Name: induction of leptomeningeal cells modification via intracisternal injection
Uploaded: 2020-05-07T14:30:00
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この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデン癌学会、スウェーデン戦略研究財団、クヌート・オーク・アリス・ワレンベルス・スティフタース、カロリンスカ研究所(StratRegen)の幹細胞と再生医療の戦略研究プログラムからの助成金によって支えられました。

ここに提示された外科的処置は、ストックホルム・ノラ・ジュルフェルセクセティスカ・ナムントによって承認され、研究所(スウェーデンのカロリンスカ研究所)が提供する仕様に同意して実施された。
注:インタシターナル注射は、複数の研究目的に柔軟に適応することができる。R26R-tdTomato12およびCreERを担うトランスジェニックマウスラ?...

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	<li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature.">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li><li>Whish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inner+CSF-brain+barrier:+developmentally+controlled+access+to+the+brain+via+intercellular+junctions.">The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).</li><li>Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meninges+as+barriers+and+facilitators+for+the+movement+of+fluid,+cells+and+pathogens+related+to+the+rodent+and+human+CNS.">The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).</li><li>Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+morphogenic+signaling+initiated+by+the+meninges+controls+corpus+callosum+formation.">A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation.</a> Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).</li><li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation.">Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139 (3), 597-609 (2009).</li><li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+Radial+Glia-like+Cells+in+Meninges+Migrate+and+Differentiate+into+Functionally+Integrated+Neurons+in+the+Neonatal+Cortex.">Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins?.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisterna+Magna+Injection+in+Rats+to+Study+Glymphatic+Function.">Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function.</a> Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+brain:+insight+into+how+bacterial+pathogens+cross+blood-brain+barriers.">A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance.">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li><li>Slezak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+for+conditional+gene+manipulation+in+astroglial+cells.">Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells.</a> Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).</li><li>Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Neisseria+meningitidis+with+cells+of+the+human+meninges.">Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges.</a> Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).</li><li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice.">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).</li><li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis.">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).</li></ol>

ここで概説するプロトコルは、運命マッピングのためにレプトメニンゲ細胞にラベルを付ける簡単で再現可能な手順を示しています。我々は、Cx30-CreERでtdTomato蛍光レポーターの発現を誘導するために、タモキシフェンの活性代謝産物であるエンドキシフェンのインタセラシサーナル注射を使用する。R26R-tdトマトマウス12,,13.
シ?...

レプトメニンゲ細胞は、脳を重ねた薄層に組織化された線維芽細胞様集団であり、コラーゲン架橋に関与する遺伝子(例えばDcnおよびLum)を発現し、脳髄膜バリア(例えばCldn11)1、2の確立に1,含まれる。レプトメニンゲ細胞は、脳脊髄液排液3の厳密な制御から、発達中の脳44,55における神経前駆細胞の指導まで、幅広い生理機能に関与している。最近の研究では、新生児のレプトメニンジが脳のパレンチマに移行し、機能的皮質ニューロン6に発展する放射状グリア様細胞を収容する可能性が提案されている。
レプトメニンゲ細胞は、表面アストロサイトに近接して位置し、それらと共有し、ならびに他の層状アストロリア、コネキシン-30(Cx30)7の発現を共有する。7以下に概説する外科的処置は、Cx30+細胞中のtdTomatoを条件付きで発現するトランスジェニックマウスのシスターナマグナへのエンドキシフェンの1回の送達を介して、これらの髄膜細胞の広範かつ+特異的な標識を可能にする(すなわち、運命マッピングのためのCreER-loxPシステムを使用する)。エンドキシフェンはタモキシフェンの活性代謝産物であり、タモキシフェンと同じ方法でCreER発現細胞の再結合を誘導する。しかし、高濃度のエタノールの代わりに5〜10%のDMSOに溶解するため、局所適用に推奨される溶液である。さらに、エンドキシフェンは脳・髄膜バリアを越えず、それにより、基になるCx30+占星団集団の標識なしにレプトメニンゲザル細胞の特異的な組換えを可能にする(代表結果を参照)。
ここで提示される技術は、水槽のマグナへの直接アクセスを介して、手動で安全に脳脊髄液中の化合物を注入することを目的としています。頭蓋骨切除術を必要とする他のより侵襲的な手順とは異なり、このアプローチは、頭蓋骨または脳の気質に損傷を与えることなく化合物を注入することを可能にする。したがって、実質グリア細胞の活性化によって引き起こされる炎症反応の誘導とは関連しない。,88、9、109の前に記載された他の注射戦略と同様に、本アプローチは、頸部筋肉を重ね合わせた鈍解の後、システルナマグナを覆うアトラント後頭膜の外科的暴露に依存する。10しかし、他の手順とは異なり、投与中に後頭骨に対して安定化することができる先端に曲がった針の使用をお勧めします。これは、針があまりにも深く貫通し、基礎となる小脳と髄質を損傷するリスクを防ぎます。
この外科的処置は、細胞の同一性およびペラキマル層を通る移動経路の変化をマッピングすることを目的とする系統追跡調査と互換性がある。また、皮質の発達に寄与する細胞や細菌性髄膜炎,3,11の広がりなど、健康や疾患におけるレプトメニンゲ細胞の役割を調査しようとする遺伝子アブレーション研究にも適応することができる。3最後に、野生動物の蛍光トレーサーの送達と組み合わせると、脳脊髄液の動きを追跡するために利用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia unit</td>
			<td>Univentor 410</td>
			<td>8323102</td>
			<td>Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia (Isoflurane)</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>000890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Orion Pharma AB</td>
			<td>014920</td>
			<td>Commercial name Rymadil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0258.1</td>
			<td>Use silk 5-0 sutures, in alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medbond Tissue Glue</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>01370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (30G beveled needle)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Aspen Nordic</td>
			<td>520455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse head holder</td>
			<td>Narishige International</td>
			<td>SGM-4</td>
			<td>With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile absorption spears</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18105-01</td>
			<td>Sterile cotton swabs are also a good option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical separator</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears</td>
			<td>Bausch&#38;Lomb Nordic AB</td>
			<td>541760</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of leptomeningeal cells modification via intracisternal injection

ここで概説するプロトコルは、基礎となるパンキチマへの損傷のリスクを排除しながら、水槽マグナを介して溶液を安全かつ手動で注入する方法を説明しています。以前に公開されたプロトコルは、硬膜表面から最大1〜2mmに下げる必要があるストレート針を使用することをお勧めします。硬膜が穿刺されると、抵抗の急激な低下は、針を安定した位置に維持することが困難になります。私たちの方法は、代わりに、頭蓋骨の後頭部骨に対して安定させることができる先端に曲がった針を使用し、したがって、注射器が硬膜の穿孔後に組織に浸透するのを防ぎます。手順は、簡単で再現性があり、操作された動物に長続きする不快感を引き起こすものではありません。我々は、血管レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングの文脈におけるインタセラセナーナル注射戦略について述べている。さらに、神経発達におけるレプトメニンの役割の調査や細菌性髄膜炎の蔓延など、これらの現象に関連する遺伝子の遺伝的切開を通じて、幅広い研究課題に取り組むためにも利用できる。さらに、この手順は、一定の送達のための自動注入システムと組み合わせることができ、蛍光標識された分子の注入を介して脳脊髄液の動きを追跡するために使用される。

Cx30プロモーター13と誘導蛍光レポーターの下でCreERを発現するトランスジェニックマウスにおけるエンドキシフェンのインタシビサーナル注射は、皮質中の隣接するCx30発現表面およびパレンキカルアストロサイトに標識することなく、レプトメニンゲン細胞の特異的な組み換えを可能にする(図1)。システルナマグナへのアクセ?...

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Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

我々は、頭蓋骨に安定させることができる先端に曲がった針を採用するインタセラセナーナル注射を記述し、したがって、基礎となるパレンチマへの損傷のリスクを排除する。このアプローチは、レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングおよび操作や脳脊髄液の動きを追跡するために使用することができます。

インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

我々の外科的処置により、レプトメニンゲ細胞の特定の遺伝子編集は、神経発達および細菌性髄膜炎の広がりなどの多くの生理学的および病理学的状態においてその機能を研究することを可能にする。エンドキシフェンの内膜送達中の損傷を最小限に抑えるために、頭蓋骨の尾縁に対して固定できる曲げ針を利用して、組織の深部に浸透するのを防ぎます。この手順は、機能実験の喪失および利益を通じてレプトメニンゲ細胞を発現する遺伝子の役割を調査するために使用することができる。また、脳脊髄液の流れを追跡するために採用することができます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、内膜注射のための注射部位の同定に成功し、後頭部骨に対して針を固定する方法についての理解を確実にする。注射用の30ゲージのベブリング針でハミルトン注射器を準備することから始めます。鉗子を使用して、針を先端から3ミリメートル30度に曲げます。次に、10%DMSOでエンドキシフェンを1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度に希釈し、シリンジをバックフィルする。イオフルランチャンバーで動物を麻酔します。次に、マウスピースが手術用テーブルの表面から約30度の角度になるようにマウスヘッドホルダーを調整し、動物の頭部をホルダーに固定します。水槽マグナへのアクセス性を向上させるために、体の残りの部分と120度の角度を確立し、シスターナマグナへのアクセスを容易にするために首の後ろに拡張する頭を下に傾けたテーブルの表面から約30度に動物の体を配置します。動物が適切に配置されたら、眼科軟膏を塗布し、首の後ろを剃り、アルコール拭きとベタジンで地域を消毒します。手術用はさみを使用して、後頭部骨のレベルから始まり、後頭部に伸びる正中線切開を行います。水槽マグナの上に硬膜を露出させる細かい先端ピンセットで中線から横に引っ張ることによって、表面的な結合組織と首の筋肉を穏やかに分離します。小さな外科用分離器を配置して、手順全体を通して水槽マグナを可視化できるようにします。後頭部骨の尾端を特定し、以前に曲がった針をすぐ下に挿入します。硬膜が穿穿られたら、よりよい安定性を保障する動物のボディに対してシリンジを穏やかに引っ張ることによって、針の曲がった先端が表面の下に浸透することを許す。脳脊髄液の自然な流れとの干渉を避けるために、化合物をゆっくりと注入する。注射後、針を1分間中に置き、細かい先端鉗子の助けを借りて慎重に取り除きます。シアノクリレート接着剤の数滴で皮膚を閉じ、注射部位で局所麻酔薬を塗布します。動物をホルダーから取り出し、暖房パッドのきれいなケージに入れます。その後、意識を取り戻すまで動物を監視してください。Cx30プロモーターの下でCreERを発現するトランスジェニックマウスにおけるエンドキシフェンのインタビシカル注射は、誘導可能な蛍光レポーターであり、皮質中の表層アストロサイトおよびカレンキカルアストロサイトを発現する隣接するCx30に標識することなく、レプトメニンゲ細胞の特異的組み換えを可能にする。この注入プロトコルは脳脊髄液の生理学的動きを利用して、エンドキシフェン溶液がくも膜下腔全体に分布し、嗅球、皮質、小脳を重ねたレプトメニンゲ細胞を効率的に再結合する。この溶液は、脳の髄膜バリアを越えたり、口腔を通じた全身投与とは対照的に、パレンチマの星状細胞と接触したりしない。インタビシターナル注射後のレプトメニンゲザル細胞の再結合は、Gfapを発現する表面および層状のアストロサイトが標識されていないままである一方でPdgfr-α反応性を通じて同定された。この実験を試みる際には、インタビシナーリナルデリバリー用の注射部位を見つけることが重要である。この視覚的なデモンストレーションは、その下の神経組織を損傷するリスクを最小限に抑えながら、手順を実行するための技術的なノウハウを提供します。この技術を用いて遺伝子切り替え研究を行い、コルチコ形成におけるレプトメニンゲ細胞の役割と脳脊髄液形成の調節を調べ、くも膜下腔内の細菌を広げるための追加部位を同定することができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

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デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

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網膜下腔にアクセスするための代替と検証済みの注入方法<i&gt;経由で</i&gt;経強後方アプローチ

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

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動脈内血圧モニタリングと気管切開による換気を用いたマウスの脳死誘導

While both living donation and donation after circulatory death provide alternative opportunities for organ transplantation, donation after donor brain ...

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成人ゼブラフィッシュを用いた学習・記憶研究における認知評価のための連想学習ツールとしてのシャトルボックスアッセイ

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

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