ICO, или ICO-seq, является первой адаптацией секвенирования РНК с высокой пропускной способностью к микробам. Этот метод оценивал микробную функцию в масштабах всего генома. Для инженерных микробов этот метод может прояснить, как изменения в геноме микробов могут возмущать его функции.
Получить дрожжи из культуры суспензии, и рассчитывать клетки с помощью гемоцитометра. Повторно приостанавливать клетки в PBS с концентрацией около 750 000 клеток на миллилитр. Затем смешайте сверхнизкие точки плавления агарозы в PBS и нагрейте смесь при температуре 90 градусов по Цельсию, пока агароза не растает.
Загрузите смесь агарозы в шприц с прикрепленным фильтром 0,22 микрона. Поместите шприц-насос перед обогревателем, установленным до 80 градусов по Цельсию, и поместите шприц в насос. Заполните второй шприц с дрожжевой суспензией, и заполнить третий шприц с фторированным маслом, с 2%ionic флюоросурфактант.
Загрузите оба шприца в шприц-насосы. Соедините трубки из шприцев с устройством A.Place 15-миллилитровую коническую трубку в ведро со льдом и направляем розетку в коническую трубку. Установите скорость потока для каждого шприца, и собрать примерно один миллилитр эмульсии в 15 миллилитров конической трубки.
После ожидания пять минут для агарозы в трубке, чтобы установить, добавить равный объем 20% перфторо-октанола в фторированном масле эмульсии. Смешайте эмульсию и перфторо-октанол, инвертировать коническую трубку несколько раз. Центрифуга сломанной эмульсии на 2000 раз G в течение двух минут.
Убедитесь, что гидрогели гранулированы над фазами масла и ПФО. Удалите фазы масла и ПФО. Добавьте два миллилитров tet (W)буфера, чтобы повторно приостановить гидрогели.
Перенесите подвеску в новую 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифуга трубки снова на 2000 раз G в течение двух минут. Удалите супернатант и снова приостановите гидрогели в тет(W).
После вращения вниз гидрогели на 2000 раз G в течение двух минут, повторно приостановить гидрогели в двух миллилитров дрожжевой культуры среды. Инкубировать трубку на ночь при 30 градусах по Цельсию, с тряской. Каждый штамм растет с разной скоростью.
Выбор соответствующих средств массовой информации и инкубации время имеет важное значение для обеспечения того, чтобы дрожжи растут в гидрогеле, но не перерастают, что приводит к клеткам побега в средствах массовой информации. Во-первых, перенесите гидрогели в 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифуга трубки на 2000 раз G в течение двух минут.
Вымойте гидрогели дважды с PBS, а затем один раз в буфер сферопластизации. Выполните 40-х разбавление фермента сферопластизации в буфере сферопластизации. Затем добавьте один миллилитр разбавленного фермента в гидрогели.
Инкубировать трубку гидрогеля при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. Обработанные дрожжи будут выглядеть более прозрачными. Из трубки, содержащей гидрогелевую подвеску, свяжете 0,8 миллилитров суспензии со дна трубки и перенесите ее в одноми миллилитр необнамещенный шприц.
Поместите шприц в держатель шприца с 3D-печатью. Центрифуга шприц и держатель на 2000 раз G в течение двух минут. Прежде чем приступить, убедитесь, что гидрогели плотно упакованы в нижней части шприца.
Поместите 240 000 бусинок drop-seq в 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифуга трубки в 1000 раз G в течение одной минуты. Удалите супернатант и повторно приостановите бисер в двух миллилитров 0,9x буфера дрожжевого лиза, с 500 миллимолярный хлорид натрия.
Вставьте бар для перемешивания и перенесите подвеску шарика в трехми миллилитровый шприц. Приготовьте еще один шприц, содержащий несколько миллилитров сурфактанта PFPE-PEG в фторированном масле. Получить ранее подготовленный шприц дрожжей клон упакованы гидрогели.
Эвакуируйте голову согласия и крышка шприца. Вставьте три шприца, гидрогели, подвеску шарика и масло в шприц-насосы. Подключите шприцы через трубки к устройству B, инкапсуляционное устройство.
Поместите конец розетки трубки в 50-миллилитровую коническую трубку на льду. Установите скорость потока для каждого шприца. Соберите около 1000 миллилитров эмульсии, или запустите устройство до тех пор, пока не осталось гидрогеля.
Затем следуйте протоколу drop-seq для синтеза cDNA, подготовки библиотеки и секвенирования. Используя микрофлюидное устройство, дрожжевые клетки инкапсулировались в 160-микрометровых каплях. Восьмикратный сплиттер разделил эти капли на восемь 60-микрометрных капель.
Ночная инкубация привела к тому, что изогенные дрожжевые колонии росли в некоторых гидрогелях. Перед загрузкой дрожжевых гидрогелей во второе микрофлюидное устройство их промыли и погрузили в раствор для переваривания клеточных стенок. Правильное пищеварение было проверено с помощью микроскопии, с обработанными дрожжевых клеток, имеющих более отражающей морфологии.
Поток шариков захвата мРНК в буфере лиза был смешан с потоком гидрогеля дрожжей близкого пакета до соединения второго микрофлюидного устройства. В результате эмульсии, около 10% собранных капель содержали один шарик с лизаной колонией. Этот изогенный рабочий процесс последовательности колонии был использован для анализа белой непрозрачной реакции переключения C.albicans.
Основной компонент, ПК, анализ и уменьшение размерности tSNE указывают на общее согласие между набором выборочных данных и набором справочных данных. Анализ TSNE выявил три кластера клеток. В то время как кластер два в основном состоял из ячеек из набора выборочных данных, кластеры ноль и один состоял из ячеек из обоих образцов.
Наложение выражения WH11 на tSNE указывает на то, что кластер один, вероятно, содержал белые колонии. Выражение STF2 увеличилось в кластере один, в соответствии с ранее полученными данными. В кластерах ноль и два, WH11 и STF2 были значительно вниз регулируется по сравнению с кластером 1.
Андрогенные микробы имеют все возрастающий потенциал для массового производства биопрепаратов для лечения широкого спектра заболеваний. После этой процедуры можно применить различные биоинформатические инструменты для дальнейшего анализа данных секвенирования.
