу вдоль средней линии живота, оставляя брюшную полость нетронутой. И осторожно вытяните кожу на правую сторону животного от основной мышцы, оставляя подкожной жировой ткани прилагается к коже. Поместите мышь под рассечение микроскопа и использовать два изогнутых тонких типсов, чтобы мягко дразнить из жировой ткани, расположенной на бедре.После выявления трех перекрестных сосудов, используйте тонкое рассечение типсов для удаления пахового лимфатического узла, расположенного на пересечении сосудов, заботясь о том, чтобы не разорвать капсулу. Используйте типсы, чтобы удалить оставшийся жир с поверхности лимфатического узла и открыть брюшную полость. Если не осталось жира можно увидеть, поместите лимфатический узел сразу в ранее подготовленных и помечены шесть хорошо пластины заполнены 0,5 миллилитров RPMI средств массовой информации.После этого откройте брюшную полость. Используйте тонкие ножницы, чтобы вырезать селезенку и аккуратно извлечь кишечник, чтобы разоблачить аорту и ее бифуркацию. В дальнейшем, поместите селезенку сразу в ранее подготовленных и помечены шесть хорошо играл заполнены 0,5 миллилитров RPMI средств массовой информации.Удалите подвздошный лимфатический узел, расположенный в терминальной части брюшной аорты и происхождение общей подвздошной артерии и тщательно удалить кожу с обеих задних конечностей. Немедленно поместите лимфатический узел в ранее подготовленные и помечены шесть хорошо пластины построить с 0,5 миллилитров RPMI средств массовой информации объединения всех лимфатических узлов от двух животных. Используя тонкие ножницы или скальпель очистить левую бедренную кость прилагается мышечной ткани и тщательно отключены как задушить и тазобедренного сустава, в результате чего вся кость нетронутыми при удалении бедренной кости.Затем поместили бедренную кость в ранее подготовленную и помеченную шесть хорошо пластин, наполненных 0,5 миллилитров RPMI сми. Определите сухожилие коленной чашечки правого подавления сустава и использовать тонкие ножницы, чтобы удалить прилегающую мышечную ткань проксимальной к суставу до тех пор, пока примерно пять миллилитров четырехглавой сухожилия проксимальной коленной чашечки подвергаются. Прорезать четырехглавое сухожилие примерно три-четыре миллиметра проксимальной для коленной чашечки, чтобы сформировать ручку и использовать тонкие типсы, чтобы мягко вытащить напряжение от сустава, чтобы разоблачить края совместного крепления капсулы.Начиная с бедренной кости и двигаясь к голени, используйте скальпель, чтобы тщательно сократить по краям совместной капсулы с обеих сторон, сохраняя при этом нежную тягу на четырехглавом сухожилии. Когда блок синовиальной ткани крепится только к голени, внутрисударная жировая прокладка должна быть хорошо видна дистальной к коленной чашечке и может быть мягко отделена от сустава и передней стороны Минского. Затем разрежьте вдоль оставшейся части суставной капсулы, чтобы удалить синовиальный блок ткани и сразу же поместите его в предварительно подготовленную и помеченную шесть хорошо пластин, наполненных 1,5 миллилитров RPMI media.Когда все ткани были собраны, место двух объединились селезенки в состоянии на 70 микрометровых клеток ситечко в 15 миллилитров трубки и использовать стерильные три миллилитров шприц поршень мягко скорость тканей через сетчатый фильтр промывки ситечко часто в общей сложности шесть миллилитров RPMI 1640 средних дополнены 10% FBS. Осадок клеток центрифугации, и повторно приостановить гранулы в пяти миллилитров красных кровяных клеток лиза фугу. Через пять минут прекратите реакцию с помощью 10 миллилитров PBS и центрифуги клеток.Когда больше не наблюдаются эритроциты, повторно приостанавливайте гранулы в одном миллилитре свежего PBS для подсчета. Для обработки лимфатических узлов место все четыре лимфатических узлов на 70 микрометровых клеток ситечко в новой 15 миллилитровой трубки и использовать новый стерильный три миллилитров поршень мягко дразнить лимфатических узлов через сетку в одноклеточной подвески, а затем центрифуги клетки в 500 раз G в течение пяти минут, отказаться от супернатантных и повторно приостановить гранулы в 500 микролитров PBS для подсчета. Чтобы изолировать костный мозг, используйте ткани миг большого пальца, чтобы тщательно понять нетронутыми бедренной кости и использовать острые ножницы, чтобы отрезать самый конец проксимальной бедренной кости.Вставьте 23 калибровочной иглы в середине межкордилярной выемки бедренной кости и поверните иглу при применении мягкого давления, чтобы просверлить отверстие в выемку. Изменяя иглу по мере необходимости, промыть содержимое кости с шестью миллилитров RPMI дополнены 10%FBS на 70 микрометровых клеток ситечко на новой 15 миллилитровой трубки и использовать новый три миллилитровый шприц поршень мягко нажмите костного мозга через сетку. После этого выполните шаг РБК, как это было продемонстрировано для селезенки.Когда больше не наблюдаются эритроциты, повторно приостанавливайте гранулы в одном миллилитре свежего PBS для подсчета. Для обработки синовиальной ткани используйте тонкие хирургические ножницы, чтобы нарезать кости двух блоков синовиальной ткани на мелкие кусочки и перенести образцы в новую 15 миллилитровую трубку. Промыть контейнер для сбора с 500 микролитров среды для сбора оставшихся клеток и синовиальных тканей и вытащить мыть в трубку сбора образцов.Затем добавьте достаточный объем фермента, чтобы достичь в одной единице на миллилитр конечной концентрации и переварить образец синовиальной ткани при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе в течение двух часов ротатора. Обеспечь достаточное движение при размещении трубок в ротаторе. В конце инкубации, остановить пищеварение с восемью миллилитров RPMI дополнены 10%FBS и фильтровать подвеску клетки через 70 микрометровый ситечко клеток в новую 15 миллилитровую трубку.Промыть старую 15 миллилитровую трубку с пятью миллилитров среднего и использовать это для мытья фильтра. Затем осадок клеток центрифугации и повторного перерасхода гранул в 500 микролитров PBS для подсчета. Для выполнения жизнеспособности окрашивания изолированных иммунных клеток, добавить пять раз 10 к пяти клеткам каждой клетки подвески в соответствующие скважины двух различных 96 хорошо U-нижней пластины и собирать клетки на дно каждой скважины.Всегда включать достаточно необличенных клеток каждого типа ткани в качестве отрицательного контроля. Вымойте клетки с 200 микролитров PBS и повторно приостановить гранулы в 100 микролитров клеток в проницаемый амин реактивный краситель на колодец в течение 15 минут инкубации при четырех градусах цельсия защищены от света. В конце инкубации мыть клетки два раза в 200 микролитров буфера FACS на стирку и повторно приостановить каждую гранулу в 100 микролитров соответствующих антител интересов или контроля коктейль.Если как внутриклеточное, так и внеклеточное окрашивание проводится в одном и том же выполняют внеклеточный шаг окрашивания сейчас. После 30-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия защищены от света мыть клетки два раза с 200 микролитров буфера FACS на колодец и повторно приостановить клетки и моноцитов подмножество панели пластины в 250 микролитров буфера FACS дополнены одним миллимолярной EDTA. Проведите этот шаг только в том случае, если не планируется внутриклеточное окрашивание, в противном случае перейти к внутриклеточному окрашивания аспект протокола.Затем перенесите каждый подмножество моноцитов в соответствующую трубку FACS на льду, защищенном от света. Для межклеточного окрашивания клеток подмножества Т-клеток повторно приостанавливайте гранулы в 200 микролитров буфера фиксации от соответствующей комплекта фиксации и пермялизации для 40-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. В конце инкубации мыть клетки два раза с 200 микролитров пермяки проницаемой мыть буфера и повторно приостановить гранулы в 100 микролитров соответствующих антител интереса или контроль коктейль для 40 минут инкубации при четырех градусах Цельсия защищены от света.Затем, мыть клетки два раза в 200 микролитров пермяки мыть буфер на стирку. И повторно приостановить клетки в 250 микролитров FACS плюс буфер EDTA перед передачей образцов в соответствующие facS трубки на льду защищены от света. Здесь можно наблюдать иерархическую стратегию закрытых для моноцитов подмножество панели на иммунных клетках, собранных из костного мозга обработанных ДММ животных.Необлитаемые тролли могут быть использованы для определения истинных негативов для мертвого живого пятна и ворота могут быть скорректированы каждый раз, когда эксперимент проводится по мере необходимости. В этом репрезентативном анализе иммунные клетки были выделены из синовиальных тканей и окрашены внеклеточными маркерами поверхности, через шесть недель после операции по контролю DMM или фиктивного контроля. Более высокий процент Ly-SC положительные MHC2 отрицательные и M2 макрофаги наблюдаются в DMM обработанных животных по сравнению с популяциями клеток наблюдается в фиктивных мышей хирургии.Здесь можно наблюдать иерархическую стратегию закрытости для дополнительной и внутриклеточной Т-клеточной панели на иммунных клетках, изолированных от селезенки обработанных ДММ животных. Более высокий процент клеток TH1 наблюдается в лимфатических узлах и синовиальных тканях DMM животных, а также большее количество Т-регуляторных клеток и клеток TH17. Для обеспечения получения высококачественных образцов, ткани должны быть собраны в быстрой, тщательной и последовательной основе.После того, как иммунные клетки были изолированы, другие вниз по течению анализ может быть проведен, таких как RTPCR, клеточной культуры и отдыха на крови, чтобы пролить свет на молекулярные процессы, представляющие интерес.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Использование Количественный ПЦР в реальном времени для определения Приживление клетки-донора в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Трехмерная Tissue Culture моделью для изучения первичного костного мозга человека и его злокачественных новообразований

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Высокочастотный ультразвуковой визуализации мыши шейных лимфатических узлов

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- и проточной цитометрии на основе анализа клеточной позиции и клеточного цикла в 3D меланомы сфероидов

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Выделение и клеточная Фенотипирование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из синовиальной жидкости и костного мозга карликовых свиней

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

Лапароскопическая Техника для последовательного Сборнике печени и мезентериальных лимфоузлов макак

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Характеристика иммунных клеток в жировых тканях человека с помощью проточной цитометрии

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

База данных руководствуясь проточной цитометрии для оценки созревания миелоидных клеток костного мозга

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Нижняя телесно-положительная протектора для реабилитации остеоартрита коленного сустава

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...