Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
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이 작품은 건강 보조금 5R01GM115446 및 1R01GM130840의 국가 학회에 의해 지원되었습니다.

이 프로토콜에 사용된 마우스는 NIH 지침에 따라 안락사되었다. 휴스턴에 있는 텍사스 건강 과학 센터의 동물 복지 위원회는 모든 동물 일을 승인했습니다.
1. 세포 리세이츠의 준비
<ol><li>표 1에설명된 대로 라시스 버퍼를 준비합니다. PBS 의 10 mL에, n-도데실 β-D-말토 사이드 세제 (DDM)의 0.1 g을 추가하고 용해하기 위해 회전. 100 μL의 인산염 억제제 칵테일 2, ML211 (1...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck.">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li><li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwissPalm:+Protein+Palmitoylation+database.">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4, 1-23 (2015).</li><li>O'Brien, P. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

여기서, 우리는 성공적으로 마우스 조직으로부터 유래된 배양된 인간 세포 및 1차 세포 모두에서 선택된 단백질의 S-아실화를 검출하기 위해 아실-RAC 검정을 활용하였다. 이 방법은 간단하고 민감하며 표준 생화학 기술을 사용하여 최소한의 장비 요구 사항으로 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 단백질 전탈 시스템(Sec61b), 리보좀 단백질 S11(Rps11), 및 미세소좀 글루타티온-S-트랜스페라제 3(MGST3)?...

S-아실화는 비질 티오에스터 결합1을통해 표적 단백질상에 지방 아실 사슬을 내부 시스테인 잔류물로 첨가하는 가역적 번역 후 변형이다. 그것은 먼저 팔미네이트와 단백질의 수정으로 보고 되었다, 포화 16 탄소 지방산2,따라서이 수정 은 종종 S-팔미토일화라고. 팔미네이트 이외에, 단백질은 다양한 길고 짧은 포화 (myristate 및 stearate), 단일 불포화 (oleate) 및 고도 불포화 (아라키도네이트 및 에이코사펜타노에이트) 지방산3,4,4,5,,6,,7에의해 가역적으로 변형 될 수 있다. 진핵 세포에서, S-아실화는 DHHC 단백질 아실트랜스퍼라제로 알려진 효소의 가족에 의해 촉매되고 시스테인 탈아실화의 역반응은 단백질 티에스테르아제에 의해 촉매화되며,8대부분은 여전히 수수께끼8로 남아 있다.
티오에스터 결합의 lability는 이 지질 변형을 가역적으로 만들어, 동적으로 단백질 군집화, 혈장 막 국소화, 세포내 인신 매매, 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 안정성9,,10. 결과적으로, S-아실레이션은 헌팅턴병, 알츠하이머병 및 여러 유형의 암(전립선, 위, 방광, 폐, 대장암)을 포함하는 여러 장애와 관련이 있으며, 이는 이러한 번역 후 단백질 변형을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법의 개발이 필요하다11.
방사성 물질([3H],[14C] 또는[125I])을 가진 대사 표지는 S-아실화 단백질 을 분석하기 위해 개발된 첫 번째 접근법 중하나였다(12,,13,,14. 그러나, 방사성 표지 기반 방법은 건강 문제를 제시하고, 매우 민감하지 않고, 시간이 오래 걸리며, 고도로 풍부한 단백질의 지질만검출한다 15. 방사성 표지에 대한 더 빠르고 비방사성 대안은 단백질 S-아실레이션16의역학을 분석하기 위해 일상적으로 사용되는 생체 부착 지방산 프로브로 대사 라벨링입니다. 이 방법에서, 화학 리포터(알킨 또는 아지드기)를 가진 지방산은 단백질 아실트랜스퍼라제에 의해 S-아실화 단백질내로 통합된다. 아지드-알키젠 후이스겐 사이클로첨가반응(click chemistry)은 불소 또는 비오틴과 같은 기능화된 군을 부착하여, S-아실화단백질(17,,18,,19)의검출을 허용하는 통합 지방산에 부착하는데 사용될 수 있다.
아실-비오틴 교환(ABE)은 조직시료에대한 부적합성과 같은 대사 라벨링의 단점 중 일부를 우회하는 S-아실화성 단백질의 포획 및 동정을 위해 광범위하게 사용되는 생화학적 방법 중 하나이다. 이 방법은 조직 및 냉동 세포 시료20,,21을포함하는 다양한 범위의 생물학적 샘플에서 S-아실레이션의 분석을 위해 적용될 수 있다. 이 방법은 중성 하이드록실라민에 의한 아실기와 시스테인 잔기 사이의 티오에스터 결합의 선택적 절단에 기초한다. 해방된 티올 그룹은 티올 반응성 비오틴 유도체로 포획됩니다. 생성된 생체면역단백질은 스트렙타비딘 아가로오스를 사용하여 친화도 정제되고 면역블로팅에 의해 분석된다.
아실-수지 보조 포획(Acyl-RAC)이라는 대안적인 접근법은 나중에 티올-반응성수지(22,,23)에의한 자유 시스테인의 직접적인 접합으로 생체측화 단계를 대체하기 위해 도입되었다. 이 방법은 ABE에 비해 단계가 적고 유사하게 광범위한 샘플1에서단백질 S-아실화를 검출하는데 사용될 수 있다.
아실-RAC는 4개의 주요 단계로 구성되어있습니다(그림 1), 1. 무료 티올 그룹의 차단; 2. 시스테인-아실 티에스터 결합과 중성 하이드록실라민(HAM)의 선택적 절단은 시스테인 티올 기를 노출시키는; 3. 티올 반응성 수지로 지방 시스테인을 포착; 4. 완충제를 줄이면서 용출 후 S-아사이클화 단백질의 선택적 농축.
포획된 단백질은 다양한 범위의 종 및,조직22,,24,25에서S-아실화 프로테오메를 평가하기 위해 면역블롯팅 또는 질량분광법(MS) 기반 프로테오믹스를 실시하여 분석될 수 있다. 개별 적인 S-아실화 부위는 또한 LC-MS/MS22에의한 생성된 펩티드의 포착된 단백질및 분석의 트립신 소화에 의해 확인될 수 있다. 여기에서, 우리는 아실-RAC가 세포주 및 조직 샘플 모두에서 다중 단백질의 S-acylation의 동시 검출을 위해 사용될 수 있는 방법을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

단백질 S-아실화, 또한 S-팔미토일화라고도, 비질 티오에스터 결합을 통해 긴 사슬 지방산시스테인 잔류물의 가역 적인 번역 후 수정이다. 광범위한 규제 메커니즘으로 부상하고 있는 S-acylation은 복잡한 형성에서 단백질 인신 매매 및 단백질 안정성에 이르기까지 단백질의 생물학적 활성의 거의 모든 측면을 조절할 수 있습니다. 단백질 S-아실화의 생물학적 기능에 대한 이해의 최근 진전은 다양한 생물학적 샘플에서 단백질 S-아실화를 강력하고 민감하게 검출할 수 있도록 하는 새로운 생화학 적 도구의 개발로 인해 크게 달성되었습니다. 여기서, 우리는 아실 수지 보조 포획(Acyl-RAC)을 설명하며, 티올 반응성 세파로즈 비드에 의한 내인성 S-아사이클레이트 단백질의 선택적 포획에 기초한 최근 개발된 방법을 설명합니다. 기존 접근법에 비해 Acyl-RAC는 더 적은 단계가 필요하며 새로운 S-acylation 표적을 식별하기 위한 질량 분석과 결합될 때 보다 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술에 있는 중요한 제한은 동일 thioester 결합을 통해 시스테인에 붙어 있는 지방산 종 사이 구별하는 기능의 부족입니다.

전술한 프로토콜에 따라, 우리는 먼저 아실-RAC를 사용하여 주캇 세포에서 여러 단백질의 S-acylation을 동시에 검출하인, T 세포 백혈병 환자27의말초 혈액으로부터 유래된 불멸의 T 세포주를 검출하였다. 이전에 S-아실화9,,28,,29로 확인된 조절T 세포 단백질은 이 방법의 유용성을 입증하기 위해 선택되었다. <strong...

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Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

아실-RAC(Acyl-Resin Assisted Capture)는 다양한 생물학적 샘플에서 시스테인 잔류물(S-acylation)의 가역적 지질 변형을 검출하는 매우 민감하고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법입니다.

아실-레신 보조 포획을 이용한 단백질 S-아실레이션 검출

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

아실 수지 보조 포획 또는 Acyl-RAC는 다양한 생물학적 샘플에서 단백질 S-acylation을 검출하는 데 사용할 수 있는 민감하고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 프로토콜은 대사 라벨링 및 무선 라벨링의 일부 한계를 우회하고 여러 단백질의 S-acylation을 동시에 검출할 수 있습니다. 살아있는 세포뿐만 아니라 1 차 조직 및 냉동 샘플.S-acylation은 단백질 인신 매매, 플라즈마 멤브레인 타겟팅, 신호 트랜스듀션, 철 수송 및 단백질 단백질 상호 작용과 같은 다양한 세포 과정을 조절할 수 있습니다. 티오에스테르 결합의 효율적이고 구체적인 분열을 보장하기 위해 각 실험에 대해 신중하게 조정된 pH를 사용하여 갓 준비된 하이드록실라민 용액을 사용하는 것이 중요합니다. 이 방법의 데모를 사용하면 클로로폼, 메탄올 강수량과 같은 단계에 중요합니다.이 단계에서 얻은 팬케이크 모양 펠릿은 매우 신중하게 처리해야합니다. 단계 도중 시료의 깨지기 쉽고 부분적인 손실이 고르지 않은 시료 회수로 이어질 수 있다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실대학원생인 사바나 웨스트(Savannah West)가 될 것입니다.세포 리자트를 얻으려면 관심 있는 세포를 원심분리기 튜브로 수집합니다. 그리고 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거합니다. PBS의 5 밀리리터에 펠릿을 세척.그리고 갓 준비된 리시스 버퍼의 600 마이크로리터에서 세포를 즉시 다시 중단합니다. 시료를 분당 1, 500회전에서 온도 4도에서 30분 동안 열 셰이커로 채취한다. lysates를 지우기 전에, 원심분리에 의한 펠릿 세제 및 수용성 물질.원심 분리의 끝에서, 얼음에 미리 냉각 된 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에서 클리어 라이세이트를 수집합니다. 그리고 표준 프로토콜에 따라 단백질 농도를 추정하기 위해 브래드포드 또는 bicinchoninic acid 분석기를 수행한다. 메탄올과 클로로폼을 추가하여 2:1 비율로 lysate합니다.균일한 현탁액을 만들기 위해 엄격하게 흔들어 서 서 원심분리 시료를 수집 하 고 수성 및 유기 상 사이의 인터페이스에서 단백질 펠릿을 수집 합니다. 튜브를 기울이고 바늘이나 젤 로딩 팁을 사용하여 가능한 한 많은 용매를 흡인하십시오. 단백질 펠릿을 몇 분 동안 공기 건조시십시오.튜브 내용기를 메탄올 600 마이크로리터와 부드럽게 혼합하기 전에 펠릿을 분해하지 않도록 주의하십시오. 메탄올 세척을 조심스럽게 제거한 후, 약 5분간 벤치 탑에 단백질 펠릿을 건조시키십시오. 다음으로, 2SHB 완충제의 200 마이크로리터에서 단백질 펠릿을 다시 중단한다.그리고 온도 42도, 1, 500 회전에서 열 셰이커. 펠릿이 용해되면 2SHB에 0.2%MMTS의 200 마이크로리터를 샘플에 추가합니다. 그리고 온도 42도에서 15 분 동안 단백질을 배양하고 열 셰이커에서 분당 1, 500 회전을 배양합니다.인큐베이션이 끝나면 시연된 대로 3:4 클로로폼 메탄올 침전을 수행합니다. MMTS를 제거하려면, 소용돌이와 신선한 2SHB 버퍼의 100 마이크로 리터에 펠릿을 용해. 그리고 각 강수량 후 완충 A의 300 마이크로 리터로 샘플을 희석.최종 강수량 후, 2SHB 버퍼의 200 마이크로리터에 샘플을 용해하고 완충 A.의 240 마이크로리터로 희석하고 단백질 농도를 다시 측정하고 입력 컨트롤로 각 샘플에서 40 마이크로리터를 따로 둡니다. 샘플을 200 마이크로리터의 두 개의 동일한 부부로 분할합니다. 그리고 튜브를 하이드록실라민과 마이너스 하이드록실라민으로 표시합니다.새로 준비된 50개의 마이크로리터를 400밀리머에 첨가한 하이드록실라민 튜브에 최종 농도가 추가됩니다. 그리고 중성 2개의 어금니 나트륨염화나트륨의 50마이크로리터가 마이너스 하이드록실라민 튜브이다. 그런 다음 각 튜브에 30 마이크로리터의 TS 비드 슬러리를 추가합니다.그리고 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 튜브를 회전합니다. 인큐베이션의 끝에서 어떤 잔류 하이드록실라민을 제거하기 위해 버퍼 A에 1 %SDS와 4 번 구슬을 세척. 마지막 세척 후, 3 개의 부드러운 1 분 미세 원심 분리로 모든 비드 샘플을 씻으라.수퍼네이터를 조심스럽게 흡입하고 각 세척시 완충 A에서 1% SDS의 500 마이크로리터로 구슬을 재차스닝합니다. 마지막 세척 후, 시연된 대로 구슬을 부드럽게 회전시합니다. 그리고 구슬을 방해하지 않고 가능한 한 많은 슈퍼 나티브를 흡인.구슬에서 단백질을 회수하려면 각 튜브에 4%SDS 샘플 버퍼의 50 마이크로리터를 추가하고 온도 셰이커에서 15분 동안 분당 섭씨 80도 및 1, 500 회전으로 샘플을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 완전히 구슬을 펠렛 원심분리하기 전에 샘플을 냉각하자. 그런 다음 젤 로딩 팁을 사용하여 용출된 단백질을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮길 수 있습니다.그리고 SDS-PAGE 젤에 샘플을 실행하여 서양 블로팅에 의한 관심 있는 단백질의 S-acylation을 분석한다. 티로신 키나제 Lck은 중성 2개의 어어 하이드록실라민으로 처리된 리자이트에서 검출될 수 있다. 시스테인 잔류물과 지방산 의 양모 사이의 티오에스테르 결합을 갈라.단백질 Fyn 및 LAT에 대하여 항체로 제거및 재검하는 것은 아실 수지 지원한 포획 분석이 동시에 다중 단백질의 S-acylation을 분석하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다. 또한, Lck, Fyn 및 LAT의 S-acylation은 1차 마우스 비장에서 쉽게 검출될 수 있다. 이 수정은 두 종 사이에 보존된다는 것을 나타냅니다.새로운 S-acylated 단백질의 식별 이외에, 이 방법은 또한 다른 생물학 조건하에서 단백질 S-acylation에 있는 변경을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 새로 확인된 S-acylated 단백질의 수는 이중 업이 Acyl-RAC와 같은 빠르고 신뢰할 수 있는 기술을 의미한 후에 엄청나게 증가했습니다. 새로운 S-acylated 단백질의 식별 이외에, 이 방법은 또한 다른 생물학 조건하에서 단백질 S-acylation에 있는 변경을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...