Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den Nationalen Instituten für Gesundheit Stipendien 5R01GM115446 und 1R01GM130840 unterstützt.

Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden gemäß den NIH-Richtlinien eingeschläfert. Das Animal Welfare Committee am University of Texas Health Science Center in Houston genehmigte alle Tierarbeiten.
1. Herstellung von Zelllysaten
<ol><li>Vorbereiten des Lysepuffers wie in Tabelle 1beschrieben . Auf 10 ml PBS 0,1 g n-Dodecyl-D-Maltosid-Waschmittel (DDM) geben und drehen, um sich aufzulösen. Fügen Sie 100 l Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2, ML211 (10 m), PM...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina,+heart,+and+liver.">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin.">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li><li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets.">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li><li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets.">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li><li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes.">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pfl&#252;gers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).</li><li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+palmitoylation,+raft+localization,+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids.">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li><li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck.">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li><li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwissPalm:+Protein+Palmitoylation+database.">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4, 1-23 (2015).</li><li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+[3H]palmitic+acid.">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li><li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+are+IntechOpen+,+the+world's+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists.">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li><li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue.">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li><li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters.">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li><li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

Hier haben wir den Acyl-RAC-Assay erfolgreich genutzt, um die S-Acylierung ausgewählter Proteine sowohl in kultivierten menschlichen Zellen als auch in Primärzellen aus Mausgewebe zu erkennen. Diese Methode ist einfach, empfindlich und kann mit minimalen Ausrüstungsanforderungen mit Standard-Biochemie-Techniken einfach durchgeführt werden. Diese Methode hat sich gezeigt, um erfolgreich neuartige S-acylated Proteine wie die Untereinheit des Protein-Translocating-Systems (Sec61b), das ribosomale ProteinSS11 (R...

S-Acylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation, bei der eine fetthaltige Acylkette zu einem internen Cysteinrückstand auf einem Zielprotein über eine labile Thioesterbindung1verwendet wird. Es wurde zuerst als eine Modifikation von Proteinen mit Palmitat berichtet, eine gesättigte 16-Kohlenstoff-Fettsäure2, und daher wird diese Modifikation oft als S-Palmitoylierung bezeichnet. Zusätzlich zu Palmitat können Proteine durch eine Vielzahl von längeren und kürzeren gesättigten (Myristate und Stearat), einfach ungesättigten (Oleat) und mehrfach ungesättigten (Arachidonate und Eicosapentanoat) Fettsäuren3,4,5,6,7umkehrend modifiziert werden. In eukaryotischen Zellen wird die S-Acylierung von einer Familie von Enzymen katalysiert, die als DHHC-Protein-Acyltransferasen bekannt sind, und die umgekehrte Reaktion der Cystein-Deacylation wird durch Proteinthioesterasen katalysiert, von denen die meisten noch rätselhaft bleiben8.
Die Lability der Thioester-Bindung macht diese Lipidmodifikation reversibel, so dass sie Proteinclustering, Plasmamembranlokalisierung, intrazellulären Handel, Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteinstabilität9,10dynamisch regulieren kann. Folglich wurde die S-Acylierung mit mehreren Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter die Huntington-Krankheit, die Alzheimer-Krankheit und verschiedene Krebsarten (Prostata, Magen, Blase, Lunge, Kolorektal), was die Entwicklung zuverlässiger Methoden zum Nachweis dieser posttranslationalen Proteinmodifikation erfordert11.
Metabolische Etikettierung mit radioaktiver ([3H], [14C] oder [125I]) Palmitat war einer der ersten Ansätze, die entwickelt wurden, um das Protein S-Acylation12,13,14zu assayieren. Radiolabeling-basierte Methoden stellen jedoch gesundheitliche Bedenken dar, sind nicht sehr empfindlich, zeitaufwändig und erkennen nur lipidation von reichlich vorhandenen Proteinen15. Eine schnellere und nicht radioaktive Alternative zur Radioetikettierung ist die metabolische Etikettierung mit bioorthogonalen Fettsäuresonden, die routinemäßig zur Untersuchung der Dynamik der Protein-S-Acylation16verwendet wird. Bei dieser Methode wird eine Fettsäure mit einem chemischen Reporter (Alkyn- oder Azidgruppe) durch eine Proteinacyltransferase in das S-acylolate Protein eingearbeitet. Die Cycloadditionsreaktion Von Azid-Alkyn Huisgen (Klickchemie) kann dann verwendet werden, um eine funktionalisierte Gruppe, wie ein Fluorophor oder Biotin, an die integrierte Fettsäure zu binden, die den Nachweis des S-acyatierten Proteins17,18,19ermöglicht.
Acyl-Biotin-Austausch (ABE) ist eine der ausgiebig verwendeten biochemischen Methoden zur Erfassung und Identifizierung von S-acyatierten Proteinen, die einige der Mängel der metabolischen Kennzeichnung wie Ungeeignetheit für Gewebeproben15umgeht. Diese Methode kann für die Analyse der S-Acylation in einer Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich Geweben und gefrorenen Zellproben20,21, angewendet werden. Diese Methode basiert auf der selektiven Spaltung der Thioesterbindung zwischen der Acylgruppe und dem Cysteinrückstand durch neutrales Hydroxylamin. Die befreiten Thiolgruppen werden dann mit einem Thiol-reaktiven Biotinderivat erfasst. Die erzeugten biotinylierten Proteine werden dann mit Streptavidin-Agarose affinitätsgereinigt und durch Immunoblotting analysiert.
Ein alternativer Ansatz, der als Acyl-Harz-unterstützte Erfassung (Acyl-RAC) bezeichnet wird, wurde später eingeführt, um den Biotinylierungsschritt durch die direkte Konjugation freier Cysteins durch ein Thiol-reaktives Harz zu ersetzen22,23. Diese Methode hat weniger Schritte im Vergleich zu ABE und kann in ähnlicher Weise verwendet werden, um Protein-S-Acylation in einer Vielzahl von Proben zu erkennen1.
Acyl-RAC besteht aus 4 Hauptschritten (Abbildung 1), 1. Sperrung freier Thiolgruppen; 2. Selektive Spaltung der Cystein-Acyl-Thioester-Bindung mit neutralem Hydroxylamin (HAM) zur Belichtung von Cystein-Thiol-Gruppen; 3. Erfassung der lipidierten Cysteins mit einem Thiol-reaktiven Harz; 4. Selektive Anreicherung der S-acyatierten Proteine nach Elution mit reduzierendem Puffer.
Die eingefangenen Proteine können dann durch Immunoblotting analysiert oder einer Massenspektrometrie (MS) basierten Proteomik unterzogen werden, um das S-acylierte Proteom in einer Vielzahl von Arten und Geweben zu bewerten22,24,25. Individuelle S-Acylierungsstellen können auch durch Trypsin-Verdauung der erfassten Proteine und Analyse der resultierenden Peptide durch LC-MS/MS22identifiziert werden. Hier zeigen wir, wie Acyl-RAC zum gleichzeitigen Nachweis der S-Acylation mehrerer Proteine sowohl in einer Zelllinie als auch in einer Gewebeprobe eingesetzt werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

Protein-S-Acylation, auch s-palmitoylation genannt, ist eine reversible posttranslationale Modifikation von Cysteinrückständen mit langkettigen Fettsäuren über eine labile Thioesterbindung. Die S-Akylierung, die sich als weitverbreiteter Regulierungsmechanismus herausbildet, kann fast alle Aspekte der biologischen Aktivität von Proteinen modulieren, von der komplexen Bildung bis hin zum Proteinhandel und der Proteinstabilität. Die jüngsten Fortschritte beim Verständnis der biologischen Funktion der Protein-S-Acylation wurden weitgehend durch die Entwicklung neuartiger biochemischer Werkzeuge erzielt, die einen robusten und empfindlichen Nachweis der Protein-S-Acylation in einer Vielzahl biologischer Proben ermöglichen. Hier beschreiben wir acylharzgestützte Erfassung (Acyl-RAC), eine kürzlich entwickelte Methode, die auf der selektiven Erfassung endogen s-acyatierter Proteine durch Thiol-reaktive Sepharose-Perlen basiert. Im Vergleich zu bestehenden Ansätzen benötigt Acyl-RAC weniger Schritte und kann in Verbindung mit der Massenspektrometrie zur Identifizierung neuartiger S-Acylierungsziele zuverlässigere Ergebnisse liefern. Eine wesentliche Einschränkung in dieser Technik ist die mangelnde Fähigkeit, zwischen Fettsäurearten zu unterscheiden, die über die gleiche Thioesterbindung an Cysteins gebunden sind.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll verwendeten wir zunächst Acyl-RAC, um gleichzeitig die S-Acylierung mehrerer Proteine in Jurkat-Zellen zu erkennen, einer verewigten T-Zelllinie, die ursprünglich aus dem peripheren Blut eines T-Zell-Leukämiepatienten abgeleitet wurde27. Regulatorische T-Zellproteine, die zuvor als S-acylatierte9,28,29 identifiziert wurden, wurden ausgewählt, um den Nutzen dieser ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) ist eine hochempfindliche, zuverlässige und einfach durchzuführende Methode zum Nachweis reversibler Lipidmodifikationen von Cysteinrückständen (S-Acylation) in einer Vielzahl biologischer Proben.

Nachweis der Protein-S-Acylation mit Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-resin assisted capture oder Acyl-RAC ist eine empfindliche und zuverlässige Methode, die verwendet werden kann, um Protein-S-Acylation in einer Vielzahl von biologischen Proben zu erkennen. Dieses Protokoll umgeht einige der Einschränkungen der metabolischen Etikettierung und Radiobeschriftung und ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis der S-Acylation mehrerer Proteine. Nicht nur lebende Zellen, sondern auch Primärgewebe und gefrorene Proben.S-Acylation kann eine Vielzahl von zellulären Prozessen regulieren, wie Proteinhandel, Plasmamembran-Targeting, Signaltransduktion, Eisentransport und Protein-Protein-Wechselwirkungen. Es ist wichtig, für jedes Experiment eine frisch zubereitete Hydroxylaminlösung mit sorgfältig angepasstem pH-Wert zu verwenden, um eine effiziente und spezifische Spaltung der Thioesterbindung zu gewährleisten. Bei einer Demonstration dieser Methode ist es entscheidend für Schritte wie Chloroform, Methanolfällung.Das Pfannkuchen-Formpellet, das während dieses Schritts erhalten wird, sollte sehr sorgfältig behandelt werden. Es kann zerbrechlich sein und ein teilhteller Verlust der Probe während des Schritts kann zu einer ungleichmäßigen Probenrückgewinnung führen. Demonstriert wird das Verfahren von Savannah West, einer Doktorandin unseres Labors.Um Zelllysate zu erhalten, sammeln Sie die interessendeckenden Zellen in einem konischen Zentrifugenrohr. Und entfernen Sie alle Zellablagerungen durch Zentrifugation. Waschen Sie das Pellet in 5 Milliliter PBS.Und die Zellen sofort in 600 Mikroliter frisch zubereiteten Lysepuffern wieder aussetzen. Die Probe bei 1.500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoshaker 30 Minuten bei vier Grad Celsius aufstellen. Vor dem Löschen der Lysate, Pelletwaschmittel und lösliches Material durch Zentrifugation.Am Ende der Zentrifugation das gereinigte Lysat in einem vorgekühlten 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr auf Eis sammeln. Und führen Sie einen Bradford- oder Bicinchoninsäure-Assay durch, um die Proteinkonzentration nach Standardprotokollen abzuschätzen. Methanol und Chloroform im Verhältnis 2:1 lysieren.Schütteln Sie rigoros, um eine homogene Suspension zu schaffen und zentrifugieren Sie die Probe, um ein Proteinpellet an der Schnittstelle zwischen den wässrigen und organischen Phasen zu sammeln. Kippen Sie das Rohr, verwenden Sie eine Nadel oder eine Gel-Ladespitze, um so viel Lösungsmittel wie möglich zu aspirieren. Das Proteinpellet für einige Minuten an der Luft trocknen.Vor dem sanften Mischen des Rohrinhalts mit 600 Mikroliter Methanol, achten Sie darauf, das Pellet nicht aufzubrechen. Nach sorgfältigem Entfernen des Methanolwaschens das Proteinpellet auf einer Bankplatte ca. fünf Minuten trocknen. Als nächstes setzen Sie das Proteinpellet in 200 Mikroliter 2SHB-Puffer wieder aus.Und Wirbel bei 42 Grad Celsius und 1.500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermo-Shaker. Wenn das Pellet aufgelöst ist, fügen Sie der Probe 200 Mikroliter 0,2%MMTS in 2SHB hinzu. Und das Protein 15 Minuten bei 42 Grad Celsius und 1.500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoshaker inkubieren.Führen Sie am Ende der Inkubation 3:4 Chloroform-Methanol-Fällungen durch, wie gezeigt. Um das MMTS zu entfernen, lösen Sie das Pellet in 100 Mikroliter frischen 2SHB Puffer mit Wirbel. Und verdünnen Sie die Probe mit 300 Mikroliter Puffer A nach jedem Niederschlag.Nach der endgültigen Fällung die Proben in 200 Mikroliter 2SHB-Puffer auflösen und mit 240 Mikroliter Puffer A verdünnen. Messen Sie die Proteinkonzentration erneut und legen Sie 40 Mikroliter aus jeder Probe als Eingangssteuerung beiseite. Teilen Sie Proben in zwei gleiche Volumina von 200 Mikrolitern auf. Und markieren Sie die Tuben als plus Hydroxylamin und MinusHydroxylamin.50 Mikroliter frisch zubereitetes neutrales zwei molares Hydroxylamin zu einer Endkonzentration von 400 Millimolaren in das Plus-Hydroxylamin-Röhrchen geben. Und 50 Mikroliter neutrales zwei molares Natriumchlorid zur Negativkontrolle, ein Minus Hydroxylamin-Rohr. Dann fügen Sie 30 Mikroliter TS Perlenschlämme in jedes Rohr.Und drehen Sie die Rohre für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Perlen viermal mit 1%SDS in Puffer A, um Resthydroxylamin zu entfernen. Nach der letzten Wäsche alle Perlenproben mit drei sanften einminütigen Mikrozentrifugationen waschen.Sorgfältig die Überstand eisstillieren und die Perlen in 500 Mikroliter 1%SDS in Puffer A bei jeder Wäsche wieder aufhängen. Nach der letzten Wäsche, drehen Sie die Perlen vorsichtig nach unten, wie gezeigt. Und so viel Überstand wie möglich aspirieren, ohne die Perlen zu stören.Um die Proteine aus den Perlen zu gewinnen, fügen Sie 50 Mikroliter 4%SDS-Probenpuffer in jede Röhre und inkubieren die Proben bei 80 Grad Celsius und 1, 500 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten in einem Thermoshaker. Lassen Sie die Proben am Ende der Inkubation abkühlen, bevor Sie zentrieren, um die Perlen vollständig zu pellet. Dann verwenden Sie eine Gel-Ladespitze, um die eluierten Proteine in neue 1,5-Milliliter-Röhren zu übertragen.Und führen Sie die Proben auf einem SDS-PAGE-Gel aus, um die S-Acylation der proteine von Interesse durch Western Blotting zu analysieren. Tyrosinkinase Lck kann in Lysaten nachgewiesen werden, die mit neutralem zwei molarem Hydroxylamin behandelt werden. die Thioesterbindung zwischen Cysteinrückständen und der Fettsäure-Feuchtigkeit zu spalten.und Reprobing mit Antikörpern gegen Proteine Fyn und LAT zeigen, dass Acyl-Harz-unterstützter Capture-Assay verwendet werden kann, um die S-Akylierung mehrerer Proteine gleichzeitig zu analysieren. Darüber hinaus kann die S-Akylierung von Lck, Fyn und LAT in primären Maussplenozyten leicht erkannt werden. Gibt an, dass diese Änderung zwischen zwei Arten konserviert wird.Neben der Identifizierung neuartiger S-acyatierter Proteine kann diese Methode auch zur Beurteilung von Veränderungen der Protein-S-Acylation unter verschiedenen biologischen Bedingungen eingesetzt werden. Die Anzahl der neu identifizierten S-acyatierten Proteine hat enorm zugenommen, nachdem die Verdoppelung eine schnelle und zuverlässige Technik wie Acyl-RAC bedeutete. Neben der Identifizierung neuartiger S-acyatierter Proteine kann diese Methode auch zur Beurteilung von Veränderungen der Protein-S-Acylation unter verschiedenen biologischen Bedingungen eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Studium der Protein Import in Chloroplasten mit Protoplasten

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...