Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
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この研究は、国立衛生研究所の助成金5R01GM115446と1R01GM130840によって支援されました。

このプロトコルで使用されたマウスは、NIHガイドラインに従って安楽死させた。ヒューストンのテキサス大学保健科学センターの動物福祉委員会は、すべての動物の仕事を承認しました。
1. 細胞ライセートの調製
<ol><li>表1に記載されているように、リシスバッファを準備する。PBSを10mLに、0.1gのn-ドデシルβ-D-マルトシド洗剤(DDM)を加え、溶解させて回転さ?...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

ここで、マウス組織由来の培養ヒト細胞および一次細胞の両方で選択したタンパク質のS-アシル化を検出するために、アシル-RACアッセイを利用することに成功しました。この方法は、単純で敏感であり、標準的な生化学技術を使用して最小限の装置要件で簡単に行うことができます。この方法は、タンパク質転写系のβサブユニット(Sec61b)、リボソームタンパク質S11(Rps11)、およびミクロソー?...

S-アシル化は、陰唇チオエステル結合1を介して標的タンパク質上のシステイン残基に脂肪アシル鎖を付加することを含む可逆的な翻訳後修飾である。それはパルミテ酸塩、飽和16-炭素脂肪酸2を有するタンパク質の修飾として最初に報告された、したがって、この修飾は、しばしばS-パルミトイル化と呼ばれる。パルミチン酸に加えて、タンパク質は、様々な長く短い飽和(ミリステイトおよびステアレート)、一価不飽和(オレ酸塩)および多価不飽和(アラキドキおよびエイコサペンタノエート)脂肪酸33、4、5、6、74,5,6,7によって可逆的に修飾することができる。真核細胞において、S-アシル化はDHHCタンパク質アシルトランスセラーゼとして知られる酵素ファミリーによって触媒され、システイン脱アシル化の逆反応はタンパク質チオエステラーゼによって触媒され、そのほとんどは依然として謎8のままである。
チオスター結合の可射性により、この脂質修飾を可逆的にし、タンパク質のクラスタリング、細胞質膜局在、細胞内の密売、タンパク質相互作用およびタンパク質安定性99,1010を動的に調節することを可能にする。その結果、S-アシル化は、ハンチントン病、アルツハイマー病およびいくつかのタイプの癌(前立腺癌、胃、膀胱、肺、大腸)を含むいくつかの障害に関連しており、この翻訳後タンパク質改変11を検出するための信頼できる方法の開発を必要とする。
パルミテは、放射性([3H]、14C)または3[125I])を用いた代謝標識は、タンパク質S-アシル化12、13、14,13,をアッセイするために開発された最初のアプローチの1つである。14しかしながら、放射線標識ベースの方法は健康上の懸念を提示し、非常に敏感ではなく、時間がかかり、そして非常に豊富なタンパク質15の脂質を検出するだけである。放射性標識に対するより速く非放射性の代替は、生体直交脂肪酸プローブによる代謝標識であり、これはタンパク質S-アシル化16の測定ダイナミクスをアッセイするために日常的に使用される。この方法では、化学レポーターを有する脂肪酸(アルキンまたはアジ化基)を、アシルトランスファーーゼタンパク質によってS-acylatedタンパク質に組み込む。アジドアルキン・ウイスゲン・シクロ付加反応(クリック化学)は、フッ素酸またはビオチンなどの官能性基を、S-acylateタンパク質17、18、19,18,19の検出を可能にする集積脂肪酸に付着させるために使用することができる。
アシルビオチン交換(ABE)は、組織サンプル15に不適当な代謝標識の欠点のいくつかをバイパスするS-acylatedタンパク質の捕捉および同定に広く用いられている生化学的方法の1つである。この方法は、組織および凍結細胞試料20,21,21を含む多様な生物学的サンプルにおけるS-アシル化の分析に適用することができる。この方法は、中性ヒドロキシルアミンによるアシル基とシステイン残基との間のチオエステル結合の選択的切断に基づく。遊離チオール基は、次いでチオール反応性ビオチン誘導体で捕捉される。生成されたビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアガロースを使用して親和性精製され、免疫ブロッティングによって分析されます。
アシル樹脂アシスト捕捉(Acyl-RAC)と呼ばれた代替アプローチは、後に、シオール反応性樹脂22,23,23による遊離システインの直接結合と共にビオチン化ステップを置き換えるために導入された。この方法は、ABEと比較して少ないステップを有し、同様に、サンプル1の広い範囲でタンパク質S-アシル化を検出するために使用することができる。
Acyl-RACは4つの主要なステップ(図1)で構成されています。 1. 無料チオール群のブロック; 2. システイン-アシルチオエステル結合の選択的切断中性ヒドロキシルアミン (HAM) システインチオール基を露出する; 3. チオール反応性樹脂を用いた脂質化されたシステインの捕獲; 4. 還元バッファーと溶出後の S-acylated タンパク質の選択的濃縮.
次いで、捕捉したタンパク質を免疫ブロッティングにより分析するか、または質量分析(MS)ベースのプロテオミクスを行い、S-acylatedプロテオームを様々な種および組織22、24、2524,25の範囲で評価することができる。22個々のS-アシル化部位は、捕捉されたタンパク質のトリプシン消化およびLC-MS/MS22による得られたペプチドの分析によっても同定することができる。ここでは、細胞株と組織サンプルの両方で、複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するためにacyl-RACを使用する方法を示す。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

プロテインS-アシル化は、S-パルミトイル化とも呼ばれ、陰茎チオエステル結合を介して長鎖脂肪酸を有するシステイン残基の可逆的な翻訳後修飾である。広範囲にわたる調節機構として出現するS-acylationは、複雑な形成からタンパク質の密売およびタンパク質安定性に至る、タンパク質の生物学的活性のほぼすべての側面を調節することができる。タンパク質S-アシル化の生物学的機能の理解の最近の進歩は、様々な生物学的サンプルにおけるタンパク質S-acylationの堅牢かつ敏感な検出を可能にする新しい生化学的ツールの開発によって大きく達成された。ここでは、チオール反応性セファロースビーズによる内因性S-acylatedタンパク質の選択的捕捉に基づく最近開発された方法であるアシル樹脂支援捕捉(Acyl-RAC)について述べている。既存のアプローチと比較して、Acyl-RACは、より少ないステップを必要とし、新しいS-アシル化ターゲットの同定のための質量分析と結合された場合、より信頼性の高い結果を得ることができます。この技術の主な制限は、同じチオスター結合を介してシステインに結合した脂肪酸種を区別する能力の欠如である。

上述したプロトコルに従って、我々は最初に、T細胞白血病患者27の末梢血に由来する不死化T細胞株であるJurkat細胞における複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するために、acyl-RACを用いた。この方法の有用性を実証するために、以前にS-acylated9,289,28,2929と同定された調節性T細胞タンパク質が選択?...

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Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-RAC(アシル-レジンアシストキャプチャ)は、様々な生物学的サンプル中のシステイン残基の可逆的脂質修飾(S-acylation)を検出する方法を非常に敏感で、信頼性が高く、実行しやすいです。

アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

アシル樹脂アシストキャプチャまたはアシルRACは、様々な生物学的サンプルでプロテインS-アシル化を検出するために使用できる敏感で信頼性の高い方法です。このプロトコルは、代謝標識とラジオ標識の制限の一部をバイパスし、複数のタンパク質のS-acylationの同時検出を可能にします。生細胞だけでなく、一次組織や凍結サンプルも。S-acylationは、タンパク質の密売、血漿膜ターゲティング、シグナル伝達、鉄輸送、タンパク質-タンパク質相互作用など、さまざまな細胞プロセスを調節することができます。チオスター結合の効率的かつ特異的な切断を確実にするために、各実験に対して慎重に調整されたpHで作りたてのヒドロキシルアミン溶液を使用することが重要です。この方法のデモンストレーションでは、クロロホルム、メタノール沈殿のようなステップのために重要です。このステップの間に得られるパンケーキの形のペレットは非常に注意深く扱うべきである。それは、工程中にサンプルの壊れやすいおよび部分的な損失であり、不均一なサンプル回復につながる可能性があります。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の大学院生であるサバンナ・ウェストです。細胞ライセートを得るために、目的の細胞を円錐形遠心分離管に集める。遠心分離により細胞の破片を除去します。ペレットをPBSの5ミリリットルで洗います。そして、すぐに作りたてのリシスバッファーの600マイクロリットルで細胞を再懸濁します。サーモシェーカーで1分あたり1,500回転でサンプルを4°Cで30分間攪拌します。溶解物をクリアする前に、ペレット洗剤および可溶性物質を遠心分離によって。遠心分離の終わりに、氷の上に予冷した1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管にクリアしたライセートを集める。そして、ブラッドフォードまたはビチンチオニン酸アッセイを実行して、標準的なプロトコルに従ってタンパク質濃度を推定する。メタノールとクロロホルムを加えて、2:1の比率でライセートします。均質な懸濁液を作成し、サンプルを遠心分離して、水相と有機相の界面でタンパク質ペレットを収集するために厳密に振ります。チューブを傾け、できるだけ多くの溶媒を吸引するために針またはゲルローディングチップを使用してください。空気は、数分間、タンパク質ペレットを乾燥させます。600マイクロリットルのメタノールでチューブ内容物を軽く混合する前に、ペレットを分解しないように注意してください。メタノール洗浄を慎重に除去した後、ベンチトップのプロテインペレットを約5分間乾燥させます。次に、2SHBバッファーの200マイクロリットルでタンパク質ペレットを再懸濁する。そして、サーモシェーカーで摂氏42度と毎分1、500回転で渦。ペレットが溶解したら、2SHBに0.2%MMTSの200マイクロリットルをサンプルに加えます。そして、熱シェーカーで摂氏42度で15分間、毎分1,500回転をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、実例のように3:4クロロホルムメタノール沈殿を行う。MMTSを除去するには、ペレットをボルテックスで新鮮な2SHBバッファーの100マイクロリットルに溶解します。そして、各沈殿後に300マイクロリットルのバッファーAでサンプルを希釈する。最終的な沈殿後、2SHBバッファーの200マイクロリットルにサンプルを溶解し、240マイクロリットルのバッファーAで希釈し、タンパク質濃度を再び測定し、各サンプルから40マイクロリットルを入力コントロールとして確保します。サンプルを200マイクロリットルの2つの等しい量に分割します。そして、プラスヒドロキシラミンとマイナスヒドロキシラミンとしてチューブをマークします。プラスヒドロキシルアミンチューブに400ミリモルの最終濃度に作りたての中性2モルヒドロキシラミンの50マイクロリットルを追加します。そして50マイクロリットルの中性2モル塩化ナトリウムを負の対照に、マイナスヒドロキシルアミンチューブとした。その後、各チューブに30マイクロリットルのTSビーズスラリーを加えます。そして、室温で1〜2時間チューブを回転させます。インキュベーションの終わりに、ビーズをバッファーAに1%SDSで4回洗浄し、残留ヒドロキシルアミンを除去します。最後の洗浄後、3つの穏やかな1分間のマイクロ遠心ですべてのビーズサンプルを洗います。慎重に上清を吸引し、各洗浄時にバッファーAの1%SDSの500マイクロリットルでビーズを再懸濁する。最後の洗浄後、実演したようにビーズをそっと回転させます。そして、ビーズを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を吸引します。ビーズからタンパク質を回収するには、各チューブに4%SDSサンプルバッファーの50マイクロリットルを加え、サーモシェーカーで15分間、摂氏80度、1分あたり1,500回転でサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、サンプルを冷やしてから遠心分離機を放ち、ビーズを完全にペレットにします。次に、ゲルローディングチップを使用して、溶出したタンパク質を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。そして、SDS-PAGEゲルでサンプルを実行して、ウェスタンブロッティングによる目的のタンパク質のS-アシル化を分析します。チロシンキナーゼLckは、中性2モルヒドロキシルアミンで処理されるライセートで検出することができる。システイン残基と脂肪酸部分との間のチオスター結合を切断する。FynおよびLATタンパク質に対する抗体によるストリッピングと再確認は、アシル樹脂支援捕捉アッセイを使用して、複数のタンパク質のS-acylationを同時に分析できることを実証しています。さらに、Lck、Fyn、およびLATのS-アシル化は、一次マウスの脾細胞において容易に検出することができる。この修飾が2種間で保存されていることを示す。新しいS-acylatedタンパク質の同定に加えて、この方法は、異なる生物学的条件下でのタンパク質S-アシル化の変化を評価するためにも使用することができる。新たに同定されたS-acylatedタンパク質の数は、ダブルアップがAcyl-RACのような高速で信頼性の高い技術を意味した後、大幅に増加しました。新しいS-acylatedタンパク質の同定に加えて、この方法は、異なる生物学的条件下でのタンパク質S-アシル化の変化を評価するためにも使用することができる。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

プロトプ ラストを用いた葉緑体への蛋白質輸送を勉強

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

(CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...