Name: high throughput yeast strain phenotyping with droplet-based rna sequencing
Uploaded: 2020-05-21T14:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing at JoVE.com

इस परियोजना को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार DBI-1253293, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान ों के नए प्रर्वतक पुरस्कार DP2AR068129 और अनुदान R01HG008978, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन प्रौद्योगिकी केंद्र अनुदान DBI-1548297, और सेलुलर निर्माण के लिए UCSF केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था । आरा और जेडजेजी चान-जुकरबर्ग बायोहब जांचकर्ता हैं ।

1. माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस फैब्रिकेशन
<ol><li>एसयू-8 मास्टर निर्माण<ol>
<li>कंप्यूटर की सहायता से डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डिवाइस ए और बी(पूरक फ़ाइल 1 और 2)के लिए माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के लिए नकारात्मक मुखौटा डिजाइन और उन्हें कम से 10 माइक्रोन संकल्प के साथ सर्किट बोर्ड फिल्म पर मुद्रित किया है।</li>
		<li>एक स्पिन कोटर पर एक साफ 75 मिमी सिलिकॉन वेफर रखें और अपने केंद्र पर एसयू-8 के बारे में 1 मिलील डालें। चक के लिए वेफर सुरक्षित करने के लिए वैक्यूम चालू करें।</li>
		<li>डिवाइस ए के लिए स्पिन कोट एसयू-8 2150 पर 500 आरपीएम पर 30 एस के लिए, इसके बाद 30 एस पर 2,750 आरपीएम। डिवाइस बी के लिए, स्पिन कोट एसयू-8 २१०० पर 500 आरपीएम पर 30 एस के लिए, इसके बाद 30 एस पर 2,500 आरपीएम पर। इससे क्रमशः मोटाई 200 माइक्रोन और 120 माइक्रोन की एसयू-8 लेयर निकलेगी।</li>
		<li>स्पिन-कोटर से वेफर निकालें और नरम सेंकना करने के लिए 60 किमी के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर रखें।</li>
		<li>हॉटप्लेट से वेफर निकालें और इसे कमरे के तापमान तक ठंडा होने दें। वेफर के शीर्ष पर मुखौटा रखें, और 2 मिन के लिए एक कोलिमेटर 190 मीटर, 365 एनएम यूवी एलईडी के तहत बेनकाब करें।</li>
		<li>पोस्टएक्सपोजर बेकिंग के लिए 5 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेट हॉटप्लेट पर वेफर रखें।</li>
		<li>वेफर निकालें और इसे कमरे के तापमान में ठंडा होने दें। वेफर को 20 मिन के लिए प्रोपलीन ग्लाइकोल मोनोमेथिल ईथर एसीटेट (पीजीएमईए) के स्नान में रखें।</li>
		<li>इसके बाद पीजीएमईए के साथ वेफर को कुल्ला करें। यदि इस प्रक्रिया के दौरान कोई अपारदर्शी अवशेष दिखाई देता है, तो पीजीएमईए और आइसोप्रोपेनॉल के साथ रिंसिंग दोहराएं। हवा वेफर को सुखा दे।</li>
		<li>वेफर को 3 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर रखें।</li>
		<li>वेफर को 90 मिमी व्यास पेट्री डिश में निकालें और रखें।</li>
	</ol>
</li>
	<li>एसयू-8 मास्टर पर पॉलीडिमिथाइलसिलिक्सने (पीडीएम) कास्टिंग<ol>
<li>एक साथ इलाज एजेंट के लिए सिलिकॉन बेस के एक 10:1 जन अनुपात मिश्रण । लगभग 30 मिन के लिए मिश्रण करने के बाद पीडीएफ एस डीगास।</li>
		<li>एसयू-8 मास्टर के शीर्ष पर degassed PDMS डालो जब तक कम से कम एक 5 मिमी मोटी परत वेफर के शीर्ष पर गठन किया है ।</li>
		<li>लगभग 30 मिन के लिए वेफर के शीर्ष पर पीडीएम डेगास।</li>
		<li>पीडीएम को ठीक करने के लिए कम से कम 80 मिन के लिए वेफर को 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।</li>
		<li>वेफर से ठीक हुए पीडीएम स्लैब को काट लें।</li>
		<li>ऊपर की ओर सामना कर रहे माइक्रोफ्लूइडिक सुविधाओं के साथ पीडीएम स्लैब रखें, और 0.75 मिमी बायोप्सी पंच के साथ पंच इनलेट और आउटलेट छेद।</li>
		<li>आइसोप्रोपेनॉल के साथ 50 मिमी x 75 मिमी ग्लास स्लाइड साफ करें और टेप के साथ पीडीएम स्लैब के माइक्रोफ्लूइडिक फीचर्स साइड से सभी धूल को हटा दें।</li>
		<li>साफ ग्लास स्लाइड और माइक्रोफ्लूइडिक सुविधाओं के साथ पीडीएम स्लैब को 1 00 पीए (1 mbar O2)प्लाज्मा 1 मिन के लिए चेहरा बेनकाब करें।</li>
		<li>सुविधाओं के साथ पीडीएम स्लैब रखें जो बॉन्डिंग के लिए अनुमति देने के लिए ग्लास स्लाइड पर नीचे का सामना करते हैं। बॉन्डिंग पूरी करने के लिए स्लाइड को कम से कम 30 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।</li>
		<li>फ्लोरिनेट सतह उपचार तरल पदार्थ के साथ फ्लश करके सभी माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों का इलाज करें। तरल पदार्थ को वाष्पित करने के लिए कम से कम 10 डिग्री सेल्सियस ओवन में डिवाइस को बेक करें।</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. डिवाइस ए का उपयोग करहाइड्रोगेल में खमीर encapsulation
<ol><li>एक निलंबन संस्कृति में बढ़ रही खमीर ले लो और एक हीमोसाइटोमीटर पर भरोसा करते हैं ।</li>
	<li>फॉस्फेट बफर्ड लवकुश (पीबीएस) में कोशिकाओं को लगभग 750 k/mL की एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित करें। यह सुनिश्चित करता है कि 30% हाइड्रोगेल में एक खमीर सेल होगा। खमीर कोशिकाओं के बारे में केवल आधे कालोनियों में विकसित होते हैं, जिससे खमीर कालोनियों वाले हाइड्रोगेल का ~ 15% होता है।</li>
	<li>पीबीएस में 2% w/v पर अल्ट्रालो गलन बिंदु अगारोज मिलाएं और पिघलने तक 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी। इसमें ~ 10 मिन लगता है।</li>
	<li>एक संलग्न 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ एक सिरिंज में अगारोज मिश्रण लोड अंतरिक्ष हीटर के सामने एक सिरिंज पंप में 80 डिग्री सेल्सियस सेट.</li>
	<li>खमीर निलंबन से भरी एक सिरिंज और सिरिंज पंपों में 2% w/v आयनिक फ्लोरोसर्फेक्टेंट18 के साथ फ्लोरिनेट तेल युक्त सिरिंज लोड करें ।</li>
	<li>सेक्शन 1 में बने कॉफ्लो ड्रॉप स्प्लिटर डिवाइस लें और सीरिंज से ट्यूबिंग को डिवाइस में कनेक्ट करें । ड्रॉप संग्रह के लिए एक बर्फ बाल्टी में एक 15 mL शंकुट्यूब में आउटलेट से ट्यूबिंग गाइड ।</li>
	<li>निम्नलिखित प्रवाह दरों के साथ डिवाइस में तीन समाधानों में प्रवाह:<ol>
<li>खमीर निलंबन को 3 mL/h की प्रवाह दर के साथ प्रवाहित करें ।</li>
		<li>अगारोज मिश्रण को 3 mL/h की प्रवाह दर पर प्रवाहित करें ।</li>
		<li>फ्लोरिनेट तेल को 15 मिली/घंटा की प्रवाह दर पर प्रवाहित करें।</li>
	</ol>
</li>
	<li>पायस के बारे में 1 mL लीजिए। अगारोज को पूरी तरह से सेट करने की अनुमति देने के लिए एक अतिरिक्त 5 मिन रुको।</li>
</ol>3. संस्कृति के लिए जेल को तोड़ना और धोना
<ol><li>पायस में फ्लोरिनेड तेल में 20% परफ्लोरोऑक्टेनॉल (पीएफओ) की बराबर मात्रा जोड़ें। मिश्रण के लिए अनुमति देने के लिए कई बार शंकुली ट्यूब उलटा।</li>
	<li>2 मिन के लिए 2,000 x ग्राम पर टूटे पायस को स्पिन करें। जैल तेल और पीएफओ चरणों के ऊपर गोली होगी।</li>
	<li>तेल चरण को हटा दें और जैल को फिर से निलंबित करने के लिए TE-TW बफर (10 mM Tris पीएच = 8.0, 1 mM EDTA, 0.01% ट्वीन-20) के 2 मिलील जोड़ें। निलंबन को एक नई 15 mL शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें।</li>
	<li>चरण 3.2 के रूप में जैल नीचे गोली मार और दो वॉश की कुल के लिए TE-TW में एक और समय धोने।</li>
	<li>सुपरनेटेंट निकालें और मीडिया के 2 mL में जैल को फिर से निलंबित करें। 5 मिलीआर संस्कृति ट्यूब पर स्थानांतरित करें।</li>
	<li>झटकों के तहत रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। नोट: रात भर इनक्यूबेशन के बाद, खमीर हाइड्रोगेल को कई दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।</li>
</ol>4. खमीर कॉलोनी lysis
<ol><li>2 मिन के लिए 2,000 x ग्राम पर 15 mL शंकुई ट्यूब और पैलेट हाइड्रोगेल में जैल स्थानांतरित करें।</li>
	<li>पीबीएस 2x में हाइड्रोगेल धोएं।</li>
	<li>1x स्फेरोप्लान्टी बफर 1x में धोलें।</li>
	<li>स्फेरोप्लाटिन बफर में स्हेरोप्लेन्टिअनएंजाइम का 2-50x कमजोर प्रदर्शन करें और हाइड्रोगेल में 1 mL जोड़ें।</li>
	<li>1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। इलाज खमीर अधिक पारदर्शी दिखेगा(चित्रा 3A)।</li>
	<li>हाइड्रोजेल निलंबन के नीचे 0.8 मिलील लें और 1 मिलील अनकैप्ड सिरिंज में स्थानांतरित करें।</li>
	<li>सिरिंज को 3डी प्रिंटेड सिरिंज होल्डर(सप्लीमेंट्री फाइल 3)में रखें और 2 मिन के लिए 2,000 एक्स जी पर स्पिन करें। इसकी वजह से हाइड्रोगेल ्स को सिरिंज हेड में पैक बंद करना होगा।</li>
</ol>5. डिवाइस बी का उपयोग कर के lysed खमीर कालोनियों से mRNA कब्जा
<ol><li>240,000 ड्रॉप-सेक मोतियों को लें और 15 मीटर शंकुई ट्यूब में स्थानांतरित करें।</li>
	<li>1 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर नीचे कताई द्वारा पैलेट ड्रॉप-सीक मोती।</li>
	<li>120,000 मोतियों/एमएल की मनका निलंबन एकाग्रता के लिए 500 मीटर सोडियम क्लोराइड के साथ 0.9x खमीर लिसिस बफर के 2 एमएल में सुपरनेटेंट और रीसस्पेंड मोतियों को हटा दें।</li>
	<li>एक हलचल बार डाला के साथ एक 3 mL सिरिंज के लिए बीड निलंबन स्थानांतरण।</li>
	<li>फ्लोरिनेट तेल में 2% w/v perfluoropolyether-पॉलीथीन ग्लाइकोल (PFPE-PEG) सर्फेक्टेंट के कई मिलीलीटर युक्त सिरिंज तैयार करें ।</li>
	<li>सिरिंज के सभी जलीय सिर को खाली करें जिसमें क्लोज-पैक हाइड्रोगेल होते हैं और सिरिंज को कैप करें।</li>
	<li>हाइड्रोजेल, माड निलंबन, और सिरिंज पंपों में तेल सिरिंज डालें और धारा 1 में बने एनकैप्सुलेशन डिवाइस में ट्यूबिंग के माध्यम से कनेक्ट करें।</li>
	<li>बर्फ पर एक 50 mL शंकुट्यूब में आउटलेट ट्यूबिंग से कनेक्ट करें।</li>
	<li>निम्नलिखित प्रवाह दरों के साथ डिवाइस में तीन समाधानों में प्रवाह:<ol>
<li>0.4 mL/h पर हाइड्रोगेल प्रवाहित करें।</li>
		<li>0.4 mL/h पर मनका निलंबन प्रवाह।</li>
		<li>फ्लोरिनेट तेल को १.६ मीटर/घंटा पर प्रवाहित करें ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>पायस के ~ 1 mL लीजिए या डिवाइस चलाने के लिए जब तक वहां कोई और अधिक हाइड्रोगेल छोड़ दिया है ।</li>
</ol>6. सीडीएनए पीढ़ी, अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी, और अनुक्रमण
<ol><li>ड्रॉप-सीक्यू प्रोटोकॉल14में कहा गया है कि एकत्र किए गए पायस में 6x एसएससी बफर और पीएफओ के 1 एमएल के 30 मिलीएल जोड़ें।</li>
	<li>मोतियों पर कैप्चर किए गए एमआरएनए से सीडीएनए उत्पन्न करने, पुस्तकालय तैयार करने और डेटा विश्लेषण अनुक्रमण करने के लिए ड्रॉप-सीक्यू प्रोटोकॉल का पालन करना जारी रखें।</li>
</ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Transcriptomic+Analysis+of+the+Candida+albicans+Response+to+Treatment+with+a+Novel+Inhibitor+of+Filamentation.">Global Transcriptomic Analysis of the Candida albicans Response to Treatment with a Novel Inhibitor of Filamentation.</a> mSphere. 4 (5), 00620 (2019).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+manipulation+of+hydrogel+microcapsules+by+droplet-based+microfluidics+for+mammalian+cell+culture.">Generation and manipulation of hydrogel microcapsules by droplet-based microfluidics for mammalian cell culture.</a> Lab on a Chip. 17 (11), 1913-1932 (2017).</li><li>Lin, X., Nishio, K., Konno, T., Ishihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+encapsulation+of+bacteria+in+redox+phospholipid+polymer+hydrogels+on+electron+transfer+efficiency+in+living+cell-based+devices.">The effect of the encapsulation of bacteria in redox phospholipid polymer hydrogels on electron transfer efficiency in living cell-based devices.</a> Biomaterials. 33 (33), 8221-8227 (2012).</li></ol>

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।

आइसोजेनिक खमीर कॉलोनी आरएनए अनुक्रमण (आईसीओ-सीक्यू) के लिए हमारी विधि इंजीनियर खमीर उपभेदों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक प्रकाशित एकल सेल आरएनए अनुक्रमण मंच, ड्रॉप-सीक्यू को अनुकूलित करती है। खमीर कोशिकाओं में एक विशिष्ट स्तनधारी कोशिका की एमआरएनए की प्रतियों का 10% से कम होता है और इसमें एक कोशिका दीवार होती है जिसे एमआरएनए कैप्चर16से पहले अपमानित करने की आवश्यकता होती है। ये दो कारक ड्रॉप-सेक या अन्य बूंद-आधारित स्क्आरएनए-सीक्यू प्लेटफार्मों पर खमीर के प्रत्यक्ष आवेदन को रोकना। इन मुद्दों के समाधान के लिए, हम हाइड्रोगेल के भीतर एकल कोशिकाओं को समझाते हैं और आरएनए अनुक्रमण के लिए पर्याप्त इनपुट सामग्री प्रदान करने के लिए उन्हें उपनिवेशों में विकसित करते हैं और हम lysis और mRNA कैप्चर से पहले स्फेरोप्लास्ट उत्पन्न करने के लिए खमीर सेल दीवार को पचाते हैं। ये परिवर्तन मूल ड्रॉप-सीक्यू वर्कफ़्लो की तुलना में आईसीओ-सीक्यू कार्यप्रवाह में अतिरिक्त जटिलता जोड़ते हैं और महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें उपयोगकर्ताओं को सुचारू रूप से आगे बढ़ना सुनिश्चित करना चाहिए।
अगारोज हाइड्रोगेल के भीतर एकल खमीर कोशिकाओं को एन्कैप्सुलेट करने के लिए डिवाइस ए का उचित संचालन आवश्यक है। एक से अधिक खमीर सेल के साथ हाइड्रोगेल की संख्या को कम करने के लिए इनपुट खमीर निलंबन की उचित गिनती का पालन किया जाना चाहिए, जबकि यह सुनिश्चित करना है कि पर्याप्त हाइड्रोगेल में एमआरएनए कैप्चर के दौरान उचित सेल कैप्चर दक्षता सुनिश्चित करने के लिए एक ही सेल हो। माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस ऑपरेशन के दौरान, अगारोज जेल मिश्रण को अच्छी तरह से भंग किया जाना चाहिए और डिवाइस क्लोजिंग की संभावना को कम करने के लिए सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पारित किया जाना चाहिए। अगारोज जेल मिश्रण चिपचिपा है और जिस क्षेत्र में एक चैनल आठ में विभाजित होता है, विशेष रूप से क्लोजिंग से ग्रस्त होता है। डिवाइस के उस क्षेत्र में डिवाइस ऑपरेशन की कल्पना करने के लिए एक उच्च गति कैमरा केंद्रित करके, उपयोगकर्ता आठ चैनलों में से प्रत्येक से उभरने वाली बूंदों की एकरूपता की निगरानी कर सकते हैं और किसी भी चैनल में क्लॉग के कारण एकरूपता परिवर्तन होने पर जल्दी से प्रतिक्रिया कर सकते हैं। माइक्रोस्कोप के तहत एकत्र पायस की एक छोटी मात्रा का निरीक्षण उच्च गुणवत्ता वाले पायस की पुष्टि करने के लिए एक माध्यमिक विधि प्रदान करता है।
हाइड्रोगेल के भीतर खमीर कालोनियों के विकास के बाद, एकल कॉलोनी स्तर पर गुणवत्ता mRNA निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए कई सावधानियां आवश्यक हैं। खमीर हाइड्रोगेल संस्कृति में होने के समय को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यदि खमीर बहुत लंबे समय तक संस्कृति में छोड़ दिया जाता है, तो कई हाइड्रोगेल के दायरे से बच जाएंगे, जिससे सेल प्रकारों के बीच भेदभाव करते समय आरएनए अनुक्रमण और कम संवेदनशीलता के दौरान उच्च पृष्ठभूमि संकेत होगा। ज़िमोलिज का उपयोग करके स्हेरोप्लास्ट की उचित पीढ़ी यह सुनिश्चित करती है कि एमआरएनए को लिसिस बफर के सेल एक्सपोजर के बाद जारी किया जाएगा। ज़िमोलिज़ के बाद खमीर उपनिवेशों के दृश्य निरीक्षण में शिनियर खमीर कोशिकाओं को प्राप्त करना चाहिए। अनुचित सेल वॉल पाचन कम आरएनए कैप्चर दक्षता का कारण बनेगा। अंत में, हाइड्रोगेल को बंद पैक किया जाना चाहिए क्योंकि उन्हें डिवाइस बी में इंजेक्ट किया जाता है। उच्च गति वाले कैमरे के साथ हाइड्रोगेल इनपुट की निगरानी करने से पायस संग्रह की समाप्ति के लिए अनुमति मिलेगी एक बार हाइड्रोगेल डिवाइस में इनपुट पर बंद नहीं होंगे, अन्यथा कैप्चर दक्षता प्रभावित होगी।
हमारी विधि के साथ एक संभावित चिंता यह है कि खमीर की माइक्रोजेल संस्कृति जीन अभिव्यक्ति को काफी बदल सकती है। पिछले माइक्रोगेल में खमीर जीन अभिव्यक्ति की जांच और आगर पर काम जीन अभिव्यक्ति औसत में मतभेदों को प्रदर्शित करता है, लेकिन कुल मिलाकर एक सकारात्मक संबंध17,हालांकि खमीर उपभेदों की एक किस्म पर इस दावे की आगे की जांच विवेकपूर्ण है । इस विधि में पॉइसन स्टैटिस्टिक्स14के बाद एमआरएनए कैप्चर मोतियों की स्टोकस्टिक लोडिंग के कारण सीमित सेल कैप्चर दक्षता भी होती है । वर्तमान में लगभग 10% बूंदों में एक बीड और एक कॉलोनी होती है, और डबल एनकैप्सुलेशन की दर 1% से कम होने की उम्मीद है। डबल एनकैप्सुलेशन आरएनए-सीक्यू डेटा विश्लेषण के दौरान भ्रमित तत्वों को जन्म देते हैं और उनका फ़िल्टरिंग23को चुनौतीपूर्ण बना हुआ है ; 25% की कैप्चर दर से डबल एनकैप्सुलेशन की इसी वृद्धि को 5%(पूरक चित्रा 2)तक ले जाया जाएगा। यद्यपि हम ड्रॉप-सीक्यू प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके आईसीओ-सीक्यू का प्रदर्शन करते हैं, अन्य बूंद आरएनए-सीक्यू प्लेटफ़ॉर्म हैं जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 10x जीनोमिक्स क्रोमियम प्लेटफॉर्म15,,24जैसे सांख्यिकीय रूप से निर्धारित रूप से एमआरएनए कैप्चर मोतियों को लागू करते हैं। आईसीओ-सीक्यू के साथ उन प्लेटफार्मों का एकीकरण क्या Poisson आंकड़े अनुमति से परे कब्जा क्षमता को बढ़ावा दे सकता है । अंत में, ड्रॉपलेट आरएनए-सीक्यू की एक मौलिक सीमा अनुक्रमण के बाद ब्याज की कोशिकाओं को ठीक करने में असमर्थता है। इस विधि का उपयोग करके विश्लेषण करने के लिए खमीर पुस्तकालयों के प्रकारों पर विचार करते समय इस सीमा को ध्यान में रखा जाना चाहिए।
ई कोलाई25 और एसजैसे रोगाणुओं के लिए क्लोनल स्तर पर सेल-टू-सेल विषमता का प्रदर्शन किया गया है । cerevisiae26 खुलासा नई सेल में कहा गया है कि एक थोक स्तर के विश्लेषण अंयथा मुखौटा होगा । सी एल्बिकान पर किए गए बल्क आरएनए-सीक्यू विश्लेषण या तो जनसंख्या-व्यापी प्रतिलेखन परिवर्तन, या सफेद और अपारदर्शी कोशिकाओं को दो अलग-अलग आबादी27,,28के रूप में देखते हैं। आईसीओ-सीक्यू का आवेदन अतिरिक्त उपराज्यों की खोज का कारण बन सकता है और अन्य खमीर प्रजातियों के भीतर नए सेल राज्यों की खोज के लिए एक विश्लेषणात्मक ढांचा प्रदान कर सकता है। हालांकि, हाइड्रोगेल के भीतर कोशिकाओं का विकास खमीर तक सीमित नहीं है: अन्य सेल प्रकार, जैसे स्तनधारी, बैक्टीरियल, और अन्य फंगल कोशिकाओं को हाइड्रोगेल29,,30के भीतर भी उगाया जा सकता है। एकल कोशिकाओं बनाम आइसोजेनिक उपनिवेशों के अनुक्रमण से सेल-टू-सेल भिन्नता के कारण जैविक शोर से औसत बाहर हो जाता है, सेल प्रकारों के बीच भेदभाव में सुधार होता है। यह उन कोशिकाओं का विश्लेषण करते समय मदद कर सकता है जहां विशिष्ट संश्लेषण मार्गों पर आनुवंशिक विविधता केंद्र होती है। आईसीओ-सीक्यू के लिए सेल प्रकार इनपुट की विस्तारित संभावनाएं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ड्रॉपलेट आरएनए-सीक्यू प्लेटफार्मों के साथ इसके संभावित एकीकरण आनुवंशिक स्तर पर सेलुलर विषमता को विच्छेदन के लिए एक आशाजनक मंच के रूप में आईसीओ-सीक्यू की स्थिति है।

माइक्रोबियल इंजीनियरिंग का एक प्राथमिक लक्ष्य रोगाणुओं को संशोधित करना है ताकि उन्हें मूल्यवान यौगिकों का उत्पादन करने के लिए प्रेरित किया जा सके1,2. एस सेरेविसिया अपनी संस्कृति में आसानी और इंजीनियरिंग के लिए उपलब्ध उपकरणों की चौड़ाई के3,4,5कारण माइक्रोबियल इंजीनियरिंग के लिए प्राथमिक जीव रहा है । हालांकि, संशोधित खमीर पर कार्यात्मक स्क्रीन प्रदर्शन करने में एक बाधा बनी हुई है: स्क्रीनिंग थ्रूपुट परिमाण के आदेशों से जीनोम इंजीनियरिंग से पीछे है। स्क्रीनिंग में आमतौर पर माइक्रोवेल प्लेटों में उपभेदों को अलग करना और एक विशिष्ट यौगिक6,7के उत्पादन को मापने के द्वारा उन्हें फेनोटाइप करना शामिल होता है । इस प्रक्रिया का थ्रूपुट सौ माइक्रोलीटर प्रतिक्रियाओं में व्यक्तिगत उपभेदों को पर्ण करने के लिए आवश्यक बड़ी मात्रा में रिएजेंट द्वारा सीमित है। ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लूइडिक्स सामान्य रूप से अच्छी प्लेटों8में किए गए प्रतिक्रियाओं को डाउनस्केलिंग करके परिमाण के आदेशों द्वारा खमीर स्क्रीनिंग के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए एक आकर्षक समाधान प्रदान करता है। हालांकि, प्लेट स्क्रीन के साथ, ड्रॉपलेट स्क्रीन आमतौर पर एकल उत्पाद यौगिकों का पता लगाती है, जो इंजीनियर मार्ग9,,10,,11के वैश्विक कार्य में सीमित जानकारी प्रदान करती है।
आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) सभी प्रासंगिक जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर को12,,13के साथ मूल्यांकन करने की अनुमति देकर मार्ग संचालन के अधिक व्यापक लक्षण वर्णन को सक्षम कर सकता है। इसके अलावा, ड्रॉपलेट विधियां हजारों कोशिकाओं को प्रति प्रयोग प्रोफाइल करने की अनुमति देती हैं, जो इंजीनियर वेरिएंट14,,15के पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए आवश्यक थ्रूपुट प्रदान करती हैं। हालांकि, आरएनए-सेक विधियों को स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जाता है; खमीर, तुलना करके, प्रति सेल कम एमआरएनए और एक सेल दीवार होती है जिसे16को हटाना मुश्किल होता है, मौजूदा तरीकों से उनके अनुक्रमण को रोकना पड़ता है। यदि खमीर आरएनए-सीक्यू को सक्षम करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट ड्रॉपलेट विधि तैयार की जा सकती है, तो यह खमीर इंजीनियरिंग के लिए एक स्केलेबल, लागत प्रभावी और सूचना युक्त फेनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म प्रदान करेगा।
हम उच्च थ्रूपुट ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लूइडिक्स17का उपयोग करके खमीर कोशिकाओं को अनुक्रमित करने के लिए हमारी हाल ही में विकसित विधि का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। सीमित आरएनए की चुनौती को दूर करने के लिए, हम पिकोटर हाइड्रोगेल क्षेत्रों में एकल खमीर कोशिकाओं को समझाते हैं और संस्कृति करते हैं। संस्कृति कोशिकाओं को डुप्लिकेट करती है, एक ही इंजीनियर मार्ग साझा करने वाली सैकड़ों प्रतियां देती है; यह एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति के कारण भिन्नता को कम करता है, जबकि अनुक्रमण के लिए उपलब्ध आरएनए की मात्रा में काफी वृद्धि करता है। संस्कृति आधारित प्रवर्धन के बाद, हम कोशिकाओं को स्गोला, थोक एंजाइमैटिक पाचन के माध्यम से सेल की दीवार को हटाने। कोशिका झिल्ली बरकरार रहती है, ताकि प्रत्येक आइसोजेनिक कॉलोनी और उससे जुड़े एमआरएनए अपने हाइड्रोगेल क्षेत्रों में समाहित रहें। यह हमें MRNA कैप्चर रिएजेंट्स और लिसिस बफर के साथ व्यक्तिगत उपनिवेशों को जोड़ी बनाने की अनुमति देता है, और एमआरएनए को ड्रॉप-एसईक्यू वर्कफ्लो14के बाद कैप्चर, बारकोड और अनुक्रमित करने की अनुमति देता है। हमारी विधि प्रति प्रयोग हजारों आइसोजेनिक खमीर कालोनियों की प्रतिलेखन-व्यापी स्क्रीनिंग की अनुमति देती है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Used to make TE-TW buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Used to make TE-TW buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for 3D print file</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>a9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel (hydrophobic glass treatment)</td>
			<td>Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drop-Seq Beads</td>
			<td>ChemGenes</td>
			<td>MACOSKO-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides (75 mm x 50 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionic Krytox Surfactant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>3M</td>
			<td>98-0212-2928-5</td>
			<td>Commonly knowns as HFE 7500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-2 polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-PFPE surfactant</td>
			<td>Ran Biotechnologies</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for mask designs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2150</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Used to make TE-TW buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YR Digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1001-1</td>
			<td>Spheroplasting buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YR Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1005</td>
			<td>Spheroplasting enzyme mixture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput yeast strain phenotyping with droplet-based rna sequencing

खमीर जीनोम को संपादित करने के लिए उपलब्ध शक्तिशाली उपकरणों ने इस माइक्रोब को इंजीनियरिंग के लिए एक मूल्यवान मंच बना दिया है। हालांकि अब लाखों आनुवंशिक रूप से अलग उपभेदों के पुस्तकालयों का निर्माण संभव है, एक वांछित फेनोटाइप के लिए स्क्रीनिंग एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। मौजूदा स्क्रीनिंग तकनीकों के साथ, सूचना उत्पादन और थ्रूपुट के बीच एक ट्रेडऑफ है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग आमतौर पर ब्याज के एक उत्पाद पर की जा रही होती है। इसलिए, हम आनुवंशिक रूप से इंजीनियर खमीर उपभेदों के आइसोजेनिक पिकोटर कालोनियों के लिए एकल सेल आरएनए अनुक्रमण को अनुकूलित करके तनाव स्क्रीनिंग में तेजी लाने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। खमीर कोशिकाओं पर आरएनए अनुक्रमण प्रदर्शन की अनूठी चुनौतियों का समाधान करने के लिए, हम आरएनए अनुक्रमण करने से पहले हाइड्रोगेल और स्फेरोप्लास्ट के भीतर आइसोजेनिक खमीर कालोनियों को संस्कृति देते हैं। आरएनए अनुक्रमण डेटा का उपयोग खमीर फेनोटाइप का अनुमान लगाने और इंजीनियर रास्तों को सुलझाने के लिए किया जा सकता है। हमारी विधि की स्केलेबिलिटी माइक्रोबियल इंजीनियरिंग में एक महत्वपूर्ण बाधा को संबोधित करती है।

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing at JoVE.com

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

माइक्रोबियल इंजीनियरिंग के 'डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट' चक्र में एक अड़चन वह गति है जिस पर हम उपभेदों की कार्यात्मक स्क्रीन कर सकते हैं। हम प्रति प्रयोग सैकड़ों से हजारों खमीर कोशिकाओं पर लागू तनाव स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि का वर्णन करते हैं जो ड्रॉपलेट-आधारित आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करता है।

ड्रॉपलेट-आधारित आरएनए अनुक्रमण के साथ उच्च थ्रूपुट खमीर तनाव फेनोटाइपिंग

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

आईसीओ, या आईसीओ-एसईक्यू रोगाणुओं के लिए उच्च-थ्रूपुट आरएनए अनुक्रमण का पहला अनुकूलन है। इस विधि ने जीनोम-व्यापी पैमाने पर माइक्रोबियल फ़ंक्शन का आकलन किया। इंजीनियर रोगाणुओं के लिए, यह विधि स्पष्ट कर सकती है कि माइक्रोबियल जीनोम में परिवर्तन इसके कार्यों को कैसे परेशान कर सकते हैं।एक निलंबन संस्कृति से खमीर प्राप्त करें, और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें। पीबीएस में कोशिकाओं को लगभग 750, 000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर फिर से निलंबित करें। इसके बाद, पीबीएस में अल्ट्रा-कम पिघलने वाले बिंदु को मिलाएं, और मिश्रण को 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, जब तक कि एगर उठे पिघल न जाएं।एक संलग्न 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ, एक सिरिंज में agarose मिश्रण लोड करें। एक स्पेस हीटर सेट के सामने एक सिरिंज पंप 80 डिग्री सेल्सियस तक रखें और सिरिंज को पंप में रखें। खमीर निलंबन के साथ एक दूसरी सिरिंज भरें, और फ्लोरिनेटेड तेल के साथ एक तीसरी सिरिंज भरें, 2% आयनिक फ्लोरोसिफैक्टेंट के साथ।दोनों सीरिंज को सिरिंज पंप में लोड करें। सीरिंज से ट्यूबिंग को डिवाइस ए में कनेक्ट करें एक बर्फ बाल्टी में 15 मिलीलीटर शंकु नली रखें, और आउटलेट ट्यूबिंग को शंकु नली में गाइड करें। प्रत्येक सिरिंज के लिए प्रवाह दर निर्धारित करें, और 15 मिलीलीटर शंकुवाक ट्यूब में पायस के लगभग एक मिलीलीटर एकत्र करें।ट्यूब में एगर उठे के लिए पांच मिनट इंतजार करने के बाद, पायस में फ्लोरिनेटेड तेल में 20% पेफ्लोरो-ऑक्टानॉल की बराबर मात्रा जोड़ें। कई बार शंकु नली को उलटा करके पायस और परफ्लोरो-ऑक्टानॉल मिलाएं। दो मिनट के लिए 2, 000 बार जी पर टूटे पायस को अपकेंद्रित्र करें।सुनिश्चित करें कि हाइड्रोगेल तेल और पीएफओ चरणों के ऊपर गोली हो गई है। तेल और पीएफओ चरणों को हटा दें। हाइड्रोगेल को फिर से निलंबित करने के लिए टीईटी (डब्ल्यू) बफर के दो मिलीलीटर जोड़ें।निलंबन को एक नए 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें। दो मिनट के लिए 2, 000 बार जी पर फिर से ट्यूब अपकेंद्रित्र। सुपरनेट निकालें, और टीईटी (डब्ल्यू) में हाइड्रोगेल्स को फिर से निलंबित करें।दो मिनट के लिए 2, 000 बार जी पर हाइड्रोगेल्स नीचे कताई के बाद, खमीर संस्कृति माध्यम के दो मिलीलीटर में हाइड्रोगेल को फिर से निलंबित करें। ट्यूब रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, मिलाते हुए के साथ । प्रत्येक उपभेदों अलग दरों पर बढ़ता है।एक उपयुक्त मीडिया और इनक्यूबेशन समय का चयन यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि खमीर हाइड्रोगेल के भीतर बढ़ता है, लेकिन अधिक वृद्धि नहीं करते हैं, जिससे मीडिया में बचने वाली कोशिकाएं होती हैं। सबसे पहले, हाइड्रोगेल्स को 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें। दो मिनट के लिए 2, 000 बार जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।पीबीएस के साथ दो बार हाइड्रोगेल धोएं और फिर एक बार गोलाकार बफर में। गोलाकार बफर में स्पेरोप्लास्टिंग एंजाइम का 40x कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। फिर, हाइड्रोगेल में पतला एंजाइम का एक मिलीलीटर जोड़ें।एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोजेल की ट्यूब को इनक्यूबेट करें। इलाज खमीर अधिक पारदर्शी दिखेगा। हाइड्रोजेल निलंबन युक्त ट्यूब से, ट्यूब के नीचे से निलंबन के 0.8 मिलीलीटर वापस लें, और इसे एक मिलीलीटर अनकैप्ड सिरिंज में स्थानांतरित करें।सिरिंज को 3डी प्रिंटेड सिरिंज होल्डर में रखें। दो मिनट के लिए 2, 000 बार जी पर सिरिंज और धारक अपकेंद्रित्र। आगे बढ़ने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि हाइड्रोगेल सिरिंज के नीचे कसकर पैक किए गए हैं।15 मिलीलीटर शंकु नली में 240, 000 ड्रॉप-सेक मोतियों को रखें। एक मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को हटा दें, और 500 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड के साथ 0.9x खमीर लाइसिस बफर के दो मिलीलीटर में मोतियों को फिर से निलंबित करें।एक हलचल बार डालें, और एक तीन मिलीलीटर सिरिंज के लिए मनका निलंबन हस्तांतरण। फ्लोरिनेटेड तेल में पीएफपीई-खूंटी सर्फेक्टेंट के कई मिलीलीटर युक्त एक और सिरिंज तैयार करें। खमीर क्लोन पैक हाइड्रोगेल के पहले से तैयार सिरिंज प्राप्त करें।एक्वासेस सिर को खाली करें, और सिरिंज को कैप करें। तीन सीरिंज, हाइड्रोगेल, मनका निलंबन, और सिरिंज पंपों में तेल डालें। ट्यूबिंग के माध्यम से सिरिंज को डिवाइस बी, एनकैप्सुलेशन डिवाइस से कनेक्ट करें।आउटलेट ट्यूबिंग के अंत को बर्फ पर 50-मिलीलीटर शंकु नली में रखें। प्रत्येक सिरिंज के लिए प्रवाह दर निर्धारित करें। पायस के लगभग 1, 000 मिलीलीटर ले लीजिए, या डिवाइस चलाने के लिए जब तक वहां कोई हाइड्रोगेल शेष हैं ।फिर सीडीएनए संश्लेषण, पुस्तकालय प्रस्तुत करने और अनुक्रमण के लिए ड्रॉप-एसईक्यू प्रोटोकॉल का पालन करें। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके, खमीर कोशिकाओं को 160-माइक्रोमीटर बूंदों में समझाया गया था। एक आठ गुना स्प्लिटर ने इन बूंदों को आठ ६०-माइक्रोमीटर बूंदों में विभाजित किया ।रातोंरात इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप कुछ हाइड्रोगेल के भीतर आइसोजेनिक यीस्ट उपनिवेश बढ़ रहे थे। दूसरे माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में खमीर हाइड्रोगेल लोड करने से पहले, उन्हें धोया गया और सेल दीवारों को पचाने के समाधान में डुबो दिया गया। उचित पाचन माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित किया गया था, इलाज खमीर कोशिकाओं के साथ एक अधिक चिंतनशील आकृति विज्ञान होने ।लाइसिस बफर में एमआरएनए कैप्चर मोतियों की एक धारा को दूसरे माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के ड्रॉप-मेकिंग जंक्शन से पहले क्लोज-पैक यीस्ट हाइड्रोगेल की धारा के साथ मिलाया गया था । परिणामस्वरूप पायस में, एकत्र की गई बूंदों में से लगभग 10% ने एक lysed कॉलोनी के साथ एक मनका निहित किया। इस आइसोजेनिक कॉलोनी अनुक्रमण कार्यप्रवाह का उपयोग सी एल्बिकान की सफेद अपारदर्शी स्विचिंग प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए किया गया था।प्रमुख घटक, पीसी, विश्लेषण और एक tSNE आयामी कमी नमूना डेटा सेट और एक संदर्भ डेटा सेट के बीच सामान्य सामंजस्य का संकेत दिया । TSNE विश्लेषण कोशिकाओं के तीन समूहों का पता चला । जबकि क्लस्टर दो मुख्य रूप से नमूना डेटा सेट से कोशिकाओं के शामिल किया गया था, क्लस्टर शूंय और एक दोनों नमूनों से कोशिकाओं के शामिल थे ।TSNE पर WH11 अभिव्यक्ति ओवरलेइंग ने संकेत दिया कि क्लस्टर एक की संभावना सफेद उपनिवेशों निहित है । STF2 अभिव्यक्ति क्लस्टर एक में वृद्धि हुई है, पहले से प्राप्त डेटा के अनुरूप । क्लस्टर शून्य और दो में, WH11 और STF2 क्लस्टर एक की तुलना में काफी नीचे विनियमित थे ।एंड्रोजन रोगाणुओं में विभिन्न प्रकार की बीमारियों के इलाज के लिए जीवविज्ञान का उत्पादन करने की क्षमता लगातार बढ़ती है। इस प्रक्रिया के बाद, अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न प्रकार के बायोइंफॉर्मेटिक टूल लागू हो सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

बायोमैटिरियल्स उच्च Throughput डिस्कवरी के लिए पॉलिमर माइक्रोएरे

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

उच्च throughput प्रोटीन अभिव्यक्ति मंच microfluidic नहीं एक जनरेटर का उपयोग

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

उच्च Throughput एकल - कक्ष और एकाधिक - कक्ष सूक्ष्म encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

पर चिप Endothelial भड़काऊ phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Replicative की सतत उच्च संकल्प सूक्ष्म अवलोकन नवोदित खमीर में एजिंग

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

आम तरल हैंडलिंग रोबोट पर TruTip प्रौद्योगिकी का उपयोग कर नैदानिक ​​नमूनों से डीएनए और आरएनए के उच्च throughput, स्वचालित निष्कर्षण

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

बैक्टीरिया के उच्च throughput पहचान चिकित्सा उपकरणों के लिए पॉलिमर से बचाने वाली क्रीम

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Gel-seq: एक साथ अनुक्रमण पुस्तकालय के लिए एक विधि डीएनए और आरएनए का उपयोग Hydrogel मैट्रिक्स की तैयारी

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

एकल-कक्ष जीनोम sequencing के लिए एक Ultrahigh-प्रवाह Microfluidic प्लेटफ़ॉर्म

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...