Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות 5R01GM115446 ו-1R01GM130840.

עכברים המשמשים בפרוטוקול זה הורדמים על פי הנחיות NIH. הוועדה לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת טקסס מדעי הבריאות המרכז ביוסטון אישר את כל העבודה בעלי חיים.
1. הכנת ליקוטים סלולריים
<ol><li>הכן את מאגר הליזה כמתואר בטבלה 1. כדי 10 mL של PBS, להוסיף 0.1 g של n-dodecyl β-D-מלטוסייד אבקת כביס...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina,+heart,+and+liver.">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin.">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li><li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets.">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li><li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets.">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li><li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes.">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pfl&#252;gers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).</li><li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+palmitoylation,+raft+localization,+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids.">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li><li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck.">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li><li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwissPalm:+Protein+Palmitoylation+database.">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4, 1-23 (2015).</li><li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+[3H]palmitic+acid.">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li><li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+are+IntechOpen+,+the+world's+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists.">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li><li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue.">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li><li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters.">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li><li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

כאן, אנו מנוצל בהצלחה את הבחינה מירוץ acyl כדי לזהות S-אכלציה של חלבונים שנבחרו בתאי האדם התרבותי הן התאים הראשוניים הנגזרים מרקמת העכבר. שיטה זו היא פשוטה, רגישה, ניתן לבצע בקלות עם דרישות ציוד מינימלי באמצעות טכניקות ביוכימיה סטנדרטית. שיטה זו הוצגה בהצלחה לזהות חלבונים S-acylated הרומן כגון β-su...

S-אכלציה הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה מעורבים תוספת של שרשרת acylation שומן לשאריות ציסטאין פנימי על חלבון היעד באמצעות בונד לבנה thioester1. הוא דווח לראשונה כשינוי של חלבונים עם palmitate, חומצה שומן רווי 16 פחמן2, ולכן שינוי זה מכונה לעתים קרובות S-palmitoyלציה. בנוסף palmitate, חלבונים יכולים להיות שונה למדי על ידי מגוון רחב יותר וקצר יותר רווי (myristate ו stearate), חד (oleate) ו רב בלתי רווי (ארכאידיט ו eאיסאופנטאנואט) חומצות שומן3,4,5,6,7. בתאי איקריוטית, S-אכלציה הוא מזרז על ידי משפחה של אנזימים המכונה acyltransferחלבונים החלבון ואת התגובה הפוכה של ציסטאין דאכלציה הוא מזרז על ידי חלבון החלבונים, שרובם עדיין להישאר המסתורית8.
היכולת של הקשר thioester עושה את זה שינוי השומנים הפיך, המאפשר לו להסדיר באופן דינאמי באשכולות חלבון, פלזמה ממברנה לוקליזציה, סחר תאיים, אינטראקציות חלבונים חלבון ויציבות חלבון9,10. כתוצאה מכך, S-אכלציה נקשר להפרעות מספר כולל מחלת הנטינגטון, מחלת אלצהיימר ומספר סוגים של סרטן (ערמונית, קיבה, שלפוחית השתן, ריאות, המעי הגס), אשר מחייב פיתוח של שיטות אמינות לזהות את שינוי החלבון הפוסט-טרנסלסטי11.
מטבולית תיוג עם רדיואקטיבי ([3H],[14ג] או [125אני]) palmitate היתה אחת הגישות הראשונות שפותחו כדי לשנות את החלבון S-אכלציה12,13,14. עם זאת, שיטות מבוססות רדיואולבלינג מציגים חששות בריאותיים, הם לא רגישים מאוד, זמן רב, ורק לגלות lipidation של חלבונים שופע מאוד15. חלופה מהירה ולא רדיואקטיבית radiolabeling היא תיוג מטבולית עם בדיקה חומצות שומן bioorthogonal, אשר משמש באופן שגרתי כדי שיטת הדינמיקה של חלבון S-אכלציה16. בשיטה זו, חומצת שומן עם כתב כימי (הקבוצה האלבית או עזידה) משולבים בחלבון S-acylated על ידי חלבון acyltransferase. התגובה של עזידה-אלקין (לחץ על כימיה) יכולה לשמש לחיבור קבוצה פונקציונליזציה, כגון fluorophore או biotin, לחומצת השומן המשולבת המאפשרת זיהוי של חלבון ה-S-acylated17,18,19.
Acyl-ביוטין החליפין (אייב) היא אחת השיטות הביוכימי בשימוש נרחב לכידה וזיהוי של חלבונים S-acylated העוקף כמה חסרונות של תיוג מטבולית כגון חוסר התאמה לדגימות רקמות15. ניתן ליישם שיטה זו לניתוח S-acylation במגוון מגוון של דגימות ביולוגיות, כולל רקמות ודגימות תאים קפואים20,21. שיטה זו מבוססת על מחשוף סלקטיבי של הקשר בין הקבוצה acyl ושאריות ציסטאין על ידי הידרוקסילאמין נייטרלי. הקבוצות המשוחררות שוחררו לאחר מכן באמצעות הנגזרת הביוטין התגובתית. חלבונים biotinylated שנוצר לאחר מכן מטוהרים אהדה באמצעות streptavidin agarose ונותחו על ידי החיסונית.
גישה חלופית הנקראת acyl שרף בסיוע לכידת (acyl מירוץ) הוצגה מאוחר יותר להחליף את הצעד biotinylation עם בניינים ישירים של cysteines חינם על ידי שרף thiol-תגובתי22,23. שיטה זו יש פחות צעדים לעומת אייב ובאופן דומה ניתן להשתמש כדי לזהות חלבון S-אכלציה במגוון רחב של דגימות1.
Acyl-מירוץ מורכב 4 צעדים עיקריים (איור 1), 1. חסימת קבוצות תיול חינם; 2. מחשוף סלקטיבי של בונד של ציסטאין thioester עם הידרוקסילין נייטרלי (HAM) לחשוף את הקבוצות ציסטאין. 3. לכידת cysteines הליפינס עם שרף מגיב thiol; 4. העשרה סלקטיבית של חלבוני S-acylated לאחר הימנעות עם הפחתת מאגר.
את החלבונים שנתפסו ניתן לנתח על ידי חיסוני או נתון המסה ספקטרומטריה (MS) מבוסס פרוטאומניקס להעריך את S-acylated פרוטדום במגוון מגוון של מינים ורקמות22,24,25. אתרים בודדים S-אכלציה ניתן גם לזהות על ידי טריפסין העיכול של חלבונים שנתפסו ניתוח של פפטידים הנובעים על ידי LC-MS/MS22. כאן, אנו מדגימים כיצד acyl מירוץ יכול לשמש זיהוי סימולטני של S-האכלציה של חלבונים מרובים הן בקו התא וגם דגימת רקמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

חלבון s-אכלציה, המכונה גם S-palmitoylation, הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה של שאריות ציסטאין עם חומצות שומן ארוכות בשרשרת באמצעות בונד לבנה thioester. S-אכלציה, המתעוררים כמנגנון הרגולציה הנרחב, יכול לווסת כמעט את כל ההיבטים של הפעילות הביולוגית של חלבונים, מפני היווצרות מורכבים לסחר בחלבונים ויציבות חלבונים. ההתקדמות האחרונה להבנת התפקוד הביולוגי של חלבון S-אכלציה הושגה בעיקר בשל התפתחות הכלים הביוכימיים החדשניים המאפשרים גילוי חזק ורגיש של חלבון S-אכלציה במגוון דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מתארים לכידה בסיוע של acyl שרף (Acyl-מירוץ), שיטה שפותחה לאחרונה מבוסס על לכידת סלקטיבי של חלבונים S-acylated על ידי החרוזים הספרדית thiol-תגובתי. לעומת הגישות הקיימות, Acyl-מירוץ דורש פחות שלבים והוא יכול להניב תוצאות אמינות יותר כאשר ביחד עם ספקטרומטר המסה לזיהוי מטרות הרומן S-אכלציה. מגבלה מרכזית בטכניקה זו היא חוסר יכולת להפלות בין מינים של חומצת שומן המחוברים לציסטרינס באמצעות אותו קשר.

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, השתמשנו הראשון acyl-מירוץ כדי לזהות בו S-אכלציה של כמה חלבונים בתאים ורנל, קו תא T הונצח במקור נגזר דם היקפי של חולה לוקמיה של תא T27. החלבונים של תא T הרגולציה שזוהו בעבר כ-S-acylated9,28,29 נבחרו כדי להדגים את...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-מירוץ (acyl-שרף בסיוע לכידת) הוא רגיש מאוד, אמין וקל לבצע שיטה לזיהוי שינוי השומנים הפיך של שאריות ציסטאין (S-acyl) במגוון של דגימות ביולוגיות.

זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-resin בסיוע לכידה או Acyl-RAC היא שיטה רגישה ואמינה שניתן להשתמש בה כדי לזהות S-acylation חלבון במגוון של דגימות ביולוגיות. פרוטוקול זה עוקף חלק מהמגבלות של תיוג מטבולי ותיוג רדיו, ומאפשר זיהוי בו זמני של S-acylation של חלבונים מרובים. לא רק תאים חיים אלא גם רקמות ראשוניות ודגימות קפואות.S-acylation יכול לווסת מגוון רחב של תהליכים תאיים כגון סחר בחלבון, מיקוד קרום פלזמה, העברת אותות, הובלת ברזל, אינטראקציות חלבון חלבון. חשוב להשתמש בתתכונת הידרוקסילאמין טרי עם pH מותאם בקפידה עבור כל ניסוי כדי להבטיח מחשוף יעיל וסופקסי של הקשר thioester. עם הדגמה של שיטה זו זה קריטי עבור צעדים כמו כלורופורם, משקעים מתנול.גלולת צורת פנקייק שהושגו במהלך שלב זה צריך להיות להתמודד בזהירות רבה. זה יכול להיות שביר ואובדן חלקי של המדגם במהלך השלב יכול להוביל להתאוששות מדגם אחיד. הפגנת ההליך תהיה סוואנה ווסט, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו.כדי להשיג ליאזטים התא, לאסוף את התאים של עניין לתוך צינור צנטריפוגה חרוט. ולהסיר כל פסולת תא על ידי צנטריפוגה. לשטוף את גלולה ב 5 מיליליטר של PBS.ומיד תן שימוש חוזר בתאים ב-600 מיקרוליטרים של מאגר תיזה טרי. להתסיס את המדגם ב 1, 500 מהפכות לדקה בשייקר תרמו במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לפני ניקוי lysates, חומר ניקוי גלולה מסיסים על ידי צנטריפוגה.בסוף הצנטריפוגה, לאסוף את lysate פינה בצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש 1.5 מיליליטר על קרח. ולבצע בדיקה של ברדפורד או חומצה ביצינצ'ונית כדי להעריך את ריכוז החלבון לפי פרוטוקולים סטנדרטיים. הוסף מתנול וכלורופורם כדי לתפורם ביחס של 2:1.לנער בקפדנות כדי ליצור השעיה הומוגנית צנטריפוגה המדגם כדי לאסוף גלולת חלבון בממשק בין שלבים מיוירי ואורגני. הטיית הצינור, להשתמש במחט או קצה טעינת ג'ל כדי לשוות כמה שיותר ממס. אוויר לייבש את גלולת החלבון במשך כמה דקות.לפני ערבוב עדין של תכולת הצינור עם 600 מיקרוליטרים של מתנול, דואג לא לשבור את גלולה. לאחר הסרת מטנול בזהירות לשטוף, לייבש את גלולת החלבון על ספסל העליון במשך כחמש דקות. לאחר מכן, לחץ מחדש על גלולת החלבון ב-200 מיקרוליטרים של חיץ 2SHB.ומערבולת ב 42 מעלות צלזיוס ו 1, 500 מהפכות לדקה בשייקר תרמו. כאשר גלולה מומס, להוסיף 200 microliters של 0.2%MMTS ב 2SHB לדגימה. ולהדקר את החלבון במשך 15 דקות ב 42 מעלות צלזיוס ו 1, 500 מהפכות לדקה בשייקר תרמו.בסוף הדגירה, לבצע 3:4 כלורופורם-מתנול משקעים כפי שהוכח. כדי להסיר את MMTS, להמיס את גלולה ב 100 microliters של חיץ 2SHB טרי עם מערבולת. ולדלל את המדגם עם 300 microliters של חיץ A לאחר כל משקעים.לאחר המשקעים הסופיים, להמיס את הדגימות ב 200 microliters של חיץ 2SHB לדלל עם 240 microliters של חיץ A.Measure ריכוז החלבון שוב להפריש 40 microliters מכל מדגם כמו פקדי קלט. לפצל דגימות לשני כרכים שווים של 200 מיקרוליטרים. ולסמן את הצינורות כמו בתוספת הידרוקסילאמין ומינוס הידרוקסילאמין.הוסיפו 50 מיקרוליטרים של הידרוקסילאמין ניטרלי טרי לריכוז סופי של 400 מילימולאר לצינור פלוס הידרוקסילאמין. ו-50 מיקרוליטרים של נתרן כלורי ניטרלי שני טוחנים לשליטה השלילית, צינור הידרוקסילאמין מינוס. לאחר מכן להוסיף 30 microliters של תרחיף חרוזים TS לכל צינור.ולסובב את הצינורות במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה לשטוף את חרוזים ארבע פעמים עם 1% SDS במאגר A כדי להסיר כל הידרוקסילאמין שיורית. לאחר הכביסה האחרונה, לשטוף את כל דגימות חרוזים עם שלושה microcentrifugations דקה אחת עדינה.שאפו בזהירות את העל-טבעיים והתלכלו מחדש את חרוזים ב-500 מיקרוליטרים של 1%SDS במאגר A בכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, בעדינות לסובב את חרוזים כפי שהוכח. ושואפים כמה שיותר על-טבעי מבלי להפריע לעליזים.כדי לשחזר את החלבונים מהחרוזים, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של חיץ דגימת 4%SDS לכל צינור והדגירה את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס ו-1,500 מהפכות לדקה למשך 15 דקות בשייקר תרמו. בסוף הדגירה, תן את הדגימות להתקרר לפני צנטריפוגה לחלוטין גלולה את חרוזים. לאחר מכן השתמשו בקצה טעינת ג'ל כדי להעביר את החלבונים האלודים לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר.ולהפעיל את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE כדי לנתח את S-acylation של חלבונים של עניין על ידי כתמים מערביים. טירוסין קינאז Lck ניתן לזהות בליזטים שטופלו ניטרלי שני הידרוקסילאמין טוחן. כדי לחשוף את הקשר thioester בין שאריות ציסטאין ואת moiety חומצת שומן.הפשטה ו reprobing עם נוגדנים נגד חלבונים Fyn ו LAT להדגים כי acyl-שף סייע ללכוד assay ניתן להשתמש כדי לנתח S-acylation של חלבונים מרובים בו זמנית. בנוסף, S-acylation של Lck, Fyn, ו LAT ניתן לזהות בקלות טחול העכבר הראשי. המציין כי שינוי זה שמור בין שני מינים.בנוסף לזיהוי של חלבונים S-acylated הרומן, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך שינויים S-acylation חלבון בתנאים ביולוגיים שונים. מספר החלבונים החדשים שזוהו S-acylated גדל מאוד לאחר כפול למעלה פירושו טכניקה מהירה ואמינה כגון Acyl-RAC. בנוסף לזיהוי של חלבונים S-acylated הרומן, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך שינויים S-acylation חלבון בתנאים ביולוגיים שונים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

ג &#39;ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ&quot;א קומפלקסים

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...