Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Vi vill tacka Andrew Lim, Ph.D. och Giles Best, Ph.D. för deras hjälp med att inrätta flödescytometern. Detta projekt fick stöd av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) som tilldelats PH.

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee har godkänt alla förfaranden som nämns i detta protokoll. Möss är inhyst och omhändertaget i enlighet med Guide för vård och användning av laboratoriedjur (National Health and Medical Research Council of Australia Reviderad 2010). För alla experiment 10-12 veckor gamla, var manliga C57BL/6 möss utnyttjas.
OBS: Att inducera posttraumatiska OA, kirurgiska destabilisering av den mediala menisken (DMM) i rät...

<ol>
	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

De metoder som beskrivs i detta protokoll har utformats och testats för att på ett tillförlitligt sätt identifiera olika undergrupper från både monocyter/makrofager och T-celler inom murin mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad i en murin modell av artros (OA). Det aktuella protokollet kan enkelt modifieras för att undersöka olika vävnadstyper, eller andra celltyper genom att utbyta antikroppar, och kan användas för alternativa murinmodeller av OA. Vid testning av andra vävnadstyper är det vikt...

Artros (OA) är en försvagande och smärtsam sjukdom som involverar olika patologier av alla vävnader som är associerade med leden1. Påverkar cirka 3,8% av den globalabefolkningen 2, OA är en av de vanligaste muskuloskeletala sjukdomar och det är att bliden 4 ledande orsaken till funktionshinder i världen 20203. Posttraumatisk OA inträffar efter en ledskada och svarar för minst 12% av alla OA och upp till 25% av OA i mottagliga leder såsomknäet 4,5. Vidare ökar ledskadan livstidsrisken för OA med mer än fem gånger6. Inte alla skador med till synes liknande instabilitet kommer att fortsätta att utveckla OA, och därför definiera faktorer som driver den långsiktiga OA-risken är fortfarande utmanande. Det är avgörande för att utveckla effektiva behandlingar för att förebygga och/eller behandla posttraumatisk OA, att undersöka och bättre definiera de skadespecifika patologi, orsaker, och mekanismer som predisponerar för OA1.
OA och dess definierande brosk förstörelse var tidigare helt tillskrivas mekanisk stress och, därmed, OA ansågs vara en icke-inflammatorisk sjukdom2. Emellertid, nyare studier har visat en inflammatorisk infiltration av synovial membran och en ökning av inflammatoriska celler i synovial vävnad hos patienter med OA jämfört med friska kontroller2, sprider ljus på en inflammatorisk komponent som en potentiell drivkraft i OA. Ytterligare studier indikerade att avvikelser i både CD4+ och CD8+ T-cellprofilen samt monocyter/makrofager i det medfödda immunsystemet kan bidra till patogenesen vid OA2,7. Detaljerade undersökningar av dessa avvikelser visade relevanta roller för olika T-cell delmängder2, såsom Th18, Th29, Th178 och T reglerande (Treg)populationer 10,11. Trots detta övertygande bevis, orsakssamband mellan förändringen av T-cells svar och utveckling och progression av OA är fortfarande okänd2.
Förutom specifika T-celler som har en roll i OA, aktuella studier tyder på att differentially polariserade / aktiverade makrofager kan vara förknippade med patogenes av OA12. I synnerhet makrofager som härrör från blodmonocyter ackumuleras i synovium och polarisera till antingen klassiskt aktiverade makrofager (M1) eller alternativt aktiverade makrofager (M2) under OA utveckling, vilket innebär en korrelation mellan monocyter härledda makrofager och OA13. Däremot vissa undergrupper av makrofager befolka organ tidigt under utveckling och själv upprätthålla deras antal i en monocyt oberoende fråga14. Nyligen visades en gemensam skyddsfunktion som förmedlades av en tät korsning barriär för dessa synovial-vävnad-resident makrofager (STRMs)14. Dessa resultat tyder på att avvikelser i synnerhet makrofag delmängder kan spela en avgörande roll under utvecklingen av OA. Men, samspelet mellan denna inflammatoriska cellulära svar och de strukturella förändringarna i den gemensamma efter trauma är okänd.
Historiskt, analys av immunceller i synovialvävnaden var begränsad till immunohistokemi (IHC) eller mRNA uttryck genom omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR)närmar 15,16. Men, både IHC och RT-PCR saknar förmågan att identifiera flera olika celltyper och deras underuppsättningar samtidigt, alltså, begränsa tillämpligheten av dessa metoder. Vidare, IHC är begränsad till analys av små prover av vävnad och kan missa fokala inflammatoriska cell ansamlingar. Under de senaste åren har en myriad av ytmarkörer för olika celltyper utvecklats, och delmängder av immunceller kan nu identifieras på ett tillförlitligt sätt genom distinkta kombinationer av dessa markörer. På grund av stadiga tekniska framsteg, flöde cytometrar är nu kan identifiera en mängd olika fluorokromer samtidigt möjliggöra analys av stora multicolor antikroppar paneler.
Flödescytometri ger utredarna en kraftfull teknik som möjliggör samtidig identifiering och kvantifiering av en mängd immunceller och deras undergrupper på singelcellsnivå. Vi har utvecklat och optimerat både en extracellulär färgningsanalys för att identifiera monocyter/makrofager och deras undergrupper samt en extra/intracellulär fläckningsanalys för att identifiera T-celler och deras undergrupper inom murin mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad. Varje steg i detta protokoll var optimerad och testade resulterar i en mycket reproducerbar analys som kan utnyttjas för andra kirurgiska och icke-kirurgiska OA mus modeller17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

Artros (OA) är en av de vanligaste muskuloskeletala sjukdomar, som drabbar patienter som lider av smärta och fysiska begränsningar. Nya bevis tyder på en potentiell inflammatorisk komponent av sjukdomen, med både T-celler och monocyter/makrofager potentiellt samband med patogenesen vid OA. Ytterligare studier postulerade en viktig roll för undergrupper av både inflammatoriska cell härstamningar, såsom Th1, Th2, Th17, och T-reglerande lymfocyter, och M1, M2, och synovium-vävnad-resident makrofager. Men interaktionen mellan den lokala synovial och systemiska inflammatoriska cellulära svar och de strukturella förändringarna i leden är okänd. För att till fullo förstå hur T-celler och monocyter/makrofager bidrar mot OA är det viktigt att kunna identifiera dessa celler och deras undergrupper på ett quantitively sätt att identifiera dessa celler och deras undermängder samtidigt i synovial vävnad, sekundära lymfatiska organ och systemiskt (mjälten och benmärgen). Numera kan de olika inflammatoriska cell delmängderna identifieras genom en kombination av cell-ytan markörer gör multi-color flow cytometry en kraftfull teknik för att undersöka dessa cellulära processer. I detta protokoll beskriver vi detaljerade steg angående skörden av synovial vävnad och sekundära lymfatiska organ samt generering av single cell suspensioner. Vidare presenterar vi både en extracellulära färgning assay att identifiera monocyter/makrofager och deras undergrupper samt en extra- och intra-cellulära färgning assay att identifiera T-celler och deras undergrupper inom murin mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad. Varje steg i detta protokoll var optimerad och testade, vilket resulterar i en mycket reproducerbar analys som kan utnyttjas för andra kirurgiska och icke-kirurgiska OA mus modeller.

Representativa resultat från både monocyte undergrupp panel och T-cell delmängd panel beskrivs nedan.
Figur 1 illustrerar den hierarkiska gating-strategin för undergruppspanelen för monocyter på immunceller som samlats in från benmärg av DMM-behandlade djur. Samma strategi användes och verifierades i alla andra vävnadstyper. När du ställer in experimentet bestämdes FSC-A-spänningen (Forward Scatter Area) och SSC-A (Side Scatter Area) för varje vävn...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Här beskriver vi en detaljerad och reproducerbara flöde cytometry protokollet för att identifiera monocyte/macrophage och T-cells delmängder med hjälp av både extra- och intracellulära färgning assays inom murine mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad, utnyttja en etablerad kirurgisk modell av murine artros.

Flödescytometrianalys av immuncellsdelmängder inom Murine Mjälte, Benmärg, Lymfkörtlar och synovial vävnad i en artrosmodell

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Vårt protokoll möjliggör detaljerad identifiering och analys av monocyter och makrofager och T-celler och deras relevanta delmängder inom nervceller och ägg och olika andra vävnader i immunsystemet. Vår teknik underlättar tillförlitlig skörd av livet immunceller från synovium och andra relevanta vävnader för en omfattande karakterisering av det osteoarthtritic immunsvaret. För isolering av vävnader av intresse från en artros modell mus, med musen i ryggläge, torka bröstet, buken och benen med 70%etanol.Använd sax för att noggrant öppna huden längs mittlinjen av buken samtidigt som bukhålan är intakt. Och försiktigt dra huden på höger sida av djuret bort från den underliggande muskeln, lämnar subkutan fettvävnaden fäst vid huden. Placera musen under ett dissekerande mikroskop och använd två böjda fina tlyck för att försiktigt reta ut fettvävnaden som ligger vid låret.Efter att ha identifierat de tre korskärlen, använd fina dissekerings-forceps för att avlägsna den inguinal lymfkörtel som ligger i skärningspunkten mellan kärlen, ta hand om att inte brista kapseln. Använd tövövarna för att avlägsna det återstående fettet från lymfkörtknutans yta och öppna bukhålan. Om inget kvarvarande fett kan ses, placera lymfkörtroll omedelbart i en tidigare beredd och märkt sex väl platta fylld med 0,5 milliliter RPMI media.Härefter, öppna bukhålan. Använd fin sax för att punktskatt mjälten och att försiktigt extrahera tarmarna för att exponera stora stora stora och dess bifurkation. Placera härefter mjälten omedelbart i en tidigare beredd och märkt sex välspelade fyllda med 0,5 milliliter RPMI media.Ta bort iliaca lymfkörtdelen ligger vid terminal segmentet av buken storaorta och ursprunget till den gemensamma höftartären och försiktigt ta bort huden från båda bakbenen. Omedelbart placera lymfkörtknuten i en tidigare beredd och märkt sex väl plattan bygga med 0,5 milliliter av RPMI media pooling alla lymfkörtlar från två djur. Använda fina saxar eller en skalpell rengöra vänster lårbenet i den bifogade muskelvävnaden och försiktigt bortkopplad både kväva och höftleden, lämnar hela benet intakt samtidigt som lårbenet.Sedan placerade lårbenet i en tidigare beredd och märkt sex väl plattan fylld med 0,5 milliliter av RPMI media. Identifiera patella sena höger kväva gemensamma och använda fina saxar för att ta bort angränsande muskelvävnad proximala till gemensamma tills cirka fem milliliter quadriceps senan proximala till patella utsätts. Skär genom quadriceps senan ungefär tre till fyra millimeter proximala till patella att bilda ett handtag och använda fina kraftvärmeslag för att försiktigt dra spänningen bort från leden för att exponera kanterna på den gemensamma kapsel fastsättning.Börja med lårbenet och rör sig mot skenbenet, använd en skalpell för att försiktigt skära längs kanterna på ledkapseln på båda sidor samtidigt som en försiktig dragkraft på quadriceps sena. När det synoviala vävnadsblocket är fäst endast på skenbenet, bör den intraartikulära fettdynan vara tydligt synlig distala för patella och kan försiktigt lossna från den gemensamma och främre aspekten av Minsky. Därefter skär längs den återstående delen av ledkapseln för att ta bort det synoviala vävnadsblocket och omedelbart placera det i en tidigare beredd och märkt sex väl platta fylld med 1,5 milliliter RPMI media.När alla vävnaderna har samlats in, placera två poolade mjälte per tillstånd på en 70 mikrometer cell sil i en 15 milliliter tub och använda en steril tre milliliter spruta kolven att försiktigt massa betygsätta vävnaderna genom nätet filtret spola silen ofta med totalt sex milliliter RPMI 1640 medium kompletteras med 10%FBS. Sediment cellerna genom centrifugeringen, och åter upphäva pelleten i fem milliliter av röda blodkroppar lysis puffer. Efter fem minuter, stoppa reaktionen med 10 milliliter PBS och centrifug cellerna.När inga fler röda blodkroppar observeras, åter upphäva pelleten i en milliliter av färska PBS för räkning. För lymfkörteln bearbetning placera alla fyra lymfkörtlarna på en 70 mikrometer cell sil i en ny 15 milliliter rör och använda en ny steril tre milliliter kolven för att försiktigt retas lymfkörtlarna genom nätet i en enda cell suspension, sedan centrifugera cellerna på 500 gånger G i fem minuter, kasta supernatant och åter upphäva pelleten i 500 mikrobekantar PBS för räkning. För att isolera benmärgen, använd en vävnad tummen tärnor för att noggrant förstå intakt lårbenet och använda vassa saxar för att skära av själva änden av proximala lårbenet.Sätt in en 23 gauge nål i mitten av den intercondylar hack av lårbenet och rotera nålen samtidigt som det applicerar varsamt tryck för att borra ett hål i skåran. Byta nål vid behov, spola beninnehållet med sex milliliter RPMI kompletteras med 10%FBS på en 70 mikrometer cell sil på en ny 15 milliliter tub och använda en ny tre milliliter spruta kolven för att försiktigt trycka benmärgen genom nätet. Utför härefter RBC-steget som visats för mjälten.När inga fler röda blodkroppar observeras, åter upphäva pelleten i en milliliter av färska PBS för räkning. För bearbetning av synovialvävnaden använda fina kirurgiska saxar för att tärna de två ledvävnad block i små bitar och överföra proverna till en ny 15 milliliter rör. Skölj uppsamlingsbehållaren med 500 mikroliter medium för att samla eventuella kvarvarande celler och synovialvävnader och dra tvätten i provuppsamlingsröret.Därefter lägger en tillräcklig volym av enzym för att uppnå i en enhet per milliliter slutlig koncentration och smälta synovial vävnadsprovet vid 37 grader Celsius i en inkubator för två timmar av en rotator. Säkerställ tillräcklig rörelse när rören placeras i rotatorn. Vid slutet av inkubationen, stoppa matsmältningen med åtta milliliter RPMI kompletteras med 10%FBS och filtrera cellen suspensionen genom en 70 mikrometer cell sil till en ny 15 milliliter rör.Skölj det gamla 15 milliliterröret med fem milliliter medium och använd detta för att tvätta filtret. Sedan sediment cellerna genom centrifugeringen och resuspend pelleten i 500 mikroliter av PBS för räkning. För att utföra livsduglig färgning av de isolerade immuncellerna, tillsätt fem gånger 10 till de fem cellerna i varje cell suspension till lämpliga brunnar av två olika 96 väl U-botten plattor och samla cellerna till botten av varje brunn.Ta alltid med tillräckligt med obefläckade celler av varje vävnadstyp som negativa kontroller. Tvätta celler med 200 mikroliter pbs och åter upphäva pellets i 100 mikroliter av cell i permeant amin reaktivt färgämne per brunn för en 15 minuters inkubation vid fyra grader Celsius skyddas från ljus. I slutet av inkubationen tvätta cellerna två gånger i 200 mikroliter av FACS buffert per tvätt och åter avbryta varje pellet i 100 mikroliter av lämplig antikropp av intresse eller kontroll cocktail.Om både intra och extracellulära färgning bedrivs i samma utföra extracellulära färgning steg nu. Efter 30 minuters inkubation vid fyra grader Celsius skyddas från ljus tvätta cellerna två gånger med 200 mikroliter FACS buffert per brunn och åter avbryta cellerna och monocyte subset panelplattan i 250 mikroliter AV FACS buffert kompletteras med en millimolar EDTA. Genomföra detta steg endast om ingen intracellulär färgning planeras, annars gå vidare till intracellulära färgning aspekt av protokollet.Överför sedan varje monocyte delmängdsprov till lämpligt motsvarande FACS-rör på is som skyddas mot ljus. För intercellulär färgning av T-cells undergruppspanelcellerna, åter upphäva pellets i 200 mikroliter av fixeringsbuffert från en lämplig fixering och permeabiliseringssats för en 40 minuters inkubation vid fyra grader Celsius skyddad från ljus. I slutet av inkubationen tvätta cellerna två gånger med 200 mikroliter av permeabilisering tvätt buffert och åter upphäva pellets i 100 mikroliter av lämplig antikropp av intresse eller kontroll cocktail för en 40 minuters inkubation vid fyra grader Celsius skyddas från ljus.Sedan tvättar du cellerna två gånger i 200 mikroliter av permeabiliseringstvättbuffert per tvätt. Och åter avbryta cellerna i 250 mikroliter av FACS plus EDTA buffert innan du överför proverna till lämpliga motsvarande FACS rör på is skyddas från ljus. Här kan den hierarkiska gating strategin för monocyte undergruppspanelen på immunceller som samlats in från benmärgen av DMM behandlade djur observeras.Obefläckade troll kan användas för att bestämma de sanna negativen för de döda levande fläcken och grindarna kan justeras varje gång experimentet utförs vid behov. I denna representativa analys var immunceller isolerade från de synovial vävnader och färgas med extracellulära ytan markörer, sex veckor efter DMM eller sken kontroll kirurgi. En högre andel av Ly- SC positiva MHC2-negativa och M2-makrofager observeras hos DMM-behandlade djur jämfört med de cellpopulationer som observerats hos skenkirurgimöss.Här kan den hierarkiska gating strategin för extra och intracellulära T-cell panelen på immunceller isolerade från mjälten av DMM behandlade djur observeras. En högre andel av TH1-celler observeras i lymfkörtlarna och synovialvävnaderna hos DMM-djur samt högre antal T-regulatoriska celler och TH17-celler. För att säkerställa anskaffning av högkvalitativa prover måste vävnaderna skördas på ett snabbt, minutiöst och konsekvent sätt.När immuncellerna har isolerats, kan andra nedströms analys genomföras såsom RTPCR, cellodling och vila på blod för att lysa ett ljus på molekylära processer av intresse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Använda kvantitativ realtids-PCR för att avgöra Engraftment donatorcellen i en konkurrenskraftig Murine Bone Marrow Transplantation Modell

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flödescytometri cellbaserad analys för att detektera antikroppar till N-metyl-D-aspartat-receptor-eller dopamin-2-receptor i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

En Tredimensionell Tissue Culture modell för att studera Primary humana benmärg och dess Maligniteter

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Högfrekvent ultraljud avbildning av Mouse Cervical lymfkörtlar

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- och flödescytometri-baserad analys av cell Position och cellcykeln i 3D Melanom Sfäroider

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolering och Cellular fenotypning av mesenkymala stamceller från ledvätska och benmärgen hos minigrisar

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

Laparoskopisk teknik för Serial Insamling av lever och kröslymfknutor i makaker

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakterisering av immunceller i mänsklig fettvävnad med hjälp av flödescytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Databas-guidad-flödescytometri för utvärdering av benmärgen myeloida Cell mognad

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Den undre kroppen positivt tryck löpband för knä artros rehabilitering

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...