Name: induction of leptomeningeal cells modification via intracisternal injection
Uploaded: 2020-05-07T14:30:00
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Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Sueco de Investigación, la Sociedad Sueca contra el Cáncer, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse y el Programa de Investigación Estratégica en Células Madre y Medicina Regenerativa en Karolinska Institutet (StratRegen).

Los procedimientos quirúrgicos presentados por la presente fueron aprobados por Stockholms Norra Djurf-rs-ksetiska N'mnd y llevados a cabo de acuerdo con las especificaciones proporcionadas por el Instituto de Investigación (Instituto Karolinska, Suecia).
NOTA: La inyección intracisternal se puede adaptar de forma flexible para múltiples fines de investigación. A continuación presentamos un procedimiento desarrollado para etiquetar eficientemente las células leptomening...

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	<li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature.">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li><li>Whish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inner+CSF-brain+barrier:+developmentally+controlled+access+to+the+brain+via+intercellular+junctions.">The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).</li><li>Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meninges+as+barriers+and+facilitators+for+the+movement+of+fluid,+cells+and+pathogens+related+to+the+rodent+and+human+CNS.">The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).</li><li>Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+morphogenic+signaling+initiated+by+the+meninges+controls+corpus+callosum+formation.">A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation.</a> Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).</li><li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation.">Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139 (3), 597-609 (2009).</li><li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+Radial+Glia-like+Cells+in+Meninges+Migrate+and+Differentiate+into+Functionally+Integrated+Neurons+in+the+Neonatal+Cortex.">Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins?.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisterna+Magna+Injection+in+Rats+to+Study+Glymphatic+Function.">Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function.</a> Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).</li><li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents.">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes,+including+amyloid+beta.">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+brain:+insight+into+how+bacterial+pathogens+cross+blood-brain+barriers.">A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance.">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li><li>Slezak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+for+conditional+gene+manipulation+in+astroglial+cells.">Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells.</a> Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).</li><li>Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Neisseria+meningitidis+with+cells+of+the+human+meninges.">Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges.</a> Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).</li><li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice.">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).</li><li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis.">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).</li></ol>

El protocolo descrito aquí presenta un procedimiento sencillo y reproducible para etiquetar células leptomeningeal es para la cartografía del destino. Utilizamos la inyección intracisternal de endoxifeno, un metabolito activo de tamoxifeno, para inducir la expresión del reportero fluorescente tdTomato en Cx30-CreER; R26R-tdTomato ratones12,13.
En comparación con otros protocolos utilizados para acceder al líquido cefalorraquíde...

Las células leptomeningeales son una población similar a los fibroblastos de células organizadas en una capa delgada que superpone el cerebro y expresa genes implicados en la reticulación de colágeno (por ejemplo, Dcn y Lum),y en el establecimiento de una barrera cerebro-meningeal (por ejemplo, Cldn11)1,2. Las células leptomeningeales están implicadas en una amplia gama de funciones fisiológicas, desde un estricto control sobre el drenaje del líquido cefalorraquídeo3 hasta la guía de progenitores neuronales en el cerebro en desarrollo4,5. Un estudio reciente también ha propuesto que los leptomeninges en el recién nacido pueden albergar células radiales similares a la glia que migran al parénquima cerebral y se convierten en neuronas corticales funcionales6.
Las células leptomeningeales se encuentran muy cerca de los astrocitos de superficie y comparten con ellos, así como otras astroglia parenquimales, expresión de connexina-30 (Cx30)7. El procedimiento quirúrgico descrito a continuación permite un etiquetado generalizado y específico de estas células meningeales a través de una entrega única de endoxifeno en la cisterna magna de ratones transgénicos que expresan condicionalmente tdTomato en Cx30+ células (es decir, utilizando un sistema CreER-loxP para la cartografía del destino). Endoxifeno es un metabolito activo de tamoxifeno e induce la recombinación de células que expresan CreER de la misma manera que el tamoxifeno. Es, sin embargo, la solución recomendada para la aplicación tópica porque se disuelve en 5-10% DMSO, en lugar de altas concentraciones de etanol. Además, el endoxifeno no cruza la barrera cerebro-meningeal, lo que permite una recombinación específica de células leptomeningeales, sin etiquetado de la población subyacente Cx30+ astroglial (ver Resultados Representativos).
La técnica presentada aquí tiene como objetivo inyectar manual y segura mente el compuesto en el líquido cefalorraquídeo, a través del acceso directo a la cisterna magna. A diferencia de otros procedimientos más invasivos que requieren craneotomía, este enfoque permite infundir compuestos sin causar daño al cráneo o al parénquima cerebral. Por lo tanto, no se asocia con la inducción de reacciones inflamatorias desencadenadas por la activación de células de la glia parenquimal. Similar a otras estrategias de inyección descritas antesde 8,9,10, el enfoque actual se basa en la exposición quirúrgica de la membrana dural atlanto-occipital que cubre la cisterna magna, después de la disección contundente de los músculos del cuello superpuestos. Sin embargo, a diferencia de otros procedimientos, recomendamos el uso de una aguja doblada en la punta, que se puede estabilizar contra el hueso occipital durante la administración. Esto evitará el riesgo de que la aguja penetre demasiado profundo y dañe el cerebelo subyacente y la médula.
Este procedimiento quirúrgico es compatible con las investigaciones de rastreo de linaje que apuntan a mapear los cambios en las identidades celulares y las rutas de migración a través de capas parénquimas. También se puede adaptar a estudios de ablación genética que pretenden investigar el papel de las células leptomeningeales en la salud y la enfermedad, como su contribución al desarrollo cortical5 o la propagación de la meningitis bacteriana3,11. Finalmente, se puede utilizar para rastrear el movimiento del líquido cefalorraquídeo cuando se combina con la entrega de marcadores fluorescentes en animales de tipo salvaje.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia unit</td>
			<td>Univentor 410</td>
			<td>8323102</td>
			<td>Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia (Isoflurane)</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>000890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Orion Pharma AB</td>
			<td>014920</td>
			<td>Commercial name Rymadil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0258.1</td>
			<td>Use silk 5-0 sutures, in alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medbond Tissue Glue</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>01370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (30G beveled needle)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Aspen Nordic</td>
			<td>520455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse head holder</td>
			<td>Narishige International</td>
			<td>SGM-4</td>
			<td>With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile absorption spears</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18105-01</td>
			<td>Sterile cotton swabs are also a good option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical separator</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears</td>
			<td>Bausch&#38;Lomb Nordic AB</td>
			<td>541760</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of leptomeningeal cells modification via intracisternal injection

El protocolo descrito aquí describe cómo inyectar soluciones de forma segura e manual a través de la cisterna magna, al tiempo que se elimina el riesgo de daño al parénquima subyacente. Los protocolos publicados anteriormente recomiendan el uso de agujas rectas que deben reducirse a un máximo de 1-2 mm de la superficie dura. La caída repentina de la resistencia una vez perforada la membrana dura hace que sea difícil mantener la aguja en una posición estable. Nuestro método, en cambio, emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar contra el hueso occipital del cráneo, evitando así que la jeringa penetre en el tejido después de la perforación de la membrana dural. El procedimiento es sencillo, reproducible y no causa molestias duraderas en los animales operados. Describimos la estrategia de inyección intracisternal en el contexto de la cartografía genética del destino de las células leptomeningeales vasculares. La misma técnica puede, además, utilizarse para abordar una amplia gama de cuestiones de investigación, como el sondeo del papel de los leptomeninges en el neurodesarrollo y la propagación de la meningitis bacteriana, a través de la ablación genética de genes implicados putativamente en estos fenómenos. Además, el procedimiento se puede combinar con un sistema de perfusión automatizado para un parto constante y se utiliza para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo a través de la inyección de moléculas etiquetadas fluorescentesmente.

La inyección intracisternal de endoxifeno en ratones transgénicos que expresaN CreER bajo el promotor Cx3013 y un reportero fluorescente inducible permite una recombinación específica de células leptomeningeales sin etiquetar la superficie vecina de expresión Cx30 y los astrocitos parénquimas en la corteza(Figura 1). Con el fin de acceder a la cisterna magna, el animal anestesiado se coloca con su cuerpo y su cabeza en un ángul...

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Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

Describimos una inyección intracisternal que emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar en el cráneo, eliminando así el riesgo de daño al parénquima subyacente. El enfoque se puede utilizar para la cartografía genética del destino y manipulaciones de células leptomeningeales y para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo.

Inducción de células leptomeningeales Modificación a través de inyección intraciternal

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

Nuestro procedimiento quirúrgico permite la edición genética específica de las células leptomeningeales para estudiar su función en muchas condiciones fisiológicas y patológicas como el neurodesarrollo y la propagación de la meningitis bacteriana. Para minimizar el daño durante la entrega intracisternal de endoxifeno, utilizamos una aguja doblada que se puede asegurar contra el borde caudal del cráneo para evitar que penetre más profundamente en el tejido. El procedimiento se puede utilizar para sondear el papel de los genes que expresan las células leptomeningeales a través de la pérdida y ganancia de experimentos de función.También se puede adoptar para rastrear el flujo de líquido cefalorraquídeo. La demostración visual de este método garantizará la identificación exitosa del lugar de inyección para la inyección intracisterna y la comprensión de cómo fijar la aguja contra el hueso occipital. Comience preparando una jeringa Hamilton con una aguja biselada de calibre 30 para inyección.Utilice fórceps para doblar la aguja a 30 grados tres milímetros de la punta. A continuación, diluir el endoxifeno en 10%DMSO a una concentración de un miligramo por mililitro y rellenar la jeringa. Anesthetizar al animal en la cámara de isoflurano.A continuación, ajuste el soporte de la cabeza del ratón para que la boquilla esté aproximadamente en un ángulo de 30 grados desde la superficie de la mesa quirúrgica y fije la cabeza del animal en el soporte. Para mejorar la accesibilidad a la cisterna magna, posiciona el cuerpo del animal a unos 30 grados desde la superficie de la mesa con la cabeza inclinada hacia abajo que establecerá un ángulo de 120 grados con el resto del cuerpo y extenderá la parte posterior del cuello para facilitar el acceso a la cisterna magna. Una vez que el animal esté correctamente posicionado, aplicar pomada oftálmica, afeitarse la parte posterior de su cuello y desinfectar la zona con toallitas de alcohol y Betadine.Utilice tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de línea media comenzando a nivel del hueso occipital y extendiéndose posteriormente. Separe suavemente el tejido conectivo superficial y los músculos del cuello tirando hacia los lados de la mitad con pinzas de punta fina que expondrán la membrana dural que sobrevuela la cisterna magna. Coloque un pequeño separador quirúrgico para permitir la visualización de las cisternas magna a lo largo del procedimiento.Identifique el extremo caudal del hueso occipital e inserte la aguja previamente doblada inmediatamente debajo. Una vez perforada la dura, deje que la punta doblada de la aguja penetre debajo de la superficie tirando suavemente de la jeringa hacia arriba y paralela al cuerpo del animal, lo que asegurará una mejor estabilidad. Inyecte el compuesto lentamente para evitar interferencias con el flujo natural del líquido cefalorraquídeo.Después de la inyección, deje reposar la aguja dentro durante un minuto y, a continuación, retírela cuidadosamente con la ayuda de fórceps de punta fina. Cierre la piel con unas gotas de adhesivo de cianoacrilato y aplique anestesia local en el lugar de la inyección. Retire el animal del soporte y colóquelo en una jaula limpia sobre una almohadilla calefactora.Luego asegúrese de monitorear al animal hasta que recupere la conciencia. La inyección intracisterna de endoxifeno en ratones transgénicos que expresa CreER bajo el promotor Cx30, un reportero fluorescente inducible permite la recombinación específica de células leptomeningeales sin etiquetar a los vecinos Cx30 que expresan astrocitos superficiales y astrocitos parénquimales en la corteza. Este protocolo de inyección aprovecha el movimiento fisiológico del líquido cefalorraquídeo para que la solución de endoxifeno se distribuya por todo el espacio subaracnoideo para recombinar eficientemente las células leptomeningeales superponiendo las bombillas olfativas, la corteza y el cerebelo.La solución no cruza la barrera meningeal cerebral ni entra en contacto con células astrogliales del parénquima en comparación con la administración sistémica a través de la gavage oral. La recombinación de células leptomeningeales después de la inyección intracisternal se identificó a través de la reactividad de Pdgfr-alfa, mientras que los astrocitos superficiales y parenquimales que expresaban Gfap permanecieron sin etiquetar. Al intentar este experimento, es importante localizar el lugar de inyección para la administración intracisternal.Esta demostración visual proporciona el conocimiento técnico para llevar a cabo el procedimiento mientras minimiza el riesgo de dañar el tejido neural debajo de él. Los estudios de ablación génica se pueden realizar con esta técnica para investigar el papel de las células leptomeningeales en la corticogénesis y la regulación de la formación de líquido cefalorraquídeo y para identificar sitios adicionales para la propagación de bacterias en el espacio subaracnoideo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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