Name: induction of leptomeningeal cells modification via intracisternal injection
Uploaded: 2020-05-07T14:30:00
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Este estudo foi apoiado por subsídios do Conselho Sueco de Pesquisa, da Sociedade Sueca de Câncer, da Fundação Sueca de Pesquisa Estratégica, de Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse e do Programa de Pesquisa Estratégica em Células-Tronco e Medicina Regenerativa do Instituto Karolinska (StratRegen).

Os procedimentos cirúrgicos apresentados foram aprovados pela Estocolmo Norra Djurförsöksetiska Nämnd e realizados de acordo com as especificações fornecidas pelo instituto de pesquisa (Instituto Karolinska, Suécia).
NOTA: A injeção intracisternal pode ser adaptada de forma flexível para múltiplos fins de pesquisa. Apresentamos abaixo um procedimento desenvolvido para rotular eficientemente as células leptomeningeais para mapeamento do destino com base na injeção...

<ol>
	<li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature.">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li><li>Whish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inner+CSF-brain+barrier:+developmentally+controlled+access+to+the+brain+via+intercellular+junctions.">The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).</li><li>Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meninges+as+barriers+and+facilitators+for+the+movement+of+fluid,+cells+and+pathogens+related+to+the+rodent+and+human+CNS.">The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).</li><li>Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+morphogenic+signaling+initiated+by+the+meninges+controls+corpus+callosum+formation.">A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation.</a> Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).</li><li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation.">Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139 (3), 597-609 (2009).</li><li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+Radial+Glia-like+Cells+in+Meninges+Migrate+and+Differentiate+into+Functionally+Integrated+Neurons+in+the+Neonatal+Cortex.">Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins?.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisterna+Magna+Injection+in+Rats+to+Study+Glymphatic+Function.">Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function.</a> Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+brain:+insight+into+how+bacterial+pathogens+cross+blood-brain+barriers.">A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance.">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li><li>Slezak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+for+conditional+gene+manipulation+in+astroglial+cells.">Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells.</a> Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).</li><li>Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Neisseria+meningitidis+with+cells+of+the+human+meninges.">Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges.</a> Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).</li><li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice.">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).</li><li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis.">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).</li></ol>

O protocolo aqui descrito apresenta um procedimento simples e reprodutível para rotular células leptomeningeais para mapeamento do destino. Utilizamos injeção intracisternal de endoxifen, um metabólito ativo de Tamoxifen, para induzir a expressão do repórter fluorescente tdTomato em Cx30-CreER; Ratos R26R-tdTomato12,13.
Em comparação com outros protocolos usados para obter acesso ao fluido cefalorraquidiano através da cistern...

As células leptomeningeais são uma população de células semelhantes ao fibroblasto organizadas em uma camada fina sobrepondo o cérebro e expressando genes implicados na crosslinking de colágeno (por exemplo, Dcn e Lum),e no estabelecimento de uma barreira cérebro-meningeal (por exemplo, Cldn11)1,2. As células leptomenínias estão implicadas em uma ampla gama de funções fisiológicas, desde o controle rigoroso sobre a drenagem do fluido cefalorraquidiano3 até a orientação de progenitores neurais no cérebro em desenvolvimento4,5. Um estudo recente também propôs que as leptomeninges no recém-nascido podem abrigar células radiais semelhantes à glia que migram para o parênquima cerebral e se desenvolvem em neurônios corticais funcionais6.
As células leptomenínias estão localizadas próximas aos astrócitos superficiais e compartilham com elas, assim como outras astroglias parênquias, expressão de connexin-30 (Cx30)7. O procedimento cirúrgico descrito abaixo permite a rotulagem generalizada e específica dessas células meningeais através de uma entrega única de endoxifen na cisterna magna de camundongos transgênicos expressando condicionalmente tdTomato em células Cx30+ (ou seja, usando um sistema CreER-loxP para mapeamento do destino). O endoxifen é um metabólito ativo do Tamoxifen e induz a recombinação de células expressas por CreER da mesma forma que o Tamoxifen. É, no entanto, a solução recomendada para aplicação tópica porque se dissolve em 5-10% DMSO, em vez de altas concentrações de etanol. Além disso, o endoxifen não atravessa a barreira cérebro-meningeal, permitindo assim uma recombinação específica de células leptomeningeais, sem rotular a população cx30+ astroglial subjacente (ver Resultados Representativos).
A técnica aqui apresentada visa injetar manual e seguramente o composto no fluido cefalorraquidiano, via acesso direto à cisterna magna. Ao contrário de outros procedimentos mais invasivos que requerem craniotomia, esta abordagem permite infundir compostos sem causar danos ao crânio ou ao parequima cerebral. Assim, não está associada à indução de reações inflamatórias desencadeadas pela ativação de células glia parenquiais. Semelhante a outras estratégias de injeção descritas antesde 8,9,10, a abordagem presente baseia-se na exposição cirúrgica da membrana dural atlanto-occipital que cobre a cisterna magna, após dissecção contundente dos músculos do pescoço sobreposto. No entanto, ao contrário de outros procedimentos, recomendamos o uso de uma agulha dobrada na ponta, que pode ser estabilizada contra o osso occipital durante a administração. Isso evitará que a agulha penetre muito fundo e prejudique o cerebelo subjacente e a medula.
Este procedimento cirúrgico é compatível com investigações de rastreamento de linhagem que visam mapear mudanças nas identidades celulares e rotas migratórias através de camadas parêmicas. Também pode ser adaptado a estudos de ablação genética que pretendem sondar o papel das células leptomeningeais na saúde e na doença, como sua contribuição para o desenvolvimento cortical5 ou a disseminação da meningite bacteriana3,11. Finalmente, pode ser utilizado para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano quando combinado com a entrega de rastreadores fluorescentes em animais do tipo selvagem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia unit</td>
			<td>Univentor 410</td>
			<td>8323102</td>
			<td>Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia (Isoflurane)</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>000890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Orion Pharma AB</td>
			<td>014920</td>
			<td>Commercial name Rymadil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0258.1</td>
			<td>Use silk 5-0 sutures, in alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medbond Tissue Glue</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>01370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (30G beveled needle)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Aspen Nordic</td>
			<td>520455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse head holder</td>
			<td>Narishige International</td>
			<td>SGM-4</td>
			<td>With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile absorption spears</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18105-01</td>
			<td>Sterile cotton swabs are also a good option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical separator</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears</td>
			<td>Bausch&#38;Lomb Nordic AB</td>
			<td>541760</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of leptomeningeal cells modification via intracisternal injection

O protocolo aqui descrito descreve como injetar soluções com segurança e manualmente através da cisterna magna, eliminando o risco de danos ao parnchyma subjacente. Protocolos publicados anteriormente recomendam o uso de agulhas retas que devem ser reduzidas a um máximo de 1-2 mm da superfície dural. A queda repentina da resistência uma vez perfurada a membrana dural dificulta a manutenção da agulha em posição constante. Nosso método, em vez disso, emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada contra o osso occipital do crânio, impedindo assim que a seringa penetre no tecido após perfuração da membrana dural. O procedimento é simples, reproduzível e não causa desconforto duradouro nos animais operados. Descrevemos a estratégia de injeção intracisternal no contexto do mapeamento do destino genético das células leptomenínias vasculares. A mesma técnica pode, além disso, ser utilizada para abordar uma ampla gama de questões de pesquisa, como sondar o papel das leptomeninges no neurodesenvolvimento e a disseminação da meningite bacteriana, através da ablação genética de genes putativamente implicados nesses fenômenos. Além disso, o procedimento pode ser combinado com um sistema de infusão automatizado para uma entrega constante e usado para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano através da injeção de moléculas rotuladas fluorescentes.

A injeção intracisternal de endoxidos em camundongos transgênicos que expressam CreER sob o promotor Cx3013 e um repórter fluorescente induível permite uma recombinação específica de células leptomenínias sem rotular a superfície de expressão cx30 e os astrócitos parêmicos no córtex(Figura 1). Para ter acesso à cisterna magna, o animal anestesiado é posicionado com seu corpo e sua cabeça em um ângulo de aproximadamen...

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Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

Descrevemos uma injeção intracisternal que emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada no crânio, eliminando assim o risco de dano ao parênquima subjacente. A abordagem pode ser usada para mapeamento do destino genético e manipulações de células leptomeningeais e para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano.

Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

Nosso procedimento cirúrgico permite a edição específica de genes de células leptomeningeais para estudar sua função em muitas condições fisiológicas e patológicas, como o neurodesenvolvimento e a disseminação de meningite bacteriana. Para minimizar os danos durante a entrega intracisternal do endoxifen, utilizamos uma agulha dobrada que pode ser presa contra a borda caudal do crânio para evitar que penetrá-lo penetrasse mais fundo no tecido. O procedimento pode ser usado para sondar o papel dos genes que expressam células leptomeningeais através da perda e ganho de experimentos de função.Também pode ser adotado para rastrear o fluxo de fluidos cefalorraquidianos. A demonstração visual deste método garantirá a identificação bem sucedida do local de injeção para injeção intracisternal e a compreensão sobre como fixar a agulha contra o osso occipital. Comece preparando uma seringa Hamilton com uma agulha chanfrada calibre 30 para injeção.Use fórceps para dobrar a agulha a 30 graus três milímetros da ponta. Em seguida, diluir o endoxifen em 10% DMSO a uma concentração de um miligrama por mililitro e enchir a seringa. Anestesiar o animal na câmara isoflurane.Em seguida, ajuste o suporte da cabeça do mouse para que o bocal esteja aproximadamente em um ângulo de 30 graus da superfície da mesa cirúrgica e fixe a cabeça do animal no suporte. Para melhorar a acessibilidade à cisterna magna, posicione o corpo do animal a aproximadamente 30 graus da superfície da mesa com a cabeça inclinada para baixo, o que estabelecerá um ângulo de 120 graus com o resto do corpo e estenderá a parte de trás do pescoço para facilitar o acesso à cisterna magna. Uma vez que o animal esteja devidamente posicionado, aplique pomada oftalmica, raspe a parte de trás do pescoço e higienize a área com lenços umedecidos e Betadine.Use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão midline começando ao nível do osso occipital e estendendo-se posteriormente. Separe suavemente o tecido conjuntivo superficial e os músculos do pescoço puxando para os lados da linha média com pinças finas de ponta que exporão a membrana dural sobre a cisterna magna. Posicione um pequeno separador cirúrgico para permitir a visualização da cisterna magna durante todo o procedimento.Identifique a extremidade caudal do osso occipital e insira a agulha anteriormente dobrada imediatamente por baixo. Uma vez perfurada a dura, permita que a ponta dobrada da agulha penetre sob a superfície puxando suavemente a seringa para cima e paralelamente ao corpo do animal, o que garantirá melhor estabilidade. Injete o composto lentamente para evitar interferências no fluxo natural do fluido cefalorraquidiano.Após a injeção, deixe a agulha descansar por dentro por um minuto e, em seguida, remova-a cuidadosamente com a ajuda de fórceps finos. Feche a pele com algumas gotas de adesivo de cianoacrilato e aplique anestésico local no local da injeção. Retire o animal do suporte e coloque-o em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento.Em seguida, certifique-se de monitorar o animal até que ele recupere a consciência. Injeção intracisternal de endoxifen em camundongos transgênicos expressando CreER sob o promotor Cx30, um repórter fluorescente indutível permite uma recombinação específica de células leptomeningeais sem rotular o vizinho Cx30 expressando astrócitos superficiais e astrócitos parenchímicos no córtex. Este protocolo de injeção aproveita o movimento fisiológico do fluido cefalorraquidiano para que a solução de endoxifen seja distribuída por todo o espaço subaracnóide para recombinar eficientemente as células leptomeningeais que sobrepõem as lâmpadas olfativas, córtex e cerebelo.A solução não atravessa a barreira meningeal cerebral ou entra em contato com células astrogliais do parenchyma em oposição à administração sistêmica através de gavage oral. A recombinação das células leptomeningeais após a injeção intracisternal foi identificada através da reatividade Pdgfr-alfa, enquanto os astrócitos superficiais e parenchímicos que expressavam Gfap permaneceram sem rótulo. Ao tentar este experimento, é importante localizar o local de injeção para entrega intracisternal.Esta demonstração visual fornece o know-how técnico para realizar o procedimento, minimizando o risco de danificar o tecido neural sob ele. Estudos de ablação genética podem ser realizados com essa técnica para investigar o papel das células leptomeningeais na corticogênese e regulação da formação de fluidos cefalorraquidianos e identificar locais adicionais para disseminação de bactérias no espaço subaracnóide.

Research

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Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

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