Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
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Ces travaux ont été soutenus par les subventions des National Institutes of Health 5R01GM115446 et 1R01GM130840.

Les souris utilisées dans ce protocole ont été euthanasiées selon les lignes directrices des NIH. Le Comité du bien-être des animaux de l’Université du Texas Health Science Center à Houston a approuvé tous les travaux sur les animaux.
1. Préparation des lysates cellulaires
<ol><li>Préparer le tampon de lyse tel que décrit dans le tableau 1. À 10 ml de PBS, ajouter 0,1 g de détergent n-dodecyl -D-maltoside (DDM) et tourner pour se dissoudre. Ajouter 100 l de c...

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	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

Ici, nous avons utilisé avec succès l’essai acyl-RAC pour détecter l’acylation S de certaines protéines dans les cellules humaines cultivées et les cellules primaires dérivées du tissu de souris. Cette méthode est simple, sensible, et peut être facilement effectuée avec des exigences minimales d’équipement en utilisant des techniques de biochimie standard. Il a été démontré que cette méthode identifie avec succès de nouvelles protéines S-acylated telles que le sous-unité du système de translocat...

S-acylation est une modification post-translationnelle réversible impliquant l’ajout d’une chaîne d’acyl gras à un résidu interne de cystéine sur une protéine cible via un lien de thioester labile1. Il a d’abord été rapporté comme une modification des protéines avec le palmitate, un acide gras saturé de 16-carbone2, et donc cette modification est souvent appelée S-palmitoylation. En plus du palmitate, les protéines peuvent être modifiées de façon réversible par une variété d’acides gras saturés plus longs et plus courts (myristate et stéarate), monoinsaturés (oleate) et polyinsaturés (arachidonate et eicosapentanoate)3,4,5,6,7. Dans les cellules eucaryotes, S-acylation est catalysée par une famille d’enzymes connues sous le nom d’acyltransferases de protéines DHHC et la réaction inverse de la déphalatation de la cystéine est catalysée par des thioesterases protéiques, dont la plupart restent énigmatiques8.
La labilité du lien thioester rend cette modification lipidique réversible, lui permettant de réguler dynamiquement le regroupement des protéines, la localisation de membrane plasmatique, le trafic intracellulaire, les interactions protéines-protéines et la stabilité protéique9,10. Par conséquent, la S-acylation a été liée à plusieurs troubles, y compris la maladie de Huntington, la maladie d’Alzheimer et plusieurs types de cancer (prostate, gastrique, vessie, poumon, colorectal), qui nécessite le développement de méthodes fiables pour détecter cette modification de protéine post-translationnelle11.
L’étiquetage métabolique avec le palmitate radioactif([3H], [14C] ou [125I]) a été l’une des premières approches développées pour assayer la protéine S-acylation12,13,14. Cependant, les méthodes radio-étiquetées présentent des problèmes de santé, ne sont pas très sensibles, prennent beaucoup de temps, et ne détectent la lipidation des protéines très abondantes15. Une alternative plus rapide et nonradioactive à la radiolabeling est l’étiquetage métabolique avec des sondes d’acides gras bioorthogonal, qui est utilisé régulièrement pour assayer la dynamique de la protéine S-acylation16. Dans cette méthode, un acide gras avec un journaliste chimique (alkyne ou groupe d’azide) est incorporé dans la protéine S-acylated par une ayltransferase de protéine. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaction (click chemistry) peut alors être utilisé pour attacher un groupe fonctionnalisé, comme un fluorophore ou une biotine, à l’acide gras intégré permettant la détection de la protéine S-acylé17,18,19.
L’échange d’acyl-biotine (ABE) est l’une des méthodes biochimiques largement utilisées pour la capture et l’identification des protéines sycylées qui contourne certaines des lacunes de l’étiquetage métabolique tels que l’inadapté pour les échantillons de tissus15. Cette méthode peut être appliquée pour l’analyse de l’acylation S dans une gamme variée d’échantillons biologiques, y compris les tissus et les échantillons de cellules congelées20,21. Cette méthode est basée sur le clivage sélectif du lien de thioester entre le groupe d’acyl et le résidu de cystéine par hydroxylamine neutre. Les groupes de thiol libérés sont ensuite capturés avec un dérivé de la biotine thiol-réactif. Les protéines biotinylated générées sont alors affinity-purified utilisant l’agarose de streptavidine et analysées par immunoblotting.
Une approche alternative appelée capture assistée acyl-résine (Acyl-RAC) a été plus tard introduite pour remplacer l’étape de biotinylation par la conjugaison directe des cystéines libres par une résine thiol-réactive22,23. Cette méthode a moins d’étapes par rapport à ABE et peut également être utilisé pour détecter la protéine S-acylation dans un large éventail d’échantillons1.
Acyl-RAC se compose de 4 étapes principales (figure 1), 1. Blocage des groupes de thiol libres; 2. Clivage sélectif du lien cystéine-acyl thioester avec l’hydroxylamine neutre (HAM) pour exposer les groupes de thiol de cystéine ; 3. Capturer les cystéines lipidées avec une résine thiol-réactive ; 4. Enrichissement sélectif des protéines S-acylated après l’elution avec la réduction du tampon.
Les protéines capturées peuvent ensuite être analysées par immunoblotting ou soumises à la protéomique basée sur la spectrométrie de masse (SEP) pour évaluer le protéome S-acylé dans une gamme variée d’espèces et de tissus22,24,25. Les sites individuels d’acylation de S peuvent également être identifiés par la digestion de trypsine des protéines capturées et l’analyse des peptides résultants par LC-MS/MS22. Ici, nous démontrons comment l’acyl-RAC peut être employé pour la détection simultanée de S-acylation des protéines multiples dans une ligne cellulaire et un échantillon de tissu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

La protéine S-acylation, également appelée S-palmitoylation, est une modification post-translationnelle réversible des résidus de cystéine avec des acides gras à longue chaîne par l’intermédiaire d’un lien de thioester labile. La s-acylation, qui apparaît comme un mécanisme de régulation répandu, peut moduler presque tous les aspects de l’activité biologique des protéines, de la formation complexe au trafic de protéines et à la stabilité des protéines. Les progrès récents dans la compréhension de la fonction biologique de la protéine S-acylation ont été réalisés en grande partie grâce au développement de nouveaux outils biochimiques permettant la détection robuste et sensible de la protéine S-acylation dans une variété d’échantillons biologiques. Ici, nous décrivons la capture assistée par la résine d’acyl (Acyl-RAC), une méthode récemment développée basée sur la capture sélective des protéines endogènes S-acylated par des perles de Sepharose thiol-réactives. Par rapport aux approches existantes, Acyl-RAC nécessite moins d’étapes et peut produire des résultats plus fiables lorsqu’il est couplé avec la spectrométrie de masse pour l’identification de nouvelles cibles D’acylation S. Une limitation majeure dans cette technique est le manque de capacité à discriminer entre les espèces d’acides gras attachés aux cystéines par le même lien de thioester.

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons d’abord utilisé acyl-RAC pour détecter simultanément S-acylation de plusieurs protéines dans les cellules de Jurkat, une lignée immortalisée de lymphocytes T à l’origine dérivée du sang périphérique d’un patient de leucémie de cellule T27. Les protéines de cellules T réglementaires précédemment identifiées comme S-acylated9,28,29 on...

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Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) est une méthode très sensible, fiable et facile à exécuter pour détecter la modification réversible des lipides des résidus de cystéine (S-acylation) dans une variété d’échantillons biologiques.

Détection de la protéine S-Acylation à l’aide de capture assistée Acyl-Resin

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-résine assistée capture ou Acyl-RAC est une méthode sensible et fiable qui peut être utilisé pour détecter la protéine S-acylation dans une variété d’échantillons biologiques. Ce protocole contourne certaines des limitations de l’étiquetage métabolique et de l’étiquetage radio, et permet la détection simultanée de l’acylation S de protéines multiples. Non seulement les cellules vivantes, mais aussi les tissus primaires et les échantillons congelés.La s-acylation peut réguler une variété de processus cellulaires tels que le trafic de protéines, le ciblage de la membrane plasmatique, la transduction de signaux, le transport du fer et les interactions protéine-protéine. Il est important d’utiliser une solution d’hydroxylamine fraîchement préparée avec un pH soigneusement ajusté pour chaque expérience afin d’assurer un clivage efficace et spécifique de la liaison thioester. Avec une démonstration de cette méthode, il est essentiel pour des étapes comme le chloroforme, les précipitations de méthanol.La pastille en forme de crêpe obtenue au cours de cette étape doit être manipuler très soigneusement. Il peut s’agir d’une perte fragile et partielle de l’échantillon au cours de l’étape qui peut mener à une récupération inégale de l’échantillon. Savannah West, une étudiante diplômée de notre laboratoire, démontrera la procédure.Pour obtenir des lysates cellulaires, recueillir les cellules d’intérêt dans un tube de centrifugeuse conique. Et enlever tous les débris cellulaires par centrifugation. Laver la pastille en 5 millilitres de PBS.Et résuspendez immédiatement les cellules dans 600 microlitres de tampon de lyse fraîchement préparé. Agiter l’échantillon à 1500 révolutions par minute dans un thermo-shaker pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Avant de déblayer les lysates, le détergent à granulés et les matières solubles par centrifugation.À la fin de la centrifugation, recueillir le lysate autorisé dans un tube de microcentrifugeuse pré-refroidi de 1,5 millilitre sur la glace. Et effectuer un essai d’acide bradford ou bicinchoninique pour estimer la concentration en protéines selon les protocoles standard. Ajouter le méthanol et le chloroforme pour lyser à un rapport de 2:1.Agiter rigoureusement pour créer une suspension homogène et centrifugeuse de l’échantillon pour recueillir une pastille protéique à l’interface entre les phases aqueuse et organique. Incliner le tube, utiliser une aiguille ou une pointe de chargement de gel pour aspirer autant de solvant que possible. Séchez à l’air la pastille protéinique pendant quelques minutes.Avant de mélanger doucement le contenu du tube avec 600 microlitres de méthanol, en prenant soin de ne pas casser la pastille. Après avoir soigneusement enlevé le lavage au méthanol, séchez la pastille protéique sur un dessus de banc pendant environ cinq minutes. Ensuite, réutilisez la pastille protéique dans 200 microlitres de tampon 2SHB.Et vortex à 42 degrés Celsius et 1500 révolutions par minute dans un thermo-shaker. Lorsque la pastille est dissoute, ajouter 200 microlitres de 0,2 %MMTS en 2SHB à l’échantillon. Et incuber la protéine pendant 15 minutes à 42 degrés Celsius et 1500 révolutions par minute dans un thermo-shaker.À la fin de l’incubation, effectuer 3:4 précipitations de chloroforme-méthanol comme démontré. Pour enlever le MMTS, dissoudre la pastille en 100 microlitres de tampon 2SHB frais avec vortex. Et diluer l’échantillon avec 300 microlitres de tampon A après chaque précipitation.Après les précipitations finales, dissoudre les échantillons dans 200 microlitres de tampon 2SHB et diluer avec 240 microlitres de tampon A.Mesurer la concentration de protéines à nouveau et mettre de côté un 40 microlitres de chaque échantillon que les contrôles d’entrée. Divisez les échantillons en deux volumes égaux de 200 microlitres. Et marquer les tubes comme plus l’hydroxylamine et moins l’hydroxylamine.Ajouter 50 microlitres d’hydroxylamine neutre fraîchement préparée à deux molaires à une concentration finale de 400 millimolaires au tube d’hydroxylamine plus. Et 50 microlitres de chlorure neutre de sodium deux molaires au contrôle négatif, un tube d’hydroxylamine moins. Ajouter ensuite 30 microlitres de boue de perles TS à chaque tube.Et faites pivoter les tubes pendant une à deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation laver les perles quatre fois avec 1%SDS dans le tampon A pour enlever toute hydroxylamine résiduelle. Après le dernier lavage, laver tous les échantillons de perles avec trois microcentrifugations douces d’une minute.Aspirer soigneusement les supernatants et resuspendre les perles dans 500 microlitres de 1%SDS dans le tampon A à chaque lavage. Après le dernier lavage, faites tourner doucement les perles comme démontré. Et aspirer autant de surnatant que possible sans déranger les perles.Pour récupérer les protéines des perles, ajouter 50 microlitres de tampon échantillon SDS de 4% à chaque tube et incuber les échantillons à 80 degrés Celsius et 1500 révolutions par minute pendant 15 minutes dans un thermo-shaker. À la fin de l’incubation, laisser refroidir les échantillons avant de les centrifuger pour pelleter complètement les perles. Ensuite, utilisez une pointe de chargement de gel pour transférer les protéines élutées dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre.Et exécutez les échantillons sur un gel SDS-PAGE pour analyser l’acylation S des protéines d’intérêt par le ballonnement occidental. Tyrosine kinase Lck peut être détecté dans les lysates traités avec deux hydroxylamines molaire neutres. pour fendre le lien thioester entre les résidus de cystéine et la moiety d’acide gras.Le décapage et le reprobage avec des anticorps contre les protéines Fyn et LAT démontrent que l’essai assisté de capture d’acyl-résine peut être employé pour analyser s-acylation des protéines multiples en même temps. En outre, la s-acylation de Lck, Fyn, et LAT peut être facilement détectée dans les splenocytes primaires de souris. Indiquant que cette modification est conservée entre deux espèces.En plus de l’identification de nouvelles protéines acylated S, cette méthode peut également être utilisée pour évaluer les changements dans la protéine S-acylation dans différentes conditions biologiques. Le nombre de protéines s-acylated nouvellement identifiées a augmenté énormément après que le double-up ait signifié une technique rapide et fiable telle qu’Acyl-RAC. En plus de l’identification de nouvelles protéines acylated S, cette méthode peut également être utilisée pour évaluer les changements dans la protéine S-acylation dans différentes conditions biologiques.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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