Name: high throughput yeast strain phenotyping with droplet-based rna sequencing
Uploaded: 2020-05-21T14:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing at JoVE.com

Ce projet a été soutenu par le National Science Foundation Career Award DBI-1253293, national Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 et la subvention R01HG008978, la National Science Foundation Technology Center subvention DBI-1548297, et l’UCSF Center for Cellular Construction. ARA et ZJG sont des enquêteurs de Chan-Zuckerberg Biohub.

1. Fabrication d’appareils microfluidiques
<ol><li>Su-8 master fabrication<ol>
<li>Concevez le masque négatif pour les canaux microfluidiques pour les appareils A et B(Fichier supplémentaire 1 et 2) à l’aide d’un logiciel de conception assisté par ordinateur et faites-les imprimer sur le film de circuit avec au moins 10 m de résolution.</li>
		<li>Placez une plaquette de silicium propre de 75 mm sur un manteau de rotation et versez environ 1 ml de SU-8 sur son centre. Allumez le vide pour fixer la plaquette au mandrin.</li>
		<li>Pour l’appareil A, manteau de spin SU-8 2150 à 500 tr/min pour 30 s, suivi de 30 s à 2 750 tr/min. Pour l’appareil B, spin-coat SU-8 2100 à 500 tr/min pour 30 s, suivi de 30 s à 2 500 tr/min. Cela donnera DES couches d’épaisseur SU-8 de 200 m et 120 m, respectivement.</li>
		<li>Retirer la plaquette du spin-coater et les déposer sur une plaque chauffante à 95 oC pendant 60 minutes au four mou.</li>
		<li>Retirer la plaquette de la plaque chauffante et laisser refroidir à température ambiante. Placez le masque sur la plaquette, et exposez sous un collimateur 190 mW, 365 nm UV LED pendant 2 min.</li>
		<li>Déposer la plaquette sur une plaque chauffante fixée à 95 oC pendant 5 minutes pour la cuisson par postexposure.</li>
		<li>Retirer la plaquette et laisser refroidir à température ambiante. Placer la plaquette dans un bain d’acétate d’éther de monomethyl de propylène glycol (PGMEA) pendant 20 min.</li>
		<li>Rincer la plaquette avec PGMEA suivie de l’isopropanol. Si des résidus opaques sont visibles au cours de ce processus, répétez le rinçage avec PGMEA et isopropanol. Aérer la plaquette.</li>
		<li>Placer la plaquette sur une plaque chauffante à 95 oC pendant 3 min.</li>
		<li>Retirer et placer la plaquette dans un plat Petri de 90 mm de diamètre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Moudimethylsiloxane (PDMS) coulée sur le maître SU-8<ol>
<li>Mélanger ensemble un rapport de masse de 10:1 de base en silicone à l’agent de durcissement. Degas le PDMS après le mélange pendant environ 30 min.</li>
		<li>Verser le PDMS dégazé sur le maître SU-8 jusqu’à ce qu’au moins une couche de 5 mm d’épaisseur soit formée au-dessus de la plaquette.</li>
		<li>Degas le PDMS sur le dessus de la plaquette pendant environ 30 min.</li>
		<li>Placer la plaquette dans un four à 65 oC pendant au moins 80 minutes pour guérir le PDMS.</li>
		<li>Découpez la dalle PDMS guérie de la plaquette.</li>
		<li>Placez la dalle PDMS avec les caractéristiques microfluidiques orientées vers le haut, et perforez les trous d’entrée et de sortie avec un poinçon de biopsie de 0,75 mm.</li>
		<li>Nettoyez une glissière en verre de 50 mm x 75 mm avec de l’isopropanol et retirez toute la poussière du côté microfluidique de la dalle PDMS avec du ruban adhésif.</li>
		<li>Exposez la glissière en verre nettoyée et la dalle PDMS avec les caractéristiques microfluidiques face à jusqu’à 100 Pa (1 mbar O2) plasma pendant 1 min.</li>
		<li>Placez la dalle PDMS avec les caractéristiques face vers le bas sur la glissière en verre pour permettre la liaison. Placer la lame dans un four à 65 oC pendant au moins 30 minutes pour compléter la liaison.</li>
		<li>Traiter tous les canaux microfluidiques en rinçant avec un liquide de traitement de surface fluoré. Cuire l’appareil dans un four à 65 oC pendant au moins 10 minutes pour évaporer le liquide.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Encapsulation de levure dans les hydrogels utilisant l’appareil A
<ol><li>Prenez la levure de plus en plus dans une culture de suspension et compter sur un hémocytomètre.</li>
	<li>Résuspendez les cellules dans le phosphate tamponné saline (PBS) à une concentration d’environ 750 k/mL. Cela garantit que 30% des hydrogels auront une cellule de levure en eux. Seulement environ la moitié des cellules de levure se développent en colonies, ce qui conduit à 15 % des hydrogels contenant des colonies de levures.</li>
	<li>Mélanger l’agarose ultralow de point de fusion à 2 % w/v dans PBS et chauffer à 90 oC jusqu’à ce qu’elle soit fondue. Cela prend 10 min.</li>
	<li>Charger le mélange d’agarose dans une seringue avec un filtre attaché de 0,22 m dans une pompe à seringue devant le chauffe-espace fixé à 80 oC.</li>
	<li>Chargez une seringue remplie de la suspension de levure et une seringue contenant de l’huile fluorée avec 2% w/v fluorosurfactant ionique18 dans des pompes à seringues.</li>
	<li>Prenez le dispositif de fractionnement de goutte de coflow fait dans la section 1 et connectez le tube des seringues dans l’appareil. Guidez le tube de la sortie dans un tube conique de 15 ml dans un seau à glace pour la collecte des gouttes.</li>
	<li>Flux dans les trois solutions dans l’appareil avec les débits suivants:<ol>
<li>Flux de la suspension de levure avec le débit de 3 ml/h.</li>
		<li>Flux le mélange d’agarose à un débit de 3 ml/h.</li>
		<li>Écoulez l’huile fluorée à un débit de 15 ml/h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir environ 1 mL d’émulsion. Attendez 5 minutes supplémentaires pour permettre à l’agarose de se régler complètement.</li>
</ol>3. Rupture et gel de lavage pour la culture
<ol><li>Ajouter un volume égal de 20% de perfluorooctanol (PFO) dans l’huile fluorée à l’émulsion. Inverser le tube conique à quelques reprises pour permettre le mélange.</li>
	<li>Tourner vers le bas l’émulsion cassée à 2.000 x g pendant 2 min. Les gels granuleront au-dessus des phases d’huile et de PFO.</li>
	<li>Retirez la phase d’huile et ajoutez 2 ml de tampon TE-TW (10 mM Tris pH , 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20) pour resspendre les gels. Transférer la suspension dans un nouveau tube conique de 15 ml.</li>
	<li>Pelletez les gels comme dans l’étape 3.2 et lavez-les une fois de plus dans TE-TW pour un total de deux lavages.</li>
	<li>Retirer les gels supernatants et résuspendants dans 2 ml de supports. Transférer dans un tube de culture de 5 ml.</li>
	<li>Incuber à 30 oC pendant la nuit sous secouant. REMARQUE : Après l’incubation de nuit, les hydrogels à levures peuvent être maintenus à 4 oC pendant plusieurs jours.</li>
</ol>4. lyse de colonie de levure
<ol><li>Transférer les gels dans un tube conique de 15 ml et les hydrogels à granulés à 2 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Laver les hydrogels dans PBS 2x.</li>
	<li>Laver dans 1x sphéroplasting tampon 1x.</li>
	<li>Effectuer une dilution 2-50x de l’enzyme de sphéroplastisme dans le tampon de sphéroplastisme et ajouter 1 mL aux hydrogels.</li>
	<li>Incuber à 37 oC pour 1 h. La levure traitée aura l’air plus transparente(figure 3A).</li>
	<li>Prenez le bas 0,8 mL de suspension hydrogel et transférer dans une seringue non plafonnée de 1 mL.</li>
	<li>Placez la seringue dans le support de seringue imprimé 3D(fichier supplémentaire 3) et tournez à 2 000 x g pendant 2 min. Cela entraînera les hydrogels de fermer le paquet dans la tête de seringue.</li>
</ol>5. capture d’ARNm des colonies de levure lysed utilisant l’appareil B
<ol><li>Prenez 240 000 perles Drop-Seq et transférez-les dans un tube conique de 15 ml.</li>
	<li>Gran Drop-Seq perles en tournant vers le bas à 1.000 x g pendant 1 min.</li>
	<li>Retirer les perles supernatantes et résuspendantes dans 2 ml de tampon de lyse de levure de 0,9x avec 500 mm de chlorure de sodium pour une concentration de suspension de perle de 120 000 perles/mL.</li>
	<li>Transférer la suspension de perle dans une seringue de 3 ml avec une barre de remuer insérée.</li>
	<li>Préparer une seringue contenant plusieurs millilitres de 2% w/v perfluoropolyether-polyethylene glycol (PFPE-PEG) surfactant dans l’huile fluorée.</li>
	<li>Évacuer toute la tête aqueuse de la seringue contenant des hydrogels serrés et couronner la seringue.</li>
	<li>Insérez l’hydrogel, la suspension de perle et les seringues à huile dans les pompes à seringue et connectez-vous par tuyauterie dans le dispositif d’encapsulation fabriqué à la section 1.</li>
	<li>Connectez-vous à partir de la sortie tubing dans un tube conique de 50 mL sur la glace.</li>
	<li>Flux dans les trois solutions dans l’appareil avec les débits suivants:<ol>
<li>Flux les hydrogels à 0,4 mL/h.</li>
		<li>Flux de la suspension de perle à 0,4 mL/h.</li>
		<li>Flux de l’huile fluorée à 1,6 mL/h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir 1 mL d’émulsion ou faire fonctionner l’appareil jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’hydrogels à gauche.</li>
</ol>6. génération d’ADNC, préparation de bibliothèque de séquençage, et séquençage
<ol><li>Ajouter 30 ml de tampon SSC 6x et 1 ml de PFO à l’émulsion recueillie comme indiqué dans le protocole Drop-Seq14.</li>
	<li>Continuez à suivre le protocole Drop-Seq pour générer l’ADNM à partir de l’ARNm capturé sur les perles, la préparation de la bibliothèque de séquençage et l’analyse des données de séquençage.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Notre méthode pour le séquençage isogénique de l’ARN de colonie de levure (ICO-seq) adapte une plate-forme publiée de séquençage d’ARN à cellule unique, Drop-Seq, pour le criblage à haut débit des souches de levures d’ingénierie. Les cellules de levure contiennent moins de 10% des copies de l’ARNm d’une cellule typique de mammifères et ont une paroi cellulaire qui doit être dégradée avant la capture de l’ARNm16. Ces deux facteurs empêchent l’application directe de la levure à Drop-Seq ou à d’autres plates-formes scRNA-seq à base de gouttelettes. Pour résoudre ces problèmes, nous encapsulons des cellules uniques dans les hydrogels et les cultivons en colonies pour fournir suffisamment de matériel d’entrée pour le séquençage de l’ARN et nous digérons la paroi des cellules de levure pour générer des sphéoplastes avant la lyse et la capture de l’ARNm. Ces changements ajoutent une complexité supplémentaire dans le flux de travail ICO-seq par rapport au flux de travail Drop-Seq d’origine et sont des étapes critiques que les utilisateurs doivent s’assurer de procéder en douceur.
Un bon fonctionnement de l’appareil A est nécessaire pour encapsulant des cellules à levures uniques dans des hydrogels agaroses. Un bon comptage de la suspension de levure d’entrée doit être suivi pour minimiser le nombre d’hydrogels avec plus d’une cellule de levure, tout en veillant à ce que suffisamment d’hydrogels contiennent une seule cellule pour assurer une efficacité raisonnable de capture cellulaire pendant la capture de l’ARNm. Pendant le fonctionnement de l’appareil microfluidique, le mélange de gel d’agarose doit être bien dissous et passé par un filtre de seringue pour minimiser les risques de colmatage de l’appareil. Le mélange de gel d’agarose est visqueux et la région dans laquelle un seul canal se divise en huit est particulièrement sujette à l’engorgement. En centré une caméra haute vitesse pour visualiser le fonctionnement de l’appareil dans cette région de l’appareil, les utilisateurs peuvent surveiller l’uniformité des gouttelettes émergeant de chacun des huit canaux et réagir rapidement si l’uniformité change en raison de sabots dans l’un des canaux. L’inspection d’une petite quantité d’émulsion recueillie sous le microscope fournit une méthode secondaire pour confirmer une émulsion de haute qualité.
Suite à la croissance des colonies de levures à l’intérieur des hydrogels, plusieurs précautions sont nécessaires pour assurer l’extraction de qualité de l’ARNm au niveau de la colonie unique. Il est important d’optimiser le temps que la levure est dans la culture hydrogel, parce que si la levure sont laissées dans la culture pendant trop longtemps, beaucoup échapperont aux limites des hydrogels, conduisant à un signal de fond plus élevé pendant le séquençage de l’ARN et une sensibilité plus faible lors de la discrimination entre les types de cellules. Une bonne génération de sphéoplastes à l’aide de Zymolyase garantit que l’ARNm sera libéré après l’exposition cellulaire au tampon de lyse. L’inspection visuelle des colonies de levure suivant Zymolyase devrait donner des cellules de levure plus brillantes. Une mauvaise digestion des parois cellulaires entraînera une efficacité de capture d’ARN plus faible. Enfin, les hydrogels doivent être emballés à proximité lorsqu’ils sont injectés dans l’appareil B. La surveillance de l’entrée hydrogel avec une caméra à grande vitesse permettra la fin de la collecte d’émulsion une fois que les hydrogels ne seront plus emballés sur l’entrée dans l’appareil, sinon l’efficacité de capture sera affectée.
Une préoccupation potentielle avec notre méthode est que la culture microgel de levure peut modifier considérablement l’expression des gènes. Les travaux précédents d’étude de l’expression de gène de levure dans les microgels et sur l’agar démontrent des différences dans les moyennes d’expression de gène mais dans l’ensemble une corrélation positive17, bien que l’étude plus poussée de cette réclamation sur une série de souches de levure est prudente. La méthode a également une efficacité limitée de capture cellulaire due à la charge stochastique des perles de capture d’ARNm suivant les statistiques de Poisson14. Actuellement, environ 10 % des gouttes contiennent une perle et une colonie, et le taux de double encapsulation devrait être inférieur à 1 %. Les doubles encapsulations conduisent à confondre les éléments lors de l’analyse des données RNA-seq et leur filtrage reste difficile23; un taux de capture de 25 % entraînerait une augmentation correspondante des doubles encapsulations à 5 %(figure supplémentaire 2). Bien que nous démontrons ICO-seq en utilisant la plate-forme Drop-Seq, il existe d’autres plates-formes RNA-seq gouttelettes qui introduisent des perles de capture de l’ARNm déterministiquement plutôt que statistiquement, telles que la plate-forme Chromium15,24de Génomique 10x disponible dans le commerce. L’intégration de ces plates-formes avec ICO-seq pourrait accroître l’efficacité de capture au-delà de ce que les statistiques de Poisson permettent. Enfin, une limitation fondamentale de l’ARN-seq gouttelette est l’incapacité de récupérer les cellules d’intérêt après le séquençage. Cette limitation doit être prise en compte lors de l’examen des types de bibliothèques de levures à analyser à l’aide de cette méthode.
L’hétérogénéité de cellule à cellule a été démontrée au niveau clonal pour des microbes tels que E. coli25 et S. la 26erévélant une nouvelle cellule indique qu’une analyse au niveau de la masse masquerait autrement. Les analyses d’ARN-seq en vrac effectuées sur C. albicans ont tendance soit à examiner les changements de transcriptome à l’échelle de la population, soit les cellules blanches et opaques comme deux populations distinctes27,28. L’application de l’ICO-seq pourrait conduire à la découverte de sous-états supplémentaires et fournir un cadre analytique pour la découverte de nouveaux états cellulaires au sein d’autres espèces de levures. Cependant, la croissance des cellules dans les hydrogels ne se limite pas à la levure: d’autres types de cellules, tels que les mammifères, bactériennes, et d’autres cellules fongiques peuvent également être cultivés dans les hydrogels29,30. Le séquençage des colonies isogéniques par rapport aux cellules individuelles conduit à la moyenne du bruit biologique dû à la variation de cellule à cellule, améliorant la discrimination entre les types de cellules. Cela peut aider lors de l’analyse des cellules où la diversité génétique se concentre sur des voies de synthèse spécifiques. Les possibilités élargies d’entrée de type cellulaire à ICO-seq et son intégration potentielle avec les plates-formes d’ARN-seq de gouttelettes disponibles dans le commerce positionne ICO-seq comme une plate-forme prometteuse pour disséquer l’hétérogénéité cellulaire au niveau génétique.

L’un des principaux objectifs de l’ingénierie microbienne est de modifier les microbes pour les inciter à produire des composés précieux1,2. S. cerevisiae a été le principal organisme d’ingénierie microbienne en raison de sa facilité de culture et de l’étendue des outils disponibles pour l’ingénierie de son génome3,4,5. Cependant, un obstacle reste dans l’exécution des écrans fonctionnels sur la levure modifiée: le débit de dépistage est à la traîne derrière l’ingénierie du génome par des ordres de grandeur. Le dépistage consiste généralement à isoler les souches dans les plaques de micro-puits et à les phénotquer en mesurant la production d’un composé spécifique6,,7. Le débit de ce processus est limité par les grandes quantités de réactif nécessaire pour apaiser les souches individuelles en cent réactions microlitres. La microfluidique des gouttelettes fournit une solution attrayante pour augmenter le débit de dépistage de levure par ordre de grandeur en réduisant les réactions normalement effectuées dans les plaques de puits8. Cependant, comme avec les écrans de plaque de puits, les écrans de gouttelette détectent typiquement des composés de produit simple, qui fournit des informations limitées dans la fonction globale de la voie d’ingénierie9,10,11.
Le séquençage de l’ARN (ARN-seq) peut permettre une caractérisation plus complète du fonctionnement de la voie en permettant d’évaluer simultanément les niveaux d’expression de tous les gènes pertinents12,13. En outre, les méthodes de gouttelette permettent à des milliers de cellules d’être profilées par expérience, fournissant le débit nécessaire pour filtrer les bibliothèques des variantes modifiées14,15. Cependant, les méthodes ARN-seq sont optimisées pour les cellules de mammifères; levure, en comparaison, ont moins d’ARNm par cellule et une paroi cellulaire qui est difficile à enlever16, empêchant leur séquençage par les méthodes existantes. Si une méthode de gouttelette à haut débit pouvait être conçue pour permettre la levure ARN-seq, elle fournirait une plate-forme de phénotypage évolutive, rentable et riche en informations pour l’ingénierie de levure.
Nous présentons un protocole détaillé de notre méthode récemment développée pour le séquençage des cellules de levure à l’aide de microfluidiques de gouttelette à haut débit17. Pour surmonter le défi de l’ARN limité, nous encapsulons et culture des cellules de levure unique dans les sphères hydrogel picoliter. La culture reproduit les cellules, donnant des centaines d’exemplaires partageant la même voie d’ingénierie; cela réduit la variation due à l’expression du gène à cellule unique tout en augmentant considérablement la quantité d’ARN disponible pour le séquençage. Après l’amplification basée sur la culture, nous sphéoplast les cellules, en enlevant la paroi cellulaire par digestion enzymatique en vrac. Les membranes cellulaires restent intactes, de sorte que chaque colonie isogénique et son ARNm associé restent encapsulés dans leurs sphères hydrogel. Cela nous permet de jumeler les colonies individuelles avec des réactifs de capture de l’ARNm et tampon de lyse, et l’ARNm à capturer, code à barres et séquencé à la suite du flux de travail Drop-Seq14. Notre méthode permet le dépistage à l’échelle du transcriptome de milliers de colonies de levure isogéniques par expérience.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Used to make TE-TW buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Used to make TE-TW buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for 3D print file</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>a9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel (hydrophobic glass treatment)</td>
			<td>Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drop-Seq Beads</td>
			<td>ChemGenes</td>
			<td>MACOSKO-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides (75 mm x 50 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionic Krytox Surfactant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>3M</td>
			<td>98-0212-2928-5</td>
			<td>Commonly knowns as HFE 7500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-2 polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-PFPE surfactant</td>
			<td>Ran Biotechnologies</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for mask designs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2150</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Used to make TE-TW buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YR Digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1001-1</td>
			<td>Spheroplasting buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YR Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1005</td>
			<td>Spheroplasting enzyme mixture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput yeast strain phenotyping with droplet-based rna sequencing

Les puissants outils disponibles pour modifier les génomes de levure ont fait de ce microbe une plate-forme précieuse pour l’ingénierie. Bien qu’il soit maintenant possible de construire des bibliothèques de millions de souches génétiquement distinctes, le dépistage d’un phénotype souhaité demeure un obstacle important. Avec les techniques de dépistage existantes, il y a un compromis entre la production d’information et le débit, avec un dépistage à haut débit généralement effectué sur un produit d’intérêt. Par conséquent, nous présentons une approche pour accélérer le criblage des souches en adaptant le séquençage d’ARN à cellule unique aux colonies isogéniques de picoliter des souches génétiquement modifiées de levure. Pour relever les défis uniques de l’exécution du séquençage de l’ARN sur les cellules de levure, nous culture des colonies de levure isogéniques dans les hydrogels et le sphéroplast avant d’effectuer le séquençage de l’ARN. Les données de séquençage de l’ARN peuvent être utilisées pour déduire les phénotypes de levure et trier les voies d’ingénierie. L’évolutivité de notre méthode répond à une obstruction critique dans l’ingénierie microbienne.

Nous avons adapté le flux de travail Drop-Seq14 déjà publié pour le séquençage isogénique de colonie (ICO-seq) pour effectuer le profilage d’expression génique des colonies de levure isogéniques. Nous avons isolé des cellules de levure unique et les avons encapsulées en microgels agaroses (figure 1A). Après l’incubation de nuit des microgels, ces cellules de levure encapsulées se sont développées en colonies isogéniques. Avant de charger des gels dans un deuxième dispositif microfluidique pour la capture de l’ARNM, nous avons digéré la paroi des cellules de levure pour rendre l’ARNm plus accessible(figure 1B, à gauche). Nous avons emballé ces microgels et fusionné les perles de capture de l’ARNm et tampon de lyse. Certaines gouttelettes contenaient exactement une perle jumelée à une colonie de levures lysed. Toutes les perles de l’émulsion ont été recueillies et l’ADP synthétisée et séquencée suivant le protocole Drop-Seq.
Nous avons généré des colonies de levure isogéniques par l’encapsulation de cellules de levure unique dans les microgels agaroses utilisant un dispositif microfluidique de coencapsulation avec un splitter de huit gouttes attaché (figure 2A). Nous avons dilué la suspension de levure d’entrée à une concentration de 750 000 euros/mL de sorte que 30 % des microgels ont exactement une levure en eux. Avant d’insérer l’agarose de température de fonte ultralow dans l’appareil, nous l’avons dissoute à une température élevée et maintenu la seringue à cette température pour prévenir la gélification prématurée. À la jonction de la génération de gouttes(figure 2B), les cellules de levure ont d’abord été encapsulées en gouttelettes de 160 m. Après la jonction de la génération de gouttes, un diviseur à huit reprises a divisé ces gouttelettes en huit gouttelettes de 80 m(figure 2C). Un filtre à seringue a été fixé à l’agarose fondue pour empêcher les sabots de se former dans les canaux, qui peuvent être aussi étroits que 37 m pendant le drop-splitting. Nous avons recueilli l’émulsion sur la glace, qui a immédiatement commencé le processus de gélification de l’agarose. Nous avons calculé la polydispersité d’une émulsion typique à 6 %(figure supplémentaire 1), bien que les valeurs de polydispersion jusqu’à 10 % soient acceptables. Une fois les gels d’agarose réglés, nous avons cassé l’émulsion et enlevé la phase d’huile. Les gels ont été lavés dans un tampon aqueux avant l’immersion dans les médias de croissance. L’incubation nocturne des microgels a entraîné la croissance de colonies isogéniques dans certains microgels(figure 2D). Le pourcentage d’hydrogels contenant des colonies d’au moins 20 cellules dépendait des conditions culturelles, y compris le temps d’incubation et la composition des médias. Dans notre démonstration à l’aide de C. albicans, nous avons déterminé qu’environ 15 % des hydrogels contenaient une colonie après 20 h de culture de suspension.
Un deuxième dispositif de coencapsulation a extrait l’ARNm des colonies isogéniques(figure 3A). Avant de charger les microgels de levure dans le dispositif microfluidique, nous avons lavé et immergé les gels dans une solution pour digérer les parois des cellules de levure. Une bonne digestion des cellules de levure a été vérifiée par microscopie, avec la levure traitée ayant une morphologie plus réfléchissante(figure 3B). Nous avons emballé les microgels dans une seringue et accordé le taux de débit d’entrée gel de telle sorte qu’un gel était dans chaque goutte. Un flux de perles de capture d’ARNm dans un tampon de lyse mélangé avec le flux de gel à emballage étroit avant la jonction de chute(figure 3C). Nous avons recueilli une émulsion résultante de 160 gouttelettes de m, et les colonies ont commencé à lyse et libérer leur contenu cellulaire. Nous avons chargé des perles à une dilution limitante pour minimiser le nombre de gouttes contenant plusieurs perles, mais l’emballage rapproché des gels pendant la fabrication des gouttes a entraîné environ 10% des gouttes collectées contenant une perle avec une colonie lysed(figure 3D).
Nous avons analysé l’expression génique de C. albicans, une espèce de levure présente dans le microbiome intestinal humain, en utilisant le flux de travail ICO-seq. C. albicans est noté pour sa capacité à basculer entre deux états cellulaires différents, appelés blancs etopaques 19. Nous utilisons une souche d’albicans C, souche RZY122, qui remplace une copie du gène WH11, uniquement active dans les cellules blanches avec YFP20. Nous avons obtenu un ensemble de profils d’expression génique en utilisant le flux de travail et les avons utilisés pour l’analyse des colonies exprimant au moins 300 gènes uniques. En tant qu’ensemble de données de référence, nous avons utilisé des données d’expression C. Albicans obtenues à partir d’une étude antérieurement publiée17 et filtré des colonies exprimant moins de 600 gènes uniques. Après avoir effectué l’analyse principale de composant (PC) et une réduction de dimensionnalité t-stochastic de voisin (tSNE)21, nous avons trouvé la concordance générale entre notre jeu de données d’échantillon et la référence(figure 4A). L’analyse de PC a révélé que YFP et WH11 ont contribué de manière significative aux deux premiers PC. De plus, l’analyse de tSNE a révélé trois grappes(figure 4B). Tandis que le cluster 2 était principalement composé des cellules du jeu de données d’échantillon, les grappes 0 et 1 étaient composées des cellules des deux échantillons. En superposant l’expression WH11 sur le tSNE(figure 4C, panneau supérieur), nous avons déterminé que l’amas 1 contenait probablement des colonies blanches. Nous avons également constaté que l’expression STF2 a augmenté dans le cluster 1(figure 4C, panneau inférieur), compatible avec les données précédemment obtenues17. Dans les grappes 0 et 2, WH11 et STF2 ont été considérablement réglementés par rapport au cluster 1(figure 4D). Les gènes impliqués dans la fermentation, tels que ADH1, ont été régulés en cluster 0, compatibles avec les études précédentes des cellules opaques22. Nous avons constaté que les colonies dans le groupe 2 avaient diminué l’ARN ribosomal comparé aux colonies dans les grappes 0 et 1. Bien que l’échantillon et les ensembles de données de référence aient été obtenus à l’aide du même stock de cellules, ce résultat suggère que même des différences subtiles dans la manipulation expérimentale peuvent affecter l’expression des gènes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61014/61014fig1v2.jpg"> Figure 1 : Aperçu du flux de travail ICO-seq. (A) La levure de culture dans une culture de suspension ont été diluées dans le tampon et coencapsulées avec l’agarose fondue dans un dispositif de générateur de gouttelettes de débit-focalisé pour permettre le chargement de Poissons des microgels agarose avec des cellules de levure simples. Les gels réglés lorsque l’agarose s’est refroidie, la suspension huile/eau a été cassée, et l’huile a été enlevée, ce qui a donné une suspension de perles de gel dans l’eau. Après la culture du jour au lendemain, les cellules de levure sont devenues des colonies isogéniques dans les microgels. (B) Les colonies ont été soumises à un tampon de dégradation de la paroi cellulaire, après quoi ils ont été emballés à proximité et coencapsulés avec des perles de capture d’ARNm dans un deuxième dispositif microfluidique. L’emballage rapproché des microgels a permis à chaque goutte d’avoir un gel, tandis que le chargement des perles par Poisson réduisait le risque de perles multiples en une seule goutte. Des gouttes collectées ont été traitées pour la synthèse de l’ADN et la génération d’une bibliothèque de séquençage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/61014fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61014/61014fig2v2.jpg"> Figure 2 : Génération de colonies de levure isogéniques à l’intérieur de microgels agaroses utilisant l’appareil A. (A) Schéma de dispositif microfluidique, montrant l’emplacement des trois intrants et ports de sortie. La jonction de drop-making est mise en évidence en rouge. (B) Plan rapproché de la jonction de drop-making pendant le fonctionnement normal de l’appareil. (C) Micrographe de gouttelettes collectées, avec un gros plan d’une gouttelette contenant une cellule encapsulée (encart). (D) Micrographe des colonies de levure isogéniques dans les microgels agaroses après une incubation de 24 heures, avec un gros plan de deux colonies (encart). Toutes les barres d’échelle à 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/61014fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61014/61014fig3v2.jpg"> Figure 3 : Capture de Lysis et d’ARNm des colonies isogéniques utilisant l’appareil B. (A) Schéma de dispositif microfluidique, montrant l’emplacement des trois intrants et ports de sortie. La jonction de drop-making est mise en évidence en rouge. (B) Micrographe des colonies de levures suivant la digestion de mur cellulaire, avec un gros plan d’une colonie (encart). (C) Plan rapproché de la jonction de drop-making pendant le fonctionnement normal de l’appareil. (D) Micrographe des émulsions recueillies suivant le jumelage de microgel et de perles, avec un gros plan montrant une goutte avec une perle et une colonie lysed (encart). Toutes les barres d’échelle à 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/61014fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61014/61014fig4v2.jpg"> Figure 4 : Analyse de la réponse de commutation blanc-opaque dans C. albicans. (A) tSNE parcelle d’un ensemble de données d’échantillon combiné avec un jeu de données de référence de Liu17. (B) Le regroupement des transcriptomes révèle trois clusters visualisés sur une parcelle tSNE. (C) Les gènes clés impliqués dans la réponse de commutation blanc-opaque ont contribué à la variation déterminée par l’analyse principale des composants. (D) Parcelles de violon des niveaux d’expression normalisés de YFP et WH11 par des grappes marquées sur la parcelle tSNE. indique p 'lt;lt;'lt; 0.05 et ' indique p 'lt;lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/61014fig4v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Chiffres supplémentaires 1 et 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/jove_SI.docx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces filgures.</a>
Fichiers supplémentaires 1-3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/Supplemental_Files.zip" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces fichiers.</a>

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High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Un goulot d’étranglement dans le cycle de «conception-construction-test» de l’ingénierie microbienne est la vitesse à laquelle nous pouvons effectuer des écrans fonctionnels de souches. Nous décrivons une méthode à haut débit pour le criblage des souches appliquée à des centaines à des milliers de cellules de levure par expérience qui utilise le séquençage à base d’ARN à base de gouttelettes.

Phénottypage à haute teneur en levures avec séquençage à base d’ARN à base de gouttelette

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

ICO, ou ICO-seq est la première adaptation du séquençage de l’ARN à haut débit aux microbes. Cette méthode a évalué la fonction microbienne à l’échelle du génome. Pour les microbes d’ingénierie, cette méthode peut élucider comment les changements au génome microbien peuvent perturbant ses fonctions.Obtenir de la levure à partir d’une culture de suspension, et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Suspendre à nouveau les cellules de PBS à une concentration d’environ 750 000 cellules par millilitre. Ensuite, mélanger le point de fusion ultra-bas agarose en PBS, et chauffer le mélange à 90 degrés Celsius, jusqu’à ce que l’agarose fonde.Charger le mélange d’agarose dans une seringue, avec un filtre attaché de 0,22 micron. Placez une pompe à seringues devant un chauffe-espace réglé à 80 degrés Celsius et placez la seringue dans la pompe. Remplir une deuxième seringue avec la suspension de levure, et remplir une troisième seringue avec de l’huile fluorée, avec 2% de fluorosurfactant ionique.Chargez les deux seringues dans les pompes à seringues. Connectez le tube des seringues à l’appareil A.Placez un tube conique de 15 millilitres dans un seau à glace et guidez le tube de sortie dans le tube conique. Réglez le débit de chaque seringue et recueillez environ un millilitre d’émulsion dans le tube conique de 15 millilitres.Après avoir attendu cinq minutes que l’agarose dans le tube se fixe, ajouter un volume égal de 20% perfluoro-octanol dans l’huile fluorée à l’émulsion. Mélanger l’émulsion et le perfluoro-octanol en inversant le tube conique à quelques reprises. Centrifugeuse l’émulsion cassée à 2000 fois G pendant deux minutes.Assurez-vous que les hydrogels ont granulé au-dessus des phases d’huile et de PFO. Retirer les phases d’huile et de PFO. Ajouter deux millilitres de tampon tet(W) pour suspendre à nouveau les hydrogels.Transférer la suspension dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le tube à nouveau à 2000 fois G pendant deux minutes. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau les hydrogels dans le tet(W).Après avoir fait tourner les hydrogels à 2000 fois G pendant deux minutes, suspendez les hydrogels en deux millilitres de milieu de culture de levure. Incuber le tube pendant la nuit à 30 degrés Celsius, avec des secousses. Chaque souche pousse à des rythmes différents.Le choix d’un média approprié et le temps d’incubation est essentiel pour s’assurer que la levure se développent dans l’hydrogel, mais ne pas dépasser, conduisant à des cellules s’échappant dans les médias. Tout d’abord, transférer les hydrogels dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 2000 fois G pendant deux minutes.Laver les hydrogels deux fois avec PBS, puis une fois dans le tampon sphéroplasting. Effectuer une dilution 40x de l’enzyme sphéroplasting dans le tampon sphéroplasting. Ensuite, ajouter un millilitre de l’enzyme diluée aux hydrogels.Incuber le tube d’hydrogels à 37 degrés Celsius pendant une heure. La levure traitée aura l’air plus transparente. Du tube contenant la suspension hydrogel, retirez 0,8 millilitres de la suspension du fond du tube et transférez-la à une seringue non plafonnée d’un millilitre.Placez la seringue dans le porte-seringue imprimé en 3D. Centrifugeuse de la seringue et du support à 2000 fois G pendant deux minutes. Avant de procéder, assurez-vous que les hydrogels sont bien emballés au fond de la seringue.Placer 240 000 perles de goutte-seq dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 1000 fois G pendant une minute. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau les perles en deux millilitres de tampon de lyse de levure de 0,9 x, avec du chlorure de sodium de 500 millimlaires.Insérez une barre de remue-remuer et transférez la suspension de la perle sur une seringue de trois millilitres. Préparer une autre seringue contenant plusieurs millilitres de surfactant PFPE-PEG dans de l’huile fluorée. Obtenez la seringue précédemment préparée des hydrogels emballés de clone de levure.Évacuez la tête d’acquiescement et capuchonez la seringue. Insérez les trois seringues, les hydrogels, la suspension de perle et l’huile dans les pompes à seringues. Connectez les seringues par tube à l’appareil B, le dispositif d’encapsulation.Placer l’extrémité du tube de sortie dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Réglez le débit de chaque seringue. Recueillir environ 1000 millilitres d’émulsion, ou faire fonctionner l’appareil jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’hydrogels.Suivez ensuite le protocole drop-seq pour la synthèse cDNA, la préparation de la bibliothèque et le séquençage. À l’aide d’un dispositif microfluidique, les cellules de levure ont été encapsulées dans des gouttelettes de 160 micromètres. Un séparateur de huit fois a divisé ces gouttelettes en huit gouttelettes de 60 micromètres.L’incubation pendant la nuit a entraîné la croissance de colonies de levure isogéniques dans certains hydrogels. Avant de charger les hydrogels de levure dans le deuxième dispositif microfluidique, ils ont été lavés et immergés dans une solution pour digérer les parois cellulaires. La digestion appropriée a été vérifiée par microscopie, avec les cellules traitées de levure ayant une morphologie plus réfléchissante.Un flux de perles de capture de l’ARNm dans le tampon de lyse a été mélangé avec un flux d’hydrogels de levure à emballage rapproché avant la jonction de drop-making du deuxième dispositif microfluidique. Dans l’émulsion qui en a résulté, environ 10 % des gouttelettes recueillies contenaient une perle avec une colonie lysée. Ce flux de travail isogénique de séquençage de colonie a été employé pour analyser la réponse opaque blanche de commutation de C.albicans.Le composant principal, le PC, l’analyse et une réduction de la dimensionnalité tSNE ont indiqué une concordance générale entre l’ensemble de données de l’échantillon et un ensemble de données de référence. L’analyse de TSNE a indiqué trois faisceaux de cellules. Alors que le deuxième groupe était principalement composé de cellules de l’ensemble de données de l’échantillon, les grappes zéro et une étaient composées de cellules provenant des deux échantillons.La superposition de l’expression WH11 sur le tSNE indiquait que le groupe un contenait probablement des colonies blanches. L’expression STF2 a augmenté dans le premier groupe, ce qui correspond aux données précédemment obtenues. Dans les grappes zéro et deux, WH11 et STF2 ont été considérablement moins réglementés que le premier groupe.Les microbes androgènes ont un potentiel sans cesse croissant pour produire en masse des produits biologiques pour le traitement d’une grande variété de maladies. Après cette procédure, on peut appliquer une variété d’outils bioinformatiques pour analyser plus en détail les données de séquençage.

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