Name: high throughput yeast strain phenotyping with droplet-based rna sequencing
Uploaded: 2020-05-21T14:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing at JoVE.com

Este projeto foi apoiado pelo National Science Foundation Career Award DBI-1253293, National Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 e pela concessão R01HG008978, pelo National Science Foundation Technology Center grant DBI-1548297 e pelo UCSF Center for Cellular Construction. ARA e ZJG são Investigadores da Biohub Chan-Zuckerberg.

1. Fabricação de dispositivos microfluidos
<ol><li>Fabricação de mestre su-8<ol>
<li>Projete a máscara negativa para os canais microfluidos para os dispositivos A e B(Arquivo Suplementar 1 e 2)utilizando software de design assistido por computador e manuseie-os em filme de placa de circuito com resolução de pelo menos 10 μm.</li>
		<li>Coloque um wafer de silício limpo de 75 mm em uma coater de spin e despeje cerca de 1 mL de SU-8 em seu centro. Ligue o vácuo para prender o wafer no mandril.</li>
		<li>Para o dispositivo A, o spin coat SU-8 2150 a 500 rpm por 30 s, seguido por 30 s a 2.750 rpm. Para o dispositivo B, spin-coat SU-8 2100 a 500 rpm por 30 s, seguido por 30 s a 2.500 rpm. Isso produzirá camadas SU-8 de espessura de 200 μm e 120 μm, respectivamente.</li>
		<li>Retire o wafer do spin-coater e coloque em uma placa quente a 95 °C por 60 min para assar suavemente.</li>
		<li>Retire o wafer da placa quente e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Coloque a máscara em cima do wafer, e exponha sob um collimator de 190 mW, 365 nm DE LED UV por 2 min.</li>
		<li>Coloque o wafer em uma placa de aquecimento fixada a 95 °C por 5 min para assar pós-exposição.</li>
		<li>Remova o wafer e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Coloque o wafer em um banho de propilenoglicol monometil acetato de éter (PGMEA) por 20 min.</li>
		<li>Enxágüe o wafer com PGMEA seguido de isopropanol. Se algum resíduo opaco for visível durante este processo, repita a lavagem com PGMEA e isopropanol. Aar seque a wafer.</li>
		<li>Coloque o wafer em uma placa quente a 95 °C por 3 min.</li>
		<li>Remova e coloque o wafer em uma placa de Petri de 90 mm de diâmetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fundição polidimetilsiloxano (PDMS) no mestre SU-8<ol>
<li>Misture uma proporção de massa de 10:1 da base de silicone ao agente curador. Degas o PDMS depois de misturar por cerca de 30 min.</li>
		<li>Despeje PDMS desgasejado em cima do mestre SU-8 até que pelo menos uma camada de 5 mm de espessura seja formada em cima do wafer.</li>
		<li>Degas o PDMS em cima do wafer por cerca de 30 min.</li>
		<li>Coloque o wafer em um forno de 65 °C por pelo menos 80 min para curar o PDMS.</li>
		<li>Corte a laje pdms curada do wafer.</li>
		<li>Coloque a laje PDMS com as características microfluidas voltadas para cima, e furos de entrada e saída com um soco de biópsia de 0,75 mm.</li>
		<li>Limpe um slide de vidro de 50 mm x 75 mm com isopropanol e remova toda a poeira do lado das características microfluidas da laje PDMS com fita.</li>
		<li>Exponha o deslizamento de vidro limpo e a laje PDMS com as características microfluidas face até 100 Pa (1 mbar O2) plasma por 1 min.</li>
		<li>Coloque a laje PDMS com as características voltadas para baixo no escorregador de vidro para permitir a ligação. Coloque o escorregador em um forno de 65 °C por pelo menos 30 min para completar a ligação.</li>
		<li>Trate todos os canais microfluidos lavando com um fluido de tratamento de superfície fluorada. Asse o aparelho em um forno de 65 °C por pelo menos 10 min para evaporar o fluido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Encapsulamento de levedura em hidrogéis usando o dispositivo A
<ol><li>Tome fermento crescendo em uma cultura de suspensão e conte com um hemocytometer.</li>
	<li>Resuspender as células em salina tamponada fosfato (PBS) para uma concentração de cerca de 750 k/mL. Isso garante que 30% dos hidrogéis terão uma célula de levedura neles. Apenas cerca de metade das células de levedura crescem em colônias, levando a ~15% dos hidrogéis contendo colônias de leveduras.</li>
	<li>Misture o ponto de fusão ultrabaixo agarose a 2% c/v em PBS e aqueça a 90 °C até derreter. Isso leva ~10 min.</li>
	<li>Carregue a mistura de agarose em uma seringa com um filtro de 0,22 μm preso em uma bomba de seringa na frente do aquecedor espacial definido para 80 °C.</li>
	<li>Carregue uma seringa cheia com a suspensão de levedura e uma seringa contendo óleo fluorado com 2% de fluorosurfactante iônico18 em bombas de seringa.</li>
	<li>Pegue o dispositivo divisor de gota de cofluxo feito na seção 1 e conecte o tubo das seringas ao dispositivo. Guie a tubulação da tomada em um tubo cônico de 15 mL em um balde de gelo para coleta de gotas.</li>
	<li>Flua nas três soluções para o dispositivo com as seguintes taxas de fluxo:<ol>
<li>Flua a suspensão da levedura com a vazão de 3 mL/h.</li>
		<li>Flua a mistura de agarose à taxa de fluxo de 3 mL/h.</li>
		<li>Fluído o óleo fluorado à vazão de 15 mL/h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coletar cerca de 1 mL de emulsão. Aguarde mais 5 min para permitir que a agarose se afina.</li>
</ol>3. Quebrando e lavando gel para cultura
<ol><li>Adicione um volume igual de 20% de perfluorooctanol (PFO) em óleo fluorado à emulsão. Inverta o tubo cônico algumas vezes para permitir a mistura.</li>
	<li>Gire a emulsão quebrada a 2.000 x g por 2 min. Os géis vão pelotar acima das fases de óleo e PFO.</li>
	<li>Remova a fase do óleo e adicione 2 mL de tampão TE-TW (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20) para resuspender os géis. Transfira a suspensão para um novo tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Pelota para baixo os géis como na etapa 3.2 e lavar mais uma vez em TE-TW para um total de duas lavos.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e resuspenda os géis em 2 mL de mídia. Transfira para um tubo de cultura de 5 mL.</li>
	<li>Incubar a 30 °C durante a noite sob agitação. NOTA: Após a incubação durante a noite, os hidrogéis de levedura podem ser mantidos a 4 °C por vários dias.</li>
</ol>4. Lése da colônia de leveduras
<ol><li>Transfira os géis para um tubo cônico de 15 mL e hidrogéis de pelotas a 2.000 x g por 2 min.</li>
	<li>Lave hidrogéis em PBS 2x.</li>
	<li>Lave em 1x tampão esféponlasting1x.</li>
	<li>Realize uma diluição de 2-50x de enzima esheroplasting em tampão esheroplasting e adicione 1 mL aos hidrogéis.</li>
	<li>Incubar a 37 °C por 1h. A levedura tratada ficará mais transparente(Figura 3A).</li>
	<li>Pegue a parte inferior de 0,8 mL de suspensão de hidrogel e transfira para uma seringa sem tampa de 1 mL.</li>
	<li>Coloque a seringa no suporte de seringa impresso em 3D(arquivo suplementar 3) e gire a 2.000 x g por 2 min. Isso fará com que os hidrogéis fechem a embalagem na cabeça da seringa.</li>
</ol>5. captura de mRNA de colônias de leveduras lysed usando o dispositivo B
<ol><li>Pegue 240.000 contas Drop-Seq e transfira para um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Contas de gota drop-seq girando para baixo a 1.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Remova o supernadante e resuspenda as contas em 2 mL de levedura de 0,9x tampão de lyse levedura com cloreto de sódio de 500 mM para uma concentração de suspensão de contas de 120.000 contas/mL.</li>
	<li>Transfira a suspensão do talude para uma seringa de 3 mL com uma barra de agitação inserida.</li>
	<li>Prepare uma seringa contendo vários mililitros de 2% de perfluoropolyether-polietileno glicol (PFPE-PEG) em óleo fluorado.</li>
	<li>Evacuar toda a cabeça aquosa da seringa contendo hidrogéis bem embalados e tampar a seringa.</li>
	<li>Insira o hidrogel, a suspensão das abelhas e as seringas de óleo em bombas de seringa e conecte-se através de tubos no dispositivo de encapsulamento feito na seção 1.</li>
	<li>Conecte-se da tubulação de saída a um tubo cônico de 50 mL no gelo.</li>
	<li>Flua nas três soluções para o dispositivo com as seguintes taxas de fluxo:<ol>
<li>Espirre os hidrogéis a 0,4 mL/h.</li>
		<li>Flua a suspensão do talude a 0,4 mL/h.</li>
		<li>Fluído o óleo fluorado a 1,6 mL/h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coletar ~1 mL de emulsão ou executar o dispositivo até que não haja mais hidrogéis.</li>
</ol>6. geração de cDNA, seqüenciamento de preparação de biblioteca e sequenciamento
<ol><li>Adicionar 30 mL de buffer SSC de 6x e 1 mL de PFO à emulsão coletada conforme indicado no protocolo Drop-Seq14.</li>
	<li>Continue a seguir o protocolo Drop-Seq para gerar cDNA a partir de mRNA capturado em contas, sequenciando a preparação da biblioteca e sequenciando a análise de dados.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Nosso método para sequenciamento de RNA da colônia isogênica de levedura (ICO-seq) adapta uma plataforma de sequenciamento de RNA de célula única publicada, Drop-Seq, para triagem de alta produtividade de cepas de levedura projetadas. As células de levedura contêm menos de 10% das cópias de mRNA de uma célula típica de mamíferos e possuem uma parede celular que precisa ser degradada antes da captura de mRNA16. Esses dois fatores impedem a aplicação direta de leveduras em Drop-Seq ou outras plataformas scRNA-seq baseadas em gotículas. Para resolver essas questões, encapsulamos células únicas dentro de hidrogéis e as cultivamos em colônias para fornecer material de entrada suficiente para sequenciamento de RNA e digerimos a parede de células de levedura para gerar esheroplastos antes da captura de lysis e mRNA. Essas alterações adicionam complexidade adicional no fluxo de trabalho ICO-seq quando comparadas com o fluxo de trabalho original drop-seq e são etapas críticas que os usuários devem garantir que procedam sem problemas.
O funcionamento adequado do Dispositivo A é necessário para encapsular células de levedura únicas dentro de hidrogéis de agarose. A contagem adequada da suspensão de levedura de entrada deve ser seguida para minimizar o número de hidrogéis com mais de uma célula de levedura, ao mesmo tempo em que garante que hidrogéis suficientes contenham uma única célula para garantir uma eficiência razoável de captura de células durante a captura de mRNA. Durante a operação do dispositivo microfluido, a mistura de gel de agarose deve ser bem dissolvida e passar por um filtro de seringa para minimizar a chance de entupimento do dispositivo. A mistura de gel de agarose é viscosa e a região em que um único canal se divide em oito é especialmente propensa a entupimentos. Ao centralizar uma câmera de alta velocidade para visualizar a operação do dispositivo naquela região do dispositivo, os usuários podem monitorar a uniformidade das gotículas emergindo de cada um dos oito canais e reagir rapidamente se a uniformidade mudar devido a tamancos em qualquer um dos canais. A inspeção de uma pequena quantidade de emulsão coletada sob o microscópio fornece um método secundário para confirmar uma emulsão de alta qualidade.
Após o crescimento das colônias de leveduras dentro de hidrogéis, várias precauções são necessárias para garantir a extração de mRNA de qualidade no nível de uma única colônia. É importante otimizar o tempo que a levedura está na cultura dos hidrogel, pois se a levedura for deixada na cultura por muito tempo, muitos escaparão dos limites dos hidrogéis, levando a um sinal de fundo mais alto durante o sequenciamento do RNA e menor sensibilidade ao discriminar entre os tipos de células. A geração adequada de esheroplastos usando Zymolyase garante que o mRNA será liberado após a exposição celular ao tampão de lyse. A inspeção visual das colônias de leveduras após zymolyase deve produzir células de levedura mais brilhantes. A digestão inadequada da parede celular levará a uma menor eficiência de captura de RNA. Por último, os hidrogéis devem ser embalados de perto, pois são injetados no dispositivo B. O monitoramento da entrada de hidrogel com uma câmera de alta velocidade permitirá o término da coleta de emulsão uma vez que os hidrogéis não estejam mais fechados após a entrada no dispositivo, caso contrário, a eficiência de captura será impactada.
Uma preocupação potencial com nosso método é que a cultura de microgel da levedura pode alterar significativamente a expressão genética. Trabalhos anteriores que investigam a expressão genética da levedura em microgéis e em ágar demonstram diferenças nas médias de expressão genética, mas no geral uma correlação positiva17, embora uma investigação mais aprofundada desta alegação sobre uma variedade de cepas de levedura seja prudente. O método também tem eficiência limitada de captura de células devido ao carregamento estocástico de contas de captura de mRNA seguindo as estatísticas de Poisson14. Atualmente, cerca de 10% das gotas contêm uma conta e uma colônia, e espera-se que a taxa de encapsulamentos duplos seja inferior a 1%. Encapsulamentos duplos levam a elementos confusos durante a análise de dados RNA-seq e sua filtragem permanece desafiadora23; uma taxa de captura de 25% levaria a um aumento correspondente de encapsulamentos duplos para 5%(Figura Suplementar 2). Embora demonstremos ICO-seq usando a plataforma Drop-Seq, existem outras plataformas de Droplet RNA-seq que introduzem contas de captura de mRNA determinicamente e não estatisticamente, como a plataforma 10x Genomics Chromium15,24. A integração dessas plataformas com a ICO-seq poderia aumentar a eficiência de captura além do que as estatísticas de Poisson permitem. Por último, uma limitação fundamental do RNA-seq droplet é a incapacidade de recuperar células de interesse após o sequenciamento. Essa limitação deve ser levada em consideração ao considerar os tipos de bibliotecas de leveduras a serem analisadas usando este método.
A heterogeneidade celular-célula tem sido demonstrada no nível clonal para micróbios como E. coli25 e S. cerevisiae26 revelando novas células afirma que uma análise em nível de volume mascararia de outra forma. As análises de RNA-seq em massa realizadas em C. albicans tendem a olhar para as alterações de transcriptome em toda a população, ou células brancas e opacas como duas populações separadas27,28. A aplicação da ICO-seq poderia levar à descoberta de subestados adicionais e fornecer uma estrutura analítica para a descoberta de novos estados celulares dentro de outras espécies de leveduras. No entanto, o crescimento das células dentro dos hidrogéis não se limita à levedura: outros tipos de células, como mamíferos, bacterianos e outras células fúngicas também podem ser cultivados dentro de hidrogéis29,30. O sequenciamento de colônias isogênicas versus células individuais leva à média do ruído biológico devido à variação celular-célula, melhorando a discriminação entre os tipos de células. Isso pode ajudar na análise de células onde a diversidade genética se concentra em caminhos de síntese específicos. As possibilidades ampliadas de entrada do tipo celular à ICO-seq e sua potencial integração com plataformas de RNA-seq de gotículas disponíveis comercialmente posiciona a ICO-seq como uma plataforma promissora para dissecar a heterogeneidade celular no nível genético.

Um objetivo primário da engenharia microbiana é modificar micróbios para induzi-los a produzir compostos valiosos1,2. S. cerevisiae tem sido o organismo primário para a engenharia microbiana devido à sua facilidade de cultura e à amplitude de ferramentas disponíveis para a engenharia de seu genoma3,4,5. No entanto, um obstáculo permanece na realização de telas funcionais na levedura modificada: a triagem de throughput fica atrás da engenharia do genoma por ordens de magnitude. A triagem normalmente envolve isolar cepas em placas de micropoço e fenotipá-las medindo a produção de um composto específico6,7. O throughput deste processo é limitado pelas grandes quantidades de reagente necessárias para atribuir cepas individuais em cem reações de microlitros. A microfluido de gotículas fornece uma solução atraente para aumentar o throughput da triagem de leveduras por ordens de magnitude por reações de downscaling normalmente realizadas em placas de poço8. No entanto, como acontece com as telas de placas de poço, as telas de gotículas normalmente detectam compostos de um único produto, o que fornece informações limitadas sobre a função global da via projetada99,10,,11.
O sequenciamento de RNA (RNA-seq) pode permitir uma caracterização mais abrangente da operação do caminho, permitindo que os níveis de expressão de todos os genes relevantes sejam avaliados simultaneamente12,13. Além disso, os métodos de droplet permitem que milhares de células sejam perfiladas por experimento, fornecendo o throughput necessário para tela bibliotecas de variantes projetadas14,15. No entanto, os métodos RNA-seq são otimizados para células de mamíferos; a levedura, em comparação, tem menos mRNA por célula e uma parede celular que é difícil de remover16, impedindo seu sequenciamento pelos métodos existentes. Se um método de droplet de alto throughput pudesse ser criado para permitir o RNA-seq de levedura, ele forneceria uma plataforma de fenotipagem escalável, econômica e rica em informações para engenharia de leveduras.
Apresentamos um protocolo detalhado do nosso método recentemente desenvolvido para sequenciamento de células de levedura usando microfluidos de gotícula de alto throughput17. Para superar o desafio do RNA limitado, encapsulamos e culturamos células de levedura únicas em esferas de hidrogel picolitro. A cultura duplica as células, produzindo centenas de cópias compartilhando o mesmo caminho projetado; isso reduz a variação devido à expressão genética de células únicas, aumentando significativamente a quantidade de RNA disponível para sequenciamento. Após a amplificação baseada na cultura, esferofinaas as células, removendo a parede celular através de digestão enzimática a granel. As membranas celulares permanecem intactas, de modo que cada colônia isogênica e seu mRNA associado permanecem encapsulados em suas esferas de hidrogel. Isso nos permite emparelhar as colônias individuais com reagentes de captura de mRNA e buffer de lysis, e o mRNA a ser capturado, codificado e seqüenciado seguindo o fluxo de trabalho Drop-Seq14. Nosso método permite a triagem em toda a transcrição de milhares de colônias isogênicas de levedura por experimento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Used to make TE-TW buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Used to make TE-TW buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for 3D print file</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>a9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel (hydrophobic glass treatment)</td>
			<td>Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drop-Seq Beads</td>
			<td>ChemGenes</td>
			<td>MACOSKO-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides (75 mm x 50 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionic Krytox Surfactant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>3M</td>
			<td>98-0212-2928-5</td>
			<td>Commonly knowns as HFE 7500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-2 polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-PFPE surfactant</td>
			<td>Ran Biotechnologies</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for mask designs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2150</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Used to make TE-TW buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YR Digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1001-1</td>
			<td>Spheroplasting buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YR Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1005</td>
			<td>Spheroplasting enzyme mixture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput yeast strain phenotyping with droplet-based rna sequencing

As poderosas ferramentas disponíveis para editar genomas de levedura tornaram este micróbio uma plataforma valiosa para a engenharia. Embora agora seja possível construir bibliotecas de milhões de cepas geneticamente distintas, a triagem para um fenótipo desejado continua a ser um obstáculo significativo. Com as técnicas de triagem existentes, há uma troca entre produção de informações e rendimento, com triagem de alto rendimento normalmente sendo realizada em um produto de interesse. Portanto, apresentamos uma abordagem para acelerar o rastreamento de cepas, adaptando o sequenciamento de RNA unicelular a colônias de picolitros isogênicos de cepas de levedura geneticamente modificadas. Para enfrentar os desafios únicos de realizar sequenciamento de RNA em células de levedura, culturamos colônias de leveduras isogênicas dentro de hidrogéis e esheroplasto antes de realizar sequenciamento de RNA. Os dados de sequenciamento de RNA podem ser usados para inferir fenótipos de levedura e classificar caminhos projetados. A escalabilidade do nosso método aborda uma obstrução crítica na engenharia microbiana.

Adaptamos o fluxo de trabalho Drop-Seq anteriormente publicado14 para sequenciamento de colôniais isogênicas (ICO-seq) para realizar o perfil de expressão genética de colônias de leveduras isogênicas. Isolamos as células de levedura únicas e as encapsulamos em microgéis de agarose(Figura 1A). Após a incubação noturna de microgéis, essas células de levedura encapsuladas cresceram em colônias isogênicas. Antes de carregar géis em um segundo dispositivo microfluido para captura de mRNA, digerimos a parede celular de levedura para tornar o mRNA mais acessível(Figura 1B,esquerda). Nós fechamos esses microgéis e fundimos as contas de captura de mRNA e o tampão de lysis. Algumas gotículas continham exatamente uma gota emparelhada com uma colônia de leveduras. Todas as contas na emulsão foram coletadas e o cDNA sintetizado e sequenciado seguindo o protocolo Drop-Seq.
Geramos colônias de levedurais isogênicas através de encapsulamento de células de levedura única dentro de microgéis de agarose usando um dispositivo microfluido de coencapsulação com um divisor de oito gotas conectado(Figura 2A). Diluímos a suspensão de levedura de entrada para uma concentração de ~750.000/mL para que ~30% dos microgéis tenham exatamente uma levedura neles. Antes de inserir a agarose de temperatura de fusão ultrabaixa no dispositivo, dissolvemos-a a uma temperatura elevada e mantivemos a seringa a esta temperatura para evitar a gelação prematura. Na junção de geração de gota(Figura 2B),as células de levedura foram inicialmente encapsuladas em gotículas de 160 μm. Após a junção de geração de queda, um divisor de oito vezes dividiu essas gotículas em oito gotículas de 80 μm(Figura 2C). Um filtro de seringa foi anexado à agarose derretida para evitar que os tamancos se formassem dentro dos canais, que podem ser tão estreitos quanto 37 μm durante a divisão de gota. Coletamos a emulsão no gelo, que imediatamente iniciou o processo de gelação de agarose. Calculamos que a polidispersão de uma emulsão típica era de ~6%(Figura Suplementar 1),embora os valores de polidispersidade até 10% sejam aceitáveis. Uma vez que os géis de agarose se definiram, quebramos a emulsão e removemos a fase do óleo. Os géis foram lavados em tampão aquoso antes da imersão em meios de crescimento. A incubação noturna dos microgéis resultou em colônias isogênicas crescendo dentro de alguns dos microgéis(Figura 2D). A porcentagem de hidrogéis contendo colônias de pelo menos 20 células dependia das condições de cultura, incluindo tempo de incubação e composição da mídia. Em nossa demonstração usando C. albicans,determinamos que cerca de 15% dos hidrogéis continham uma colônia após 20 h de cultura de suspensão.
Um segundo dispositivo de coencapsulação extraiu o mRNA de colônias isogênicas (Figura 3A). Antes de carregar os microgéis de levedura no dispositivo microfluido, lavamos e imervamos os géis em uma solução para digerir as paredes das células de levedura. A digestão adequada das células de levedura foi verificada por microscopia, com levedura tratada com morfologia mais reflexiva(Figura 3B). Nós fechamos os microgéis em uma seringa e ajustamos a taxa de fluxo de entrada de gel de tal forma que um gel estava em cada gota. Um fluxo de contas de captura de mRNA no tampão de lysis misturado com o fluxo de gel fechado antes da junção de drop-making(Figura 3C). Coletamos uma emulsão resultante de gotículas de 160 μm, e colônias começaram a lonsar e liberar seu conteúdo celular. Carregamos contas em uma diluição limitante para minimizar o número de gotas contendo várias contas, mas a embalagem próxima dos géis durante a entrega resultou em cerca de 10% das gotas coletadas contendo uma gota com uma colônia lysed(Figura 3D).
Analisamos a expressão genética de C. albicans, uma espécie de levedura presente no microbioma intestinal humano, utilizando o fluxo de trabalho ICO-seq. C. albicans é notado por sua capacidade de alternar entre dois estados celulares diferentes, denominados branco e opaco19. Utilizamos uma cepa c albicans projetada, cepa RZY122, que substitui uma cópia do gene WH11, apenas ativa em células brancas com YFP20. Obtivemos um conjunto de perfis de expressão genética usando o fluxo de trabalho e os utilizamos para análise de colônias expressando pelo menos 300 genes únicos. Como conjunto de dados de referência, utilizou-se dados de expressão de C. Albicans obtidos a partir de um estudo publicado anteriormente17 e filtramos colônias expressando menos de 600 genes únicos. Após a realização da análise do componente principal (PC) e a redução da dimensionalidade de um vizinho t-estocástico (tSNE)21, encontramos concordância geral entre nosso conjunto de dados amostral e a referência(Figura 4A). A análise do PC revelou que o YFP e o WH11 contribuíram significativamente para os dois primeiros PC's. Além disso, a análise tSNE revelou três clusters(Figura 4B). Enquanto o cluster 2 era predominantemente composto por células do conjunto de dados amostral, os clusters 0 e 1 eram compostos por células de ambas as amostras. Ao sobrepor a expressão WH11 no tSNE(Figura 4C, painel superior), determinamos que o cluster 1 provavelmente continha colônias brancas. Verificou-se também que a expressão STF2 aumentou no cluster 1 (Figura 4C, painel inferior), consistente com os dados obtidos anteriormente17. Nos clusters 0 e 2, WH11 e STF2 foram significativamente desregulados em comparação com o cluster 1 (Figura 4D). Os genes envolvidos na fermentação, como o ADH1,foram regulados no cluster 0, consistentes com estudos anteriores de células opacas22. Descobrimos que as colônias no aglomerado 2 tinham diminuído o RNA ribossômico em comparação com colônias nos aglomerados 0 e 1. Embora os conjuntos de dados de amostra e referência tenham sido obtidos usando o mesmo estoque de células, este resultado sugere que mesmo diferenças sutis no manuseio experimental podem afetar a expressão genética.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61014/61014fig1v2.jpg"> Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho ICO-seq. (A) O cultivo de leveduras em uma cultura de suspensão foi diluído em tampão e coencapsulado com agarose derretida em um dispositivo gerador de gotículas com foco de fluxo para permitir o carregamento de microgéis de agarose com células de levedura únicas. Os géis se fixaram quando a agarose esfriou, a suspensão óleo/água foi quebrada, e o óleo foi removido, produzindo uma suspensão de contas de gel na água. Seguindo a cultura da noite para o dia, as células de levedura cresceram em colônias isogênicas dentro dos microgéis. (B) As colônias foram submetidas a um tampão de degradação da parede celular, após o qual foram embaladas e coencapsuladas com contas de captura de mRNA em um segundo dispositivo microfluido. A embalagem apertada dos microgéis garantiu que cada gota tivesse um gel, enquanto o carregamento de Poisson das contas reduziu a chance de múltiplas contas dentro de uma gota. As gotas coletadas foram processadas para a síntese de CDNA e geração de uma biblioteca de sequenciamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/61014fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61014/61014fig2v2.jpg"> Figura 2: Geração de colônias de leveduras isogênicas dentro de microgéis de agarose usando o Dispositivo A. (A) Esquemático do dispositivo microfluido, mostrando os locais das três entradas e portas de saída. A junção de drop-making é destacada em vermelho. (B) Close-up da junção de queda durante a operação normal do dispositivo. (C) Micrografo de gotículas coletadas, com um close-up de uma gotícula contendo uma célula encapsulada (inset). (D) Micrografia de colônias de leveduras isogênicas em microgéis de agarose após uma incubação de 24 horas, com um close-up de duas colônias (inset). Todas as barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/61014fig2v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61014/61014fig3v2.jpg"> Figura 3: Captura de lysis e mRNA de colônias isogênicas usando o Dispositivo B. (A) Esquemático do dispositivo microfluido, mostrando os locais das três entradas e portas de saída. A junção de drop-making é destacada em vermelho. (B) Micrografo de colônias de leveduras após a digestão da parede celular, com um close-up de uma colônia (inset). (C) Close-up da junção de queda durante o funcionamento normal do dispositivo. (D) Micrografo de emulsões coletadas após o emparelhamento de microgel e esferas, com um close-up mostrando uma gota com uma esfera e uma colônia de lysed (inset). Todas as barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/61014fig3v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61014/61014fig4v2.jpg"> Figura 4: Análise da resposta de comutação branco-opaca em C. albicans. (A) tSNE plot de um conjunto de dados amostral combinado com um conjunto de dados de referência de Liu17. (B)O agrupamento de transcriptomas revela três aglomerados visualizados em um enredo tSNE. (C) Os genes-chave envolvidos na resposta de comutação branco-opaco contribuíram para a variação determinada através da análise dos componentes principais. (D) Parcelas de violino de níveis de expressão normalizados de YFP e WH11 por clusters marcados no enredo tSNE. **indica p <<< 0,05 e * indica p << 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/61014fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figuras suplementares 1 e 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/jove_SI.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar esses filgures.</a>
Arquivos suplementares 1-3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61014/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esses arquivos.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing at JoVE.com

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Um gargalo no ciclo de "projeto-construção-teste" da engenharia microbiana é a velocidade com que podemos executar telas funcionais de cepas. Descrevemos um método de alto throughput para triagem de cepas aplicado a centenas a milhares de células de levedura por experimento que utiliza sequenciamento de RNA baseado em gotículas.

Fenotipagem de tensão de levedura de alta produtividade com sequenciamento de RNA baseado em gotículas

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

ICO, ou ICO-seq é a primeira adaptação do sequenciamento de RNA de alto rendimento para micróbios. Este método avaliou a função microbiana em uma escala genoma. Para micróbios projetados, este método pode elucidar como mudanças no genoma microbiano podem perturbado suas funções.Obtenha levedura de uma cultura de suspensão, e conte as células usando um hemócito. Suspenda as células da PBS a uma concentração de cerca de 750.000 células por mililitro. Em seguida, misture o ponto de fusão ultra-baixo na PBS, e aqueça a mistura a 90 graus Celsius, até que a agarose derreta.Carregue a mistura de agarose em uma seringa, com um filtro de 0,22 míces anexado. Coloque uma bomba de seringa na frente de um aquecedor espacial definido a 80 graus Celsius e coloque a seringa na bomba. Encha uma segunda seringa com a suspensão da levedura e encha uma terceira seringa com óleo fluorado, com fluorosurfactante 2% iônico.Coloque as duas seringas nas bombas de seringa. Conecte a tubulação das seringas ao dispositivo A.Coloque um tubo cônico de 15 mililitros em um balde de gelo e guie a tubulação de saída para o tubo cônico. Defina a taxa de fluxo para cada seringa e colete aproximadamente um mililitro de emulsão no tubo cônico de 15 mililitros.Depois de esperar cinco minutos para que a agarose no tubo seja definida, adicione um volume igual de 20% perfluoro-octanol em óleo fluorado à emulsão. Misture a emulsão e o perfluoro-octanol invertendo o tubo cônico algumas vezes. Centrifugar a emulsão quebrada a 2.000 vezes G por dois minutos.Certifique-se de que os hidrogéis foram pelotados acima das fases de óleo e PFO. Remova as fases de óleo e PFO. Adicione dois mililitros de tampão tet(W) para suspender os hidrogéis.Transfira a suspensão para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo novamente a 2.000 vezes G por dois minutos. Remova o supernatante e suspenda novamente os hidrogéis em tet(W)novamente.Depois de girar os hidrogéis a 2.000 vezes G por dois minutos, suspenda os hidrogéis em dois mililitros de meio de cultura de levedura. Incubar o tubo durante a noite a 30 graus Celsius, com agitação. Cada cepa cresce a taxas diferentes.A escolha de um tempo adequado de mídia e incubação é essencial para garantir que a levedura cresça dentro do hidrogel, mas não cresça demais, levando as células a escapar para a mídia. Primeiro, transfira os hidrogéis para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 2.000 vezes G por dois minutos.Lave os hidrogéis duas vezes com PBS e, em seguida, uma vez no tampão de esferoplastia. Realize uma diluição de 40x de enzima spheroplasting em tampão de esferoplastação. Em seguida, adicione um mililitro da enzima diluída aos hidrogéis.Incubar o tubo de hidrogéis a 37 graus Celsius por uma hora. A levedura tratada ficará mais transparente. Do tubo contendo a suspensão do hidrogel, retire 0,8 mililitros da suspensão da parte inferior do tubo e transfira-a para uma seringa sem tampa de um mililitro.Coloque a seringa no suporte de seringa impresso em 3D. Centrifugar a seringa e o suporte a 2.000 vezes G por dois minutos. Antes de prosseguir, certifique-se de que os hidrogéis estejam bem embalados na parte inferior da seringa.Coloque 240.000 contas de gota seq em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 1.000 vezes G por um minuto. Remova o supernascer e suspenda as contas em dois mililitros de tampão de levedura de 0,9x, com cloreto de sódio de 500 mililitros.Insira uma barra de mexida e transfira a suspensão da conta para uma seringa de três mililitros. Prepare outra seringa, contendo vários mililitros de surfactante PFPE-PEG em óleo fluorado. Obtenha a seringa previamente preparada de hidrogéis embalados com leveduras.Evacuar a cabeça do aquiesce, e tampar a seringa. Insira as três seringas, os hidrogéis, a suspensão das contas e o óleo nas bombas de seringa. Conecte as seringas através de tubos ao dispositivo B, o dispositivo de encapsulamento.Coloque a extremidade da tubulação de saída em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Defina a taxa de fluxo para cada seringa. Colete aproximadamente 1.000 mililitros de emulsão, ou execute o dispositivo até que não haja mais hidrogéis.Em seguida, siga o protocolo drop-seq para síntese de cDNA, preparação da biblioteca e sequenciamento. Usando um dispositivo microfluido, as células de levedura foram encapsuladas em gotículas de 160 micrômetros. Um divisor de oito vezes dividiu essas gotículas em oito gotículas de 60 micrômetros.A incubação noturna resultou em colônias de leveduras isogênicas crescendo dentro de alguns dos hidrogéis. Antes de carregar os hidrogéis de levedura no segundo dispositivo microfluido, eles foram lavados e imersos em uma solução para digerir as paredes celulares. A digestão adequada foi verificada por microscopia, com células de levedura tratadas com morfologia mais reflexiva.Um fluxo de contas de captura de mRNA no tampão de lise foi misturado com um fluxo de hidrogéis de levedura de embalagem fechada antes da junção de fabricação de gotas do segundo dispositivo microfluido. Na emulsão resultante, cerca de 10% das gotículas coletadas continham uma conta com uma colônia de lise. Este fluxo de trabalho de sequenciamento de colônia isogênica foi usado para analisar a resposta de comutação opaca branca dos c.albicans.Componente principal, PC, análise e redução de dimensionalidade do TSNE indicaram concordância geral entre o conjunto de dados da amostra e um conjunto de dados de referência. A análise do TSNE revelou três aglomerados de células. Enquanto o cluster dois foi predominantemente composto por células do conjunto de dados da amostra, os clusters zero e um foram compostos por células de ambas as amostras.Sobrepondo a expressão WH11 no tSNE indicou que o cluster provavelmente continha colônias brancas. A expressão STF2 aumentou no cluster um, consistente com os dados obtidos anteriormente. Nos clusters zero e dois, WH11 e STF2 foram significativamente regulados em comparação com o cluster um.Micróbios andrógenos têm um potencial cada vez maior para produzir em massa biológicos para o tratamento de uma grande variedade de doenças. Após este procedimento, pode-se aplicar uma variedade de ferramentas bioinformáticas para analisar melhor os dados de sequenciamento.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Bioengenharia

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Alta taxa de transferência de célula única e múltipla de células Micro-encapsulamento

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

High-throughput identificação de bactérias Polymers Repelente para dispositivos médicos

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Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

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Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

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