Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud 5R01GM115446 og 1R01GM130840.

Mus, der anvendes i denne protokol blev aflivet i henhold til NIH retningslinjer. Animal Welfare Committee ved University of Texas Health Science Center i Houston godkendte alt dyrearbejde.
1. Fremstilling af cellelysater
<ol><li>Klargør lysisbufferen som beskrevet i tabel 1. Til 10 ml PBS tilsættes 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside vaskemiddel (DDM) og roteres for at opløse. Der tilsættes 100 μL fosfatasehæmmercocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) og proteasehæmmerco...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina,+heart,+and+liver.">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin.">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li><li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets.">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li><li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets.">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li><li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes.">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pfl&#252;gers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).</li><li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+palmitoylation,+raft+localization,+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids.">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li><li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck.">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li><li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwissPalm:+Protein+Palmitoylation+database.">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4, 1-23 (2015).</li><li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+[3H]palmitic+acid.">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li><li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+are+IntechOpen+,+the+world's+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists.">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li><li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue.">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li><li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters.">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li><li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

Her har vi med succes udnyttet acyl-RAC-analysen til at detektere S-acylation af udvalgte proteiner i både dyrkede humane celler og primære celler afledt af musevæv. Denne metode er enkel, følsom og kan nemt udføres med minimale udstyrskrav ved hjælp af standardbiokemiteknikker. Denne metode har vist sig at kunne identificere nye S-acylaterede proteiner såsom β-subenheden i proteintranslokaliseringssystemet (Sec61b), ribosomprotein S11 (Rps11) og mikrosomal glutathion-S-transferase 3 (MGST3)<sup class="x...

S-acylation er en reversibel posttranslationel modifikation, der indebærer tilsætning af en fedtacylkæde til en intern cysteinrest på et målprotein via en labile thioester-binding1. Det blev først rapporteret som en ændring af proteiner med palmitat, en mættet 16-carbon fedtsyrer2, og derfor denne ændring er ofte omtalt som S-palmitoyrlation. Ud over palmitat kan proteiner ændres reversibelt ved en række længere og kortere mættede fedtsyrer (myristat og stearate), enkeltumættede (oleate) og flerumættede fedtsyrer (arachidonate og eicosapentanoate) fedtsyrer3,4,5,6,7. I eukaryote celler katalyseres S-acylation af en familie af enzymer kendt som DHHC protein acyltransferases, og den omvendte reaktion af cysteindeacylation katalyseres af proteinthioesterases, hvoraf de fleste stadig er gådefulde8.
Labiliteten af thioester binding gør denne lipid modifikation reversibel, gør det muligt at dynamisk regulere protein klyngedannelse, plasma membran lokalisering, intracellulær handel, protein-protein interaktioner og protein stabilitet9,10. Derfor har S-acylation været forbundet med flere lidelser, herunder Huntingtons Sygdom, Alzheimers sygdom og flere former for kræft (prostata, gastrisk, blære, lunge, kolorektal), hvilket kræver udvikling af pålidelige metoder til at opdage denne post-translationelle protein modifikation11.
Metabolisk mærkning med radioaktivt ([3H], [14C] eller [125I]) palmitat var en af de første metoder udviklet til analyseprotein S-acylation12,13,14. Men, radiomærkning-baserede metoder udgør sundhedsmæssige bekymringer, er ikke meget følsomme, tidskrævende, og kun opdage lipidation af meget rigelige proteiner15. Et hurtigere og ikke-radioaktivt alternativ til radioaktiv mærkning er metabolisk mærkning med bioortogonale fedtsyresonder, som rutinemæssigt anvendes til analysedynamik af protein S-acylation16. I denne metode, en fedtsyre med en kemisk reporter (alkyne eller azide gruppe) er indarbejdet i S-acylated protein ved et protein acyltransferase. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaktion (klik kemi) kan derefter bruges til at knytte en funktionaliseret gruppe, såsom en fluorophore eller biotin, til den integrerede fedtsyre giver mulighed for påvisning af S-acylated protein17,18,19.
Acyl-biotin udveksling (ABE) er en af de udbredte biokemiske metoder til indfangning og identifikation af S-acylated proteiner, der omgår nogle af manglerne ved metabolisk mærkning såsom uegnet til vævsprøver15. Denne metode kan anvendes til analyse af S-acylation i en bred vifte af biologiske prøver, herunder væv og frosne celleprøver20,21. Denne metode er baseret på selektiv spaltning af thioesterbindingen mellem acylgruppen og cysteinrester ved neutral hydroxylamin. De befriede thiol grupper er derefter fanget med en thiol-reaktiv biotin derivat. De genererede biotinylated proteiner er derefter affinitet-renset ved hjælp af streptavidin agarose og analyseret ved immunblotting.
En alternativ tilgang, der kaldes acyl-harpiks assisteret fangst (Acyl-RAC), blev senere indført for at erstatte biotinylation-trinnet med direkte konjugering af frie cysteiner med en thiolreaktiv harpiks22,23. Denne metode har færre trin sammenlignet med ABE og kan ligeledes bruges til at detektere protein S-acylation i en lang række prøver1.
Acyl-RAC består af 4 hovedtrin (figur 1), 1. Blokering af frie thiol grupper; 2. Selektiv spaltning af cystein-acyl thioester obligation med neutral hydroxylamin (HAM) for at afsløre cystein thiol grupper; 3. Indfangning af lipidatiserede cysteiner med en thiol-reaktiv harpiks; 4. Selektiv berigelse af S-acylaterede proteiner efter eluering med reducerende buffer.
De tilfangetagne proteiner kan derefter analyseres ved immunblotting eller udsat for massespektrometri (MS) baseret proteomics at vurdere S-acylated proteom e i en varieret vifte af arter og væv22,24,25. Individuelle S-acylation steder kan også identificeres ved trypsin fordøjelse af de tilfangetagne proteiner og analyse af de resulterende peptider ved LC-MS/MS22. Her demonstrerer vi, hvordan acyl-RAC kan bruges til samtidig påvisning af S-acylation af flere proteiner i både en cellelinje og en vævsprøve.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

Protein S-acylation, også kaldet S-palmitoyrlation, er en reversibel posttranslationel ændring af cysteinrester med langkædede fedtsyrer via en labile thioester-binding. S-acylation, der er ved at opstå som en udbredt reguleringsmekanisme, kan modulere næsten alle aspekter af proteiners biologiske aktivitet, fra kompleks dannelse til proteinhandel og proteinstabilitet. De seneste fremskridt med hensyn til forståelse af protein S-acylations biologiske funktion blev opnået i vid udstrækning på grund af udviklingen af nye biokemiske værktøjer, der muliggør robust og følsom påvisning af protein S-acylation i en række biologiske prøver. Her beskriver vi acyl harpiks-assisteret fangst (Acyl-RAC), en nyligt udviklet metode baseret på selektiv indfangning af endogent S-acylated proteiner ved thiol-reaktiv sepharose perler. Sammenlignet med eksisterende tilgange kræver Acyl-RAC færre trin og kan give mere pålidelige resultater, når det kombineres med massespektrometri til identifikation af nye S-acylationsmål. En væsentlig begrænsning i denne teknik er den manglende evne til at skelne mellem fedtsyrearter knyttet til cysteiner via samme thioester obligation.

Efter den protokol, der er beskrevet ovenfor, vi første gang brugt acyl-RAC til samtidig at opdage S-acylation af flere proteiner i Jurkat celler, en udødeliggjort T-celle linje oprindeligt stammer fra det perifere blod af en T-celle leukæmi patient27. Regulatoriske T-celleproteiner, der tidligere var identificeret som S-acylateret9,28,29, blev valgt for at påvise nytten af denne metode., Som vist i <...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) er en meget følsom, pålidelig og nem at udføre metode til at opdage reversibel lipid ændring af cysteinrester (S-acylation) i en række biologiske prøver.

Påvisning af Protein S-Acylation ved hjælp af Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-harpiks assisteret fangst eller Acyl-RAC er en følsom og pålidelig metode, der kan bruges til at detektere protein S-acylation i en række biologiske prøver. Denne protokol omgår nogle af begrænsningerne ved metabolisk mærkning og radiomærkning og gør det muligt samtidig at detektion af S-acylation af flere proteiner. Ikke kun levende celler, men også primære væv og frosne prøver.S-acylation kan regulere en række cellulære processer såsom proteinhandel, plasmamembran målretning, signal transduktion, jern transport, og protein-protein interaktioner. Det er vigtigt at anvende frisklavet hydroxylaminopløsning med omhyggeligt justeret pH for hvert eksperiment for at sikre en effektiv og specifik spaltning af thioesterbindingen. Med en demonstration af denne metode er det afgørende for trin som chloroform, methanol nedbør.Pandekageformen pellet opnået under dette trin skal håndteres meget omhyggeligt. Det kan være skrøbeligt, og delvist tab af prøven under trinnet kan føre til ujævn prøvegenvinding. Demonstration af proceduren vil være Savannah West, en kandidat studerende fra vores laboratorium.For at opnå celle lysater, indsamle celler af interesse i en konisk centrifuge rør. Og fjern eventuelle cellerester ved centrifugering. Pellet i 5 milliliter PBS.Og straks resuspend cellerne i 600 mikroliter af frisklavet lysis buffer. Agitere prøven ved 1, 500 omdrejninger i minuttet i en termokande i 30 minutter ved fire grader Celsius. Før lysning, pellet vaskemiddel og opløseligt materiale ved centrifugering.Ved centrifugeringsslutninget opsamles det frigjorte lysat i et forkølet mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter på is. Og udføre en Bradford eller bicinchoninic syre assay at vurdere proteinkoncentrationen i henhold til standard protokoller. Methanol og kloroform til lysning i et 2:1 forhold.Ryst grundigt for at skabe en homogen suspension og centrifuge prøven for at indsamle et protein pellet på grænsefladen mellem de vandige og organiske faser. Vippe røret, skal du bruge en nål eller en gel loading tip til at aspirere så meget opløsningsmiddel som muligt. Lufttørre protein pellet i et par minutter.Før forsigtigt blande rørindholdet med 600 mikroliter methanol, passe på ikke at bryde op pellet. Efter omhyggeligt fjernelse af methanol vask, tør protein pellet på en bænk top i cirka fem minutter. Dernæst resuspenderet protein pellet i 200 mikroliter af 2SHB buffer.Og vortex på 42 grader Celsius og 1, 500 omdrejninger i minuttet i en termokander. Når pellets opløses, tilsættes 200 mikroliter på 0,2% MMTS i 2SHB til prøven. Og inkuber proteinet i 15 minutter ved 42 grader Celsius og 1, 500 omdrejninger i minuttet i en termokar shaker.Ved inkubationens afslutning udføres 3:4 chloroform-methanoludfældninger som påvist. For at fjerne MMTS, opløse pellet i 100 mikroliter af frisk 2SHB buffer med vortexing. Prøven fortyndes med 300 mikroliter buffer A efter hver udfældning.Efter den endelige udfældning opløses prøverne i 200 mikroliter af 2SHB-buffer og fortyndes med 240 mikroliter buffer A.Mål proteinkoncentrationen igen, og der udtages 40 mikroliter fra hver prøve som inputkontrol. Opdel prøverne i to lige store mængder 200 mikroliter. Og markere rørene som plus hydroxylamin og minus hydroxylamin.Der tilsættes 50 mikroliter frisklavet neutral to molarhydrylamin til en endelig koncentration på 400 millimolar til plushydrylaminrøret. Og 50 mikroliter af neutral to molar natriumchlorid til den negative kontrol, en minus hydroxylamin rør. Derefter tilsættes 30 mikroslitere TS perle gylle til hvert rør.Og drej rørene i en til to timer ved stuetemperatur. Ved slutningen af inkubationen vaskes perlerne fire gange med 1%SDS i buffer A for at fjerne eventuel resterende hydroxylamin. Efter den sidste vask vaskes alle perleprøverne med tre blide mikrocentrifugeringer på et minut.Forsigtigt indsugning supernatanter og resuspending perlerne i 500 mikroliter af 1%SDS i buffer A ved hver vask. Efter den sidste vask, drej forsigtigt ned perlerne som vist. Og aspirere så meget supernatant som muligt uden at forstyrre perlerne.For at genvinde proteinerne fra perlerne tilsættes 50 mikroliter af 4% SDS prøvebuffer til hvert rør og inkubere prøverne ved 80 grader Celsius og 1.500 omdrejninger i minuttet i 15 minutter i en termokaste. I slutningen af inkubationen, lad prøverne afkøle før centrifugering til helt pellet perlerne. Brug derefter en gel læssetip til at overføre de eluterede proteiner til nye 1,5 milliliterrør.Og køre prøverne på en SDS-PAGE gel til at analysere S-acylation af proteiner af interesse ved vestlige blotting. Tyrosin kinase Lck kan påvises i lysater behandlet med neutrale to molar hydroxylamin. at kløve thioester-bindingen mellem cysteinrester og fedtsyremoiety.Stripning og reprobing med antistoffer mod proteiner Fyn og LAT viser, at acyl-harpiks assisteret opsamlingsanalyse kan bruges til at analysere S-acylation af flere proteiner på samme tid. Derudover kan S-acylation af Lck, Fyn og LAT let kunne detekteres i primære musespletter. Angiver, at denne ændring er bevaret mellem to arter.Ud over identifikation af nye S-acylated proteiner, denne metode kan også bruges til at vurdere ændringer i protein S-acylation under forskellige biologiske forhold. Antallet af nyligt identificerede S-acylated proteiner er steget voldsomt efter dobbelt op betød en hurtig, og pålidelig teknik såsom Acyl-RAC. Ud over identifikation af nye S-acylated proteiner, denne metode kan også bruges til at vurdere ændringer i protein S-acylation under forskellige biologiske forhold.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese til forbedret påvisning af protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisning af Heterodimerization af Protein isoformer ved hjælp af en in Situ nærhed ligatur Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

At studere Protein Import til grønkorn ved hjælp af Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Opsamling og identifikation af RNA-bindende proteiner ved hjælp af klik kemi-assisteret RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...