Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح 5R01GM115446 و 1R01GM130840.

الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول تم القتل الرحيم وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد القومية للصحة. وافقت لجنة رعاية الحيوان في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في هيوستن على جميع الأعمال الحيوانية.
1. إعداد الخلايا الليكلسات
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت lysis كما هو موضح في ا?...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina,+heart,+and+liver.">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin.">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li><li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets.">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li><li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets.">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li><li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes.">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pfl&#252;gers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).</li><li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+palmitoylation,+raft+localization,+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids.">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li><li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck.">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li><li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwissPalm:+Protein+Palmitoylation+database.">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4, 1-23 (2015).</li><li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+[3H]palmitic+acid.">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li><li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+are+IntechOpen+,+the+world's+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists.">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li><li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue.">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li><li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters.">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li><li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

هنا، نجحنا في استخدام فحص acyl-RAC للكشف عن S-acylation من البروتينات المختارة في كل من الخلايا البشرية المستزرعة والخلايا الأولية المستمدة من أنسجة الماوس. هذه الطريقة بسيطة وحساسة ، ويمكن تنفيذها بسهولة مع الحد الأدنى من متطلبات المعدات باستخدام تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية. وقد ثبت أن هذه ...

S-acylation هو تعديل عكسها بعد الترجمة التي تنطوي على إضافة سلسلة أسيل الدهنية إلى بقايا السيستين الداخلية على البروتين المستهدف عن طريق السندات ثيويستر labile1. تم الإبلاغ لأول مرة عن تعديل البروتينات مع البالميتات ، وهو حمض دهني مشبع بـ 16 كربونًا2، وبالتالي غالبًا ما يشار إلى هذا التعديل باسم S-palmitoylation. بالإضافة إلى البالميتات ، يمكن تعديل البروتينات بشكل عكسي من خلال مجموعة متنوعة من التشبع الأطول والأقصر (myristate و stearate) ، غير المشبعة (الأوليات) ومتعددة غير المشبعة (الأراكيدونات والإسيكوسابينتانات) الأحماض الدهنية3،4،5،6،7. في الخلايا eukaryotic، هو تحفيز S-acylzation من قبل عائلة من الإنزيمات المعروفة باسم acyltransferases البروتين DHHC ورد الفعل العكسي من السيستين deacylation هو تحفيز من قبل thioesterases البروتين، ومعظمها لا تزال غامضة8.
قابلية رابطة ثيويستر يجعل هذا التعديل الدهون عكسها، مما يسمح لها لتنظيم حيوي تجمع البروتين، وتوطين غشاء البلازما، والاتجار داخل الخلايا، والتفاعلات البروتين البروتين واستقرار البروتين9،10. وبالتالي، تم ربط S-acylation إلى العديد من الاضطرابات بما في ذلك مرض هنتنغتون، ومرض الزهايمر وعدة أنواع من السرطان (البروستاتا، المعدة، المثانة، الرئة، القولون والمستقيم)، مما يتطلب تطوير طرق موثوق بها للكشف عن هذا التعديل البروتين بعد الترجمة11.
العلامات الأيضية مع المشعة([3H]، [14C] أو[125I]) palmitate كان واحدا من النهج الأولى المتقدمة لأساية البروتين S-acylation12،13،14. ومع ذلك، الأساليب القائمة على العلامات الإشعاعية الحالية المخاوف الصحية، ليست حساسة جدا، وتستغرق وقتا طويلا، والكشف فقط عن الدهون من البروتينات وفيرة للغاية15. بديل أسرع وغير مشع لوضع العلامات الإشعاعية هو وضع العلامات الأيضية مع تحقيقات الأحماض الدهنية الحيوية، والتي تستخدم بشكل روتيني لتقويم ديناميات البروتين S-acylation16. في هذه الطريقة ، يتم دمج الأحماض الدهنية مع مراسل كيميائي (مجموعة الألكيين أو الأزيد) في البروتين S-acylated بواسطة acyltransferase البروتين. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition التفاعل (انقر الكيمياء) يمكن استخدامها بعد ذلك لإرفاق مجموعة وظيفية، مثل الفلوروفور أو البيوتين، إلى الأحماض الدهنية المتكاملة مما يسمح للكشف عن البروتين S-acylated17،18،19.
Acyl-biotin التبادل (ABE) هي واحدة من الطرق الكيميائية الحيوية المستخدمة على نطاق واسع لالتقاط وتحديد البروتينات S-acylated التي تتجاوز بعض أوجه القصور في وضع العلامات الأيضية مثل عدم ملاءمة لعينات الأنسجة15. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لتحليل S-acylation في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية، بما في ذلك الأنسجة وعينات الخلايا المجمدة20،21. ويستند هذا الأسلوب على الانقسام الانتقائي من السندات ثيويستر بين مجموعة acyl وبقايا السيستين من الهيدروكسيلامين محايدة. ثم يتم التقاط مجموعات ثيول المحررة مع مشتق البيوتين القائم على التفاعل مع ثيول. ثم يتم تنقية البروتينات الحيوية المتولدة باستخدام العقديات وتحليلها بواسطة المناعي.
تم تقديم نهج بديل يسمى acyl-resin بمساعدة القبض (Acyl-RAC) في وقت لاحق لاستبدال خطوة biotinylation مع اقتران مباشر من السيستينات الحرة من قبل راتنج ثيول التفاعلي22،23. هذه الطريقة لديها خطوات أقل بالمقارنة مع ABE وبالمثل يمكن استخدامها للكشف عن البروتين S-acylation في مجموعة واسعة من العينات1.
Acyl-RAC يتكون من 4 خطوات رئيسية(الشكل 1)، 1. حظر مجموعات ثيول الحرة؛ 2. الانقسام الانتقائي من السندات ثيويستر السيستين- أسيل مع الهيدروكسيلامين محايدة (HAM) لفضح مجموعات السيستين ثيول; 3. التقاط السيستينات الدهنية مع الراتنج ثيول التفاعلي؛ 4. الإثراء الانتقائي للبروتينات S-acylated بعد elution مع الحد من العازلة.
ويمكن بعد ذلك أن يتم تحليل البروتينات التي تم التقاطها عن طريق التنبولين المناعي أو إخضاعها لـ البروتيوميكس القائم على الكتلة (MS) لتقييم البروتيوم S-acylated في مجموعة متنوعة من الأنواع والأنسجة22،24،25. يمكن أيضًا تحديد مواقع S-acylation الفردية عن طريق هضم التربسين للبروتينات الملتقطة وتحليل الببتيدات الناتجة بواسطة LC-MS/MS22. هنا، نوضح كيف يمكن استخدام acyl-RAC للكشف المتزامن عن S-acylation من بروتينات متعددة في كل من خط الخلية وعينة الأنسجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

البروتين S-acylation، ويشار إليها أيضا باسم S-palmitoylation، هو تعديل عكسها بعد الترجمة من مخلفات السيستين مع الأحماض الدهنية طويلة السلسلة عن طريق السندات ثيويستر labile. ويمكن لـ S-acylation، الذي يظهر كآلية تنظيمية واسعة النطاق، أن تعدل تقريبا جميع جوانب النشاط البيولوجي للبروتينات، من التكوين المعقد إلى الاتجار بالبروتين واستقرار البروتين. وقد تحقق التقدم المحرز مؤخرا في فهم الوظيفة البيولوجية للبروتين S-acylation إلى حد كبير بسبب تطوير أدوات كيميائية حيوية جديدة تسمح بالكشف القوي والحساس للبروتين S-acylation في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. هنا، ونحن نصف acyl الراتنج بمساعدة القبض (Acyl-RAC)، وهي طريقة وضعت مؤخرا على أساس التقاط انتقائي من البروتينات S-acylated الذاتي ة من قبل الخرز سيفوريد رد الفعل ثيول. بالمقارنة مع النهج القائمة ، يتطلب Acyl-RAC خطوات أقل ويمكن أن تسفر عن نتائج أكثر موثوقية عندما يقترن بقياس الطيف الكتلي لتحديد أهداف S-acylation الجديدة. أحد القيود الرئيسية في هذه التقنية هو عدم القدرة على التمييز بين أنواع الأحماض الدهنية المرتبطة السيستينعبر نفس رابطة ثيويستر.

بعد البروتوكول المذكور أعلاه، استخدمنا لأول مرة acyl-RAC للكشف في وقت واحد S-acylation من العديد من البروتينات في خلايا جوركات، وهو خط خلية تال خالدة المستمدة أصلا من الدم المحيطي من مريض سرطان الدم خلية تي27. تم اختيار بروتينات الخلايا T التنظيمية التي تم تحديدها سابقًا باسم S-acylated<sup cla...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-RAC (Acyl-Resin المساعدة على التقاط) هو حساس للغاية وموثوق بها وسهلة لأداء طريقة للكشف عن تعديل الدهون عكسها من مخلفات السيستين (S-acylation) في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية.

الكشف عن البروتين S-Acylation باستخدام Acyl-الراتنج بمساعدة التقاط

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-الراتنج ساعد التقاط أو ACYL-RAC هو طريقة حساسة وموثوق بها التي يمكن استخدامها للكشف عن البروتين S-acylation في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. هذا البروتوكول يتجاوز بعض القيود المفروضة على وضع العلامات الأيضية ووضع العلامات الراديو، ويسمح الكشف في وقت واحد من S-acylation من البروتينات المتعددة. ليس فقط الخلايا الحية ولكن أيضا الأنسجة الأولية والعينات المجمدة.يمكن أن تنظم S-acylation مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية مثل الاتجار بالبروتين، واستهداف غشاء البلازما، ونقل الإشارة، ونقل الحديد، والتفاعلات البروتينية البروتينية. من المهم استخدام محلول هيدروكسيلامين الطازج مع الرقم الH المعدل بعناية لكل تجربة لضمان شق فعال ومحدد للسندات thioester. مع مظاهرة من هذه الطريقة انها حاسمة لخطوات مثل الكلوروفورم، الميثانول هطول الأمطار.وينبغي أن تكون بيليه شكل فطيرة التي تم الحصول عليها خلال هذه الخطوة التعامل بعناية فائقة. يمكن أن يكون هشا وفقدان جزئي للعينة خلال خطوة يمكن أن يؤدي إلى انتعاش العينة متفاوتة. إثبات الإجراء سيكون سافانا ويست، طالبة دراسات عليا من مختبرنا.للحصول على الخلايا، وجمع الخلايا ذات الاهتمام في أنبوب الطرد المركزي المخروطي. وإزالة أي حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي. غسل بيليه في 5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.وعلى الفور إعادة تثبيت الخلايا في 600 microliters من عازلة التحلل أعدت حديثا. تهيج العينة في 1,500 الثورات في الدقيقة الواحدة في شاكر الحرارة لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. قبل تطهير الليساتيات، بيليه المنظفات والمواد القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي.في نهاية الطرد المركزي، وجمع lysate مسح في ما قبل تبريد 1.5 ملليلتر microcentuge أنبوب على الجليد. وإجراء برادفورد أو bicinchoninic حمض المقايسة لتقدير تركيز البروتين وفقا للبروتوكولات القياسية. إضافة الميثانول والكلوروفورم إلى lysate في نسبة 2:1.هز بقوة لخلق تعليق متجانسة والطرد المركزي عينة لجمع بيليه البروتين في واجهة بين مراحل مائي وعضوية. إمالة الأنبوب، واستخدام إبرة أو هلام تحميل تلميح لpirate أكبر قدر ممكن من المذيبات. الهواء يجف بيليه البروتين لبضع دقائق.قبل خلط محتويات الأنبوب بلطف مع 600 ميكرولترات من الميثانول ، مع الحرص على عدم تفتيت بيليه. بعد إزالة بعناية غسل الميثانول، وتجفيف بيليه البروتين على أعلى مقاعد البدلاء لمدة خمس دقائق تقريبا. المقبل، resuspend بيليه البروتين في 200 ميكروليتر من 2SHB العازلة.ودوة في 42 درجة مئوية و 1,500 الثورات في الدقيقة في شاكر الحرارة. عندما يتم حل بيليه، إضافة 200 ميكرولترات من 0.2٪ MMTS في 2SHB إلى العينة. واحتضان البروتين لمدة 15 دقيقة في 42 درجة مئوية و 1500 الثورات في الدقيقة الواحدة في شاكر الحرارة.في نهاية الحضانة، أداء 3:4 ترسيبات الميثانول الكلوروفورم كما هو موضح. لإزالة MMTS، حل بيليه في 100 ميكرولترات من 2SHB العازلة الطازجة مع دوامة. وتمييع العينة مع 300 ميكرولترات من العازلة A بعد كل هطول الأمطار.بعد هطول الأمطار النهائي، حل العينات في 200 ميكرولترات من 2SHB العازلة وتمييع مع 240 ميكرولترات من العازلة A.Measure تركيز البروتين مرة أخرى وتوضع جانبا 40 ميكرولترات من كل عينة والضوابط المدخلات. تقسيم العينات إلى اثنين من وحدات التخزين متساوية من 200 ميكرولترات. ووضع علامة على الأنابيب بالإضافة إلى الهيدروكسيلين وناقص الهيدروكسيلين.إضافة 50 ميكروليترات من إعداد حديثا محايدة اثنين من الهيدروكسيل أمين المولار إلى تركيز نهائي من 400 ملليمولار إلى أنبوب الهيدروكسيلين زائد. و50 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم الولياري المحايد إلى التحكم السلبي، أنبوب الهيدروكسيلامين ناقص. ثم إضافة 30 microliters من الطين حبة TS إلى كل أنبوب.وتدوير الأنابيب لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة غسل الخرز أربع مرات مع 1٪ SDS في العازلة A لإزالة أي الهيدروكسيلامين المتبقية. بعد الغسيل الأخير، قم بغسل كل عينات الخرز بثلاثة عمليات طرد دقيقة صغيرة لطيفة.الطامح بعناية سراويل و resuspending الخرز في 500 ميكرولترات من 1٪ SDS في العازلة A في كل غسل. بعد الغسيل الأخير، تدور بلطف أسفل الخرز كما هو موضح. ويُفطّن أكبر قدر ممكن من الافرائب دون إزعاج الخرز.لاستعادة البروتينات من الخرز، إضافة 50 ميكرولترات من 4٪ SDS عينة العازلة لكل أنبوب واحتضان العينات في 80 درجة مئوية و 1،500 الثورات في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في شاكر الحرارة. في نهاية الحضانة، والسماح للعينات تبرد قبل الطرد المركزي إلى بيليه تماما الخرز. ثم استخدم تلميح تحميل الجل لنقل البروتينات المائلة إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر.وتشغيل العينات على هلام SDS-PAGE لتحليل S-acylation من البروتينات ذات الأهمية من قبل النشاف الغربية. يمكن الكشف عن التيروزين كيناز Lck في lysates تعامل مع محايدة اثنين من الهيدروكسيلامين المولار. لشق السندات thioester بين بقايا السيستين والحمض الدهني moiety.Stripping وإعادة استخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات Fyn وLAT تثبت أن acyl-resin ساعد في التقاط المقايسة يمكن استخدامها لتحليل S-acylation من البروتينات المتعددة في نفس الوقت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة الكشف عن S-acylation من Lck، فين، وLAT في splenocytes الماوس الأساسي. يشير إلى أن هذا التعديل يتم حفظه بين نوعين.بالإضافة إلى تحديد رواية S-acylated البروتينات، ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتقييم التغيرات في البروتين S-acylation تحت ظروف بيولوجية مختلفة. وقد زاد عدد البروتينات S-acylated التي تم تحديدها حديثًا بشكل كبير بعد أن كان الضعف يعني تقنية سريعة وموثوقة مثل Acyl-RAC. بالإضافة إلى تحديد رواية S-acylated البروتينات، ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتقييم التغيرات في البروتين S-acylation تحت ظروف بيولوجية مختلفة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

الكشف عن هيتيروديميريزيشن Isoforms البروتين باستخدام في الموقع قرب ربط التحليل

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

دراسة البروتين استيراد المعايشة باستخدام بروتوبلاستس

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...