Name: flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Biz Andrew Lim, Ph.D. ve Giles Best, Ph.D. akış sitometre kurma yardımları için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje, PH'ye verilen Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG- HA 8481/1-1) tarafından desteklendi.

Kuzey Sidney Yerel Sağlık Bölgesi Hayvan Etik Komitesi bu protokolde belirtilen tüm prosedürleri onayladı. Fareler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak barındırılır ve bakılır (Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Revize 2010). 10-12 haftalık tüm deneylerde erkek C57BL/6 fareler kullanıldı.
NOT: Post-travmatik OA'yı indüklemek için sağ eklemde medial menisküs (DMM) cerrahi destabilizasyonu yapı...

<ol>
	<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li><li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+in+Osteoarthritis:+Alterations+and+Beyond.">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).</li><li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+major+musculoskeletal+conditions.">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li><li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+from+mouse+models+to+clinical+trials.">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li><li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention.">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li><li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis:+a+meta-analysis+of+observational+studies.">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li><li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis.">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints.">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li><li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis.">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li><li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+CD(4)(+)+CD(2)(5)(+)+Foxp(3)(+)+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis.">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li><li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-)+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane,+synovial+fluid+and+peripheral+blood.">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 16 (2), 97 (2014).</li><li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees.">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2.">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li><li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint.">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li><li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment.">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li><li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system.">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology,+treatment,+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta,+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension.">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+osteoarthritis+models+in+mice.">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li><li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis.">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice.">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts.">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li><li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain.">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18 (2019).</li></ol>

Bu protokolde tanımlanan yöntemler, minrik dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku daki monosit/makrofajve T-hücrelerinden çeşitli alt kümeleri güvenilir bir şekilde tanımlamak için tasarlanmış ve test edilmiştir . Mevcut protokol kolayca farklı doku tipleri araştırmak için değiştirilebilir, veya diğer hücre tipleri antikoralışverişi tarafından, ve OA alternatif murine modelleri için kullanılabilir. Diğer doku tipleri test edilirken, bağışıklık hücrelerinin yüzey belirte...

Osteoartrit (OA) eklem ile ilişkili tüm dokuların çeşitli patolojiler içeren zayıflatıcı ve ağrılı bir hastalıktır1. Küresel nüfusun yaklaşık% 3.8 etkileyen2,OA en yaygın kas-iskelet hastalıkları biridir ve 20203tarafından dünya çapında 4önde gelen sakatlık nedeni olmaktır. Post-travmatik OA eklem yaralanması ndan sonra ortaya çıkar ve tüm OA en az% 12 ve diz gibi duyarlı eklemlerde OA kadar% 25 için hesaplar4,5. Ayrıca, eklem yaralanması fazla beş kat6OA yaşam boyu riskini artırır. Görünüşte benzer istikrarsızlık ile tüm yaralanmalar OA geliştirmek için devam edecek, ve bu nedenle uzun vadeli OA-risk sürücü faktörler tanımlayan zorlu kalır. Travma sonrası OA'yı önlemek ve/veya tedavi etmek, yaralanmaya özgü patolojiyi, nedenleri ve OA1'eyatkın mekanizmaları araştırmak ve daha iyi tanımlamak için etkili tedaviler geliştirmek çok önemlidir.
OA ve tanımlayıcı kıkırdak yıkımı daha önce tamamen mekanik strese atfedildi ve bu nedenle, OA non-inflamatuar bir hastalık olarak kabul edildi2. Ancak, daha yeni çalışmalar sinovyal membranların inflamatuar infiltrasyon ve Sağlıklı kontroller ile karşılaştırıldığında OA olan hastalarda sinovyal dokuda inflamatuar hücrelerin bir artış göstermiştir2, OA potansiyel bir itici güç olarak inflamatuar bir bileşene ışık talan. Daha ileri çalışmalar cd4 + ve CD8 + T-hücre profili yanı sıra doğuştan gelen bağışıklık sisteminin monosit / makrofajlar anormallikleri OA 2 patogenezine katkıda bulunabileceğini göstermiştir.,7 Bu anormallikler içine ayrıntılı araştırmalar çeşitli T hücre alt kümeleri için ilgili roller ortaya2, Th18gibi 8 , Th29, Th178 ve T düzenleyici (Treg) popülasyonları10,11. Bu ikna edici kanıtlara rağmen, T-hücre yanıtlarının değiştirilmesi ile OA'nın gelişimi ve ilerlemesi arasındaki nedensel ilişki hala bilinmemektedir2.
OA'da rol alan spesifik T hücrelerine ek olarak, son çalışmalar farklıpolarize/aktive makrofajların OA12patogenezi ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Özellikle kan monositlerinden kaynaklanan makrofajlar sinovyumda birikir ve oa gelişimi sırasında klasik olarak aktive edilmiş makrofajlara (M1) veya alternatif olarak aktive makrofajlara (M2) polarize olur, bu da monosit türevi makrofajlar ile OA13arasında bir korelasyon olduğunu ima eder. Buna karşılık, makrofajlar bazı alt kümeleri gelişme sırasında erken organları doldurmak ve teksit bağımsız madde14kendi sayılarını sürdürmek. Son zamanlarda, bu sinovyal doku yerleşik makrofajlar (STRMs)14için dar bir kavşak bariyer aracılık eklem koruyucu fonksiyon gösterilmiştir. Bu bulgular, özellikle makrofaj alt kümelerinde anormalliklerin OA gelişimi sırasında önemli bir rol oynayabilir göstermektedir. Ancak, bu inflamatuar hücresel yanıt ve travma sonrasında eklem yapısal değişiklikler arasındaki etkileşimleri bilinmemektedir.
Tarihsel olarak, sinovyal dokuda bağışıklık hücrelerinin analizi ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yaklaşımlar tarafından immünohistokimya (IHC) veya mRNA ekspresyonu ile sınırlı ydı15,16. Ancak, hem IHC hem de RT-PCR aynı anda birden fazla farklı hücre türünü ve alt kümelerini belirleyebilme yeteneğine sahip değildir, böylece bu yöntemlerin uygulanabilirliğini sınırlandırmaktadır. Ayrıca, IHC doku küçük örneklerin analizi ile sınırlıdır ve fokal inflamatuar hücre birikimleri kaçırabilir. Son birkaç yıl içinde, çeşitli hücre tipleri için yüzey belirteçleri sayısız geliştirilmiştir, ve bağışıklık hücrelerinin alt kümeleri artık güvenilir bu belirteçlerin farklı kombinasyonları ile tespit edilebilir. Sürekli teknik ilerleme nedeniyle, akış sitometreler artık aynı anda büyük çok renkli antikor panelleri analizi sağlayan farklı florokromlar çok sayıda tespit yeteneğine sahiptir.
Akış sitometrisi, araştırmacılara, çok sayıda bağışıklık hücresinin ve alt kümelerinin tek hücre düzeyinde eşzamanlı olarak tanımlanmasını ve ölçülmesine olanak tanıyan güçlü bir teknik sağlar. Monositleri/makrofajları ve alt kümelerini tanımlamak için hem hücre dışı bir boyama testi geliştirdik hem de t-hücrelerini ve bunların alt kümelerini murin dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde tanımlamak için ekstra/hücre içi boyama testi geliştirdik ve optimize ettik. Bu protokolün her adımı optimize edilmiş ve diğer cerrahi ve cerrahi olmayan OA fare modelleri için kullanılabilir son derece tekrarlanabilir bir test17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131212</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain 510, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564406</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase, Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Enzyme for synovial tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564985</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562454</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>742274</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565250</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563061</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>557596</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>552775</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565480</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565261</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>740664</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563687</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563332</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>565411</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560408</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>563414</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560593</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>560600</td>
			<td>Monocyte Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>564143</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &#181;g</td>
			<td>BD</td>
			<td>562894</td>
			<td>T-Cell Panel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buffers</td>
			<td>Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Factor Buffer Set 100Tst</td>
			<td>BD</td>
			<td>562574</td>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of immune cell subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue in an osteoarthritis model

Osteoartrit (OA) en yaygın kas-iskelet sistemi hastalıklarından biridir, ağrı ve fiziksel sınırlamalar muzdarip hastaları etkileyen. Son kanıtlar, hem T-hücreleri hem de monositler/makrofajlar potansiyel olarak OA patogenezi ile ilişkili olan hastalığın potansiyel inflamatuar bileşenini göstermektedir. Daha ileri çalışmalar, Th1, Th2, Th17 ve T-düzenleyici lenfositler ve M1, M2 ve sinovyum-doku-yerleşik makrofajlar gibi her iki inflamatuar hücre soyundan alt kümeleri için önemli bir rol öne çıkar. Ancak lokal sinovyal ve sistemik inflamatuar hücresel yanıt ile eklemdeki yapısal değişiklikler arasındaki etkileşim bilinmemektedir. T-hücrelerinin ve monositlerin/makrofajların OA'ya nasıl katkıda bulunduklarını tam olarak anlamak için, bu hücreleri ve alt kümelerini aynı anda sinovyal dokuda, sekonder lenfatik organlarda ve sistemli (dalak ve kemik iliği) sayısal olarak tanımlayabilmek önemlidir. Günümüzde, farklı inflamatuar hücre alt kümeleri hücre-yüzey belirteçleri çok renkli akış sitometri bu hücresel süreçleri araştıran güçlü bir teknik yapma bir kombinasyonu ile tespit edilebilir. Bu protokolde, sinovyal doku ve sekonder lenfatik organların hasadı ve tek hücreli süspansiyonların üretimi ile ilgili ayrıntılı adımları açıklıyoruz. Ayrıca, monositleri/makrofajları ve alt kümelerini tanımlamak için hem hücre dışı bir boyama testi hem de t-hücrelerini ve bunların alt kümelerini belirlemek için ürinen dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal dokuları sinovyal dokuları sifon larını satıyoruz. Bu protokolün her adımı optimize edildi ve test edildi, diğer cerrahi ve cerrahi olmayan OA fare modelleri için kullanılabilen son derece tekrarlanabilir bir test ile sonuçlandı.

Hem monosit alt kümesi panelinin hem de T hücre alt kümesi panelinin temsil sonuçları aşağıda açıklanmıştır.
Şekil 1, DMM tedavi edilen hayvanların kemik iliğinden toplanan bağışıklık hücreleri üzerindeki monosit alt kümesi paneli için hiyerarşik gating stratejisini göstermektedir. Aynı strateji diğer tüm doku tiplerinde kullanılmış ve doğrulanmış. Deney ihcaredilirken, monosit/makrofajları tanımlamak ve T-hücreleri ve enkazl...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Burada, murine dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde hem ekstra hem de hücre içi boyama tahlilleri kullanarak monosit/makrofaj ve T hücrealt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı ve tekrarlanabilir akış sitometri protokolünü tanımladık ve murine osteoartritin yerleşik bir cerrahi modelini kullanıyoruz.

Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Protokolümüz, monositler, makrofajlar ve T-hücrelerinin ve bunların nöronlar, ovyum ve bağışıklık sisteminin çeşitli diğer dokularındaki ilgili alt kümelerinin ayrıntılı olarak tanımlanmasını ve analizini sağlar. Tekniğimiz osteoartritik immün yanıtın kapsamlı bir karakterizasyonu için sinovyum ve diğer ilgili dokulardan yaşam bağışıklık hücrelerinin güvenilir hasat kolaylaştırır. Bir osteoartrit modeli fare ilgi dokuların izolasyon için, bir supine pozisyonda fare ile, göğüs silin, karın ve bacaklar 70% etanol ile.Karın boşluğu bozulmadan bırakarak dikkatle karın orta hattı boyunca deri açmak için makas kullanın. Ve yavaşça altta yatan kas uzak hayvanın sağ tarafında deri çekin, deri altı yağ dokusu deribağlı bırakarak. Fareyi bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin ve uylukta bulunan yağ dokusunu hafifçe dışarı çıkarmak için iki kavisli ince çalgılar kullanın.Üç çapraz damarları tanımladıktan sonra, kapsül rüptürü değil dikkat, damarların kesiştiği yerde bulunan inguinal lenf düğümü kaldırmak için ince diseksiyon forseps kullanın. Lenf düğümü yüzeyinden kalan yağ kaldırmak ve karın boşluğu açmak için forseps kullanın. Kalan yağ görülemezse, daha önce hazırlanmış ve rpmi medya 0.5 mililitre ile dolu altı iyi plaka etiketli hemen lenf düğümü yerleştirin.Bundan sonra, karın boşluğu açın. Dalak çıkarmak ve hafifçe aort ve çatallanma ortaya çıkarmak için bağırsak ları ayıklamak için ince makas kullanın. Bundan sonra, daha önce hazırlanmış ve rpmi medya 0,5 mililitre dolu altı iyi oynanmış etiketli hemen dalak yerleştirin.Abdominal aort ve ortak iliak arter kökenli terminal segmentinde bulunan iliak lenf düğümü çıkarın ve dikkatle her iki arka ekstremite deri kaldırmak. Hemen daha önce hazırlanmış ve etiketli altı iyi plaka iki hayvan tüm lenf düğümleri havuza RPMI medya 0,5 mililitre ile lenf düğümü yerleştirin. Ince makas veya neşter kullanarak bağlı kas dokusunun sol uyluk temiz ve dikkatle hem stifle ve kalça eklemi kesilir, femur kaldırırken tüm kemik bozulmadan bırakarak.Daha sonra daha önce hazırlanmış ve rpmi medya 0,5 mililitre ile dolu altı kuyu plaka etiketli femur yerleştirilir. Sağ boğucu eklem patella tendonu belirleyin ve patella için quadriceps tendon proksimal yaklaşık beş mililitre maruz kalana kadar eklem bitişik kas dokusu proksimal kaldırmak için ince makas kullanın. Bir sap oluşturmak için patella yaklaşık üç ila dört milimetre proksimal quadriceps tendonu ile kesin ve hafifçe eklem kapsüle ek kenarları ortaya çıkarmak için eklem uzak gerginlik çekmek için ince forseps kullanın.Uyluk kemiği ile başlayan ve tibia doğru hareket, dikkatle quadriceps tendonu üzerinde nazik bir çekiş korurken her iki tarafta eklem kapsülü kenarları boyunca kesmek için bir neşter kullanın. Sinovyal doku bloğu sadece tibia bağlı olduğunda, intraartiküler yağ yastığı patella açıkça görülebilen distal olmalı ve hafifçe Minsky eklem ve ön kısmından ayrılabilir. Daha sonra, sinovyal doku bloğu kaldırmak için eklem kapsülü kalan kısmı boyunca kesilmiş ve hemen önceden hazırlanmış ve rpmi medya 1.5 mililitre ile dolu altı iyi plaka etiketli yerleştirin.Tüm dokular toplandığında, 15 mililitrelik bir tüpte 70 mikrometrelik hücreli süzgeç üzerine her koşul dalak başına iki havuzlu dalak yerleştirin ve steril üç mililitrelik şırınga pistonunu kullanarak süzgeçi sık sık 6 litrelik RPMI 1640 orta ve %10 FBS ile tamamlayarak sifonu temizleyen örgü filtreden dokuları yavaşça kütlehızında olarak derecelendirin. Hücreleri santrifüj le çökün ve beş mililitre kırmızı kan hücresi lisis kirpisinde peleti yeniden askıya alın. Beş dakika sonra, PBS 10 mililitre ile reaksiyonu durdurmak ve hücreleri santrifüj.Daha fazla kırmızı kan hücresi gözlenmediğinde, sayım için bir mililitre taze PBS peleti yeniden askıya alın. Lenf düğümü işleme için yeni bir 15 mililitre tüp 70 mikrometre hücresüz üzerine dört lenf düğümleri yerleştirin ve tek bir hücre süspansiyon içine örgü ile lenf düğümleri yavaşça kızdırmak için yeni bir steril üç mililitre dalgıç kullanın, sonra beş dakika için 500 kez G hücreleri santrifüj, supernatant atın ve pbs sayma için 500 mikrolitre pelet yeniden askıya. Kemik iliğini izole etmek için, sağlam femurdikkatle kavramak için bir doku başparmak forceps kullanın ve proksimal femur çok ucunu kesmek için keskin makas kullanın.Femur intercondylar çentik ortasına bir 23 gauge iğne yerleştirin ve çentik içine bir delik delmek için nazik basınç uygularken iğne döndürün. İğneyi gerektiği gibi değiştirerek, kemik içeriğini 15 mililitrelik yeni bir tüpte 70 mikrometrelik bir süzgeç üzerine %10 FBS ile tamamlayın ve kemik iliğini mesh'ten hafifçe bastırmak için yeni bir üç mililitrelik şırınga pistonu kullanın. Bundan sonra, dalak için gösterildiği gibi RBC adım ını gerçekleştirin.Daha fazla kırmızı kan hücresi gözlenmediğinde, sayım için bir mililitre taze PBS peleti yeniden askıya alın. Sinovyal doku işleme için küçük parçalar halinde iki sinovyal doku blokları zar ve yeni bir 15 mililitrelik tüp içine örnekleri aktarmak için ince cerrahi makas kullanın. Kalan hücreleri ve sinovyal dokuları toplamak ve numune toplama tüpünde yıkamayı çekmek için toplama kabını 500 mikrolitre orta ile durulayın.Daha sonra, mililitre son konsantrasyonbaşına bir birim elde etmek için yeterli miktarda enzim ekleyin ve bir rotator iki saat boyunca bir kuvözde 37 santigrat derece sinovyal doku örneği sindirmek. Tüpleri rotatora yerleştirirken yeterli hareketi sağlayın. Kuluçka sonunda, RPMI sekiz mililitre ile sindirimi durdurmak 10% FBS ile takviye ve yeni bir içine 70 mikrometre hücre süzgeçi ile hücre süspansiyon filtre.Eski 15 mililitrelik tüpü beş mililitre orta ile durulayın ve filtreyi yıkamak için kullanın. Daha sonra, santrifüj ile hücreleri tortu ve sayma için PBS 500 mikrolitre pelet resuspend. İzole bağışıklık hücrelerinin canlılık boyama gerçekleştirmek için, iki farklı 96 iyi U-alt plakalar uygun kuyulara her hücre süspansiyon beş hücreye beş kez 10 ekleyin ve her kuyunun altına hücreleri toplamak.Her zaman negatif kontroller olarak her doku tipinin yeterli lekesiz hücreleri içerir. Hücreleri 200 mikrolitre PBS ile yıkayın ve 100 mikrolitre hücredeki peletleri, ışıktan korunan dört santigrat derecede 15 dakikalık bir kuluçka için her kuyuda amin reaktif boyayla yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda yıkama başına FACS tampon 200 mikrolitre hücreleri iki kez yıkayın ve ilgi veya kontrol kokteyluygun antikor 100 mikrolitre her pelet yeniden askıya.Hem hücre içi hem de hücre dışı boyama aynı şekilde yapılırsa hücre dışı boyama adımını şimdi gerçekleştirin. Işıktan korunan 4 derece lik 30 dakikalık kuluçkadan sonra hücreleri 200 mikrolitre FACS tamponu ile iki kez yıkayın ve hücreleri ve monosit alt set panel plakasını 250 mikrolitre FACS tamponu bir milimolar EDTA ile tamamlayın. Bu adımı ancak hücre içi boyama planlanmamışsa uygulayın, aksi takdirde protokolün hücre içi boyama boyutuna geçin.Ardından, her monosit alt kümesi örneğini ışıktan korunan buz üzerinde ilgili FACS tüpüne aktarın. T hücreli alt panel hücrelerinin hücreler arası boyanması için, ışıktan korunan 40 dakikalık bir kuluçka için uygun bir fiksasyon ve permeabilizasyon kitinden 200 mikrolitre sabitleme tamponundaki peletleri yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda hücreleri 200 mikrolitre permeabilizasyon yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve peletleri 100 mikrolitrelik uygun ilgi antikorveya kontrol kokteylinde, ışıktan korunan 40 dakikalık bir kuluçka için yeniden askıya alın.Daha sonra, permeabilizasyon 200 mikrolitre yıkama başına tampon yıkama hücreleri iki kez yıkayın. Ve 250 mikrolitre FACS artı EDTA tamponundaki hücreleri yeniden askıya alarak numuneleri ışıktan korunan buz üzerindeki ilgili FACS tüplerine aktarın. Burada, DMM tedavi edilen hayvanların kemik iliğinden toplanan bağışıklık hücreleri üzerindeki monosit alt kümesi paneli için hiyerarşik gating stratejisi gözlemlenebilir.Lekesiz troller ölü canlı leke için gerçek negatifleri belirlemek için kullanılabilir ve kapılar deney gerektiği gibi yapılır her zaman ayarlanabilir. Bu temsili analizde, bağışıklık hücreleri sinovyal dokulardan izole edildi ve hücre dışı yüzey belirteçleri ile lekeli, Altı hafta Sonra DMM veya sahte kontrol cerrahisi. DMM tedavi edilen hayvanlarda, sahte cerrahi farelerde gözlenen hücre popülasyonlarına göre Ly-SC pozitif MHC2 negatif ve M2 makrofajlarının daha yüksek bir yüzdesi gözlenmektedir.Burada, DMM tedavi edilen hayvanların dalak izole bağışıklık hücreleri üzerinde ekstra ve hücre içi T-hücre paneli için hiyerarşik gating stratejisi görülebilir. DMM hayvanlarının lenf düğümleri ve sinovyal dokularının yanı sıra daha yüksek sayıda T düzenleyici hücre ve TH17 hücrelerinde TH1 hücrelerinin daha yüksek bir yüzdesi gözlenmektedir. Yüksek kaliteli numunelerin elde edilmesini sağlamak için dokuların hızlı, titiz ve tutarlı bir şekilde hasat edilmesi gerekmektedir.Bağışıklık hücreleri izole edildikten sonra, diğer downstream analizleri rtpcr, hücre kültürü ve kan üzerinde dinlenme gibi ilgi moleküler süreçleri bir ışık parlamaya yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Fare Servikal lenf nodu Yüksek frekanslı Ultrasonik Görüntüleme

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

Macaques Karaciğer ve Mezenterik lenf nodu Seri Koleksiyonu için Laparoskopik Tekniği

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Diz osteoartrit rehabilitasyonu için alt vücut pozitif basınç koşu bandı

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...