Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd 5R01GM115446 og 1R01GM130840.

Mus som brukes i denne protokollen ble euthanized i henhold til NIH retningslinjer. Dyrevelferdskomiteen ved University of Texas Health Science Center i Houston godkjente alt dyrearbeid.
1. Utarbeidelse av celle lysates
<ol><li>Forbered lysisbufferen som beskrevet i tabell 1. Til 10 ml PBS, tilsett 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside vaskemiddel (DDM) og roter for å oppløse. Tilsett 100 μL fosfatasehemmer cocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) og proteasehemmercocktail (1x) ...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina,+heart,+and+liver.">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin.">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li><li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets.">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li><li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets.">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li><li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes.">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pfl&#252;gers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).</li><li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+palmitoylation,+raft+localization,+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids.">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li><li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck.">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li><li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwissPalm:+Protein+Palmitoylation+database.">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4, 1-23 (2015).</li><li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+[3H]palmitic+acid.">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li><li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+are+IntechOpen+,+the+world's+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists.">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li><li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue.">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li><li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters.">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li><li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

Her brukte vi acyl-RAC-analysen for å oppdage S-acylation av utvalgte proteiner i både kultiverte menneskelige celler og primære celler avledet fra musevev. Denne metoden er enkel, følsom, og kan enkelt utføres med minimale utstyrskrav ved hjelp av standard biokjemiteknikker. Denne metoden har vist seg å identifisere nye S-acylated proteiner som β-subunit av protein translocating system (Sec61b), ribosomal protein S11 (Rps11), og mikrosomal glutation-S-transferase 3 (MGST3)22. Føl...

S-acylation er en reversibel post-translasjonell modifikasjon som involverer tilsetning av en fet acylkjede til en intern cysteinrester på et målprotein via en labile tioester bond1. Det ble først rapportert som en modifikasjon av proteiner med palmitat, en mettet 16-karbon fettsyre2, og derfor er denne endringen ofte referert til som S-palmitoylering. I tillegg til palmitat, proteiner kan være synlig modifisert av en rekke lengre og kortere mettet (myristate og stearat), enumettet (oleate) og flerumettet (arachidonate og eicosapentanoat) fettsyrer3,4,5,6,7. I eukaryyotiske celler katasieres S-acylasjon av en familie av enzymer kjent som DHHC protein acyltransferases og omvendt reaksjon av cystein deacylering er katalysert av protein tioesterases, hvorav de fleste fortsatt forblir gåtefulle8.
Labiliteten til tioesterbindingen gjør denne lipidmodifikasjonen reversibel, slik at den dynamisk kan regulere proteinklynger, plasmamembranlokalisering, intracellulær handel, proteinproteininteraksjoner og proteinstabilitet9,10. Følgelig har S-acylation vært knyttet til flere lidelser, inkludert Huntington sykdom, Alzheimers sykdom og flere typer kreft (prostata, mage, blære, lunge, kolorektal), som nødvendiggjør utvikling av pålitelige metoder for å oppdage denne post-translasjonelle protein modifikasjon11.
Metabolsk merking med radioaktivt ([3H], [14C] eller [125I]) palmitat var en av de første tilnærmingene utviklet for å analyse protein S-acylation12,13,14. Radiomerkingsbaserte metoder presenterer imidlertid helsemessige bekymringer, er ikke veldig følsomme, tidkrevende, og oppdager bare lipidering av svært rikelig proteiner15. Et raskere og ikke-radioaktivt alternativ til radiomerking er metabolsk merking med bioortogonale fettsyresonder, som brukes rutinemessig til å analysedynamikken i protein S-acylation16. I denne metoden er en fettsyre med en kjemisk reporter (alkyne eller azidegruppe) innlemmet i S-acylated protein av et proteinacyltransferase. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaksjon (klikk kjemi) kan deretter brukes til å feste en funksjonalisert gruppe, for eksempel en fluoroforeller eller biotin, til integrert fettsyre som tillater påvisning av S-acylated protein17,18,19.
Acyl-biotin utveksling (ABE) er en av de omfattende brukte biokjemiske metoder for fangst og identifisering av S-acylated proteiner som omgår noen av manglene ved metabolsk merking som uegnethet for vevsprøver15. Denne metoden kan brukes til analyse av S-acylation i et variert utvalg av biologiske prøver, inkludert vev og frosne celleprøver20,,21. Denne metoden er basert på selektiv spalting av tioesterbindingen mellom acylgruppen og cysteinrester av nøytral hydroksylamin. De frigjorte tiolgruppene fanges deretter opp med et tiol-reaktivt biotinderivat. De genererte biotinylated proteiner blir deretter affinitet-renset ved hjelp av streptavidin agarose og analysert av immunblotting.
En alternativ tilnærming kalt acyl-harpiks assistert fangst (Acyl-RAC) ble senere introdusert for å erstatte biotinylation trinn med direkte bøyning av frie cystein av en tiol-reaktiv harpiks22,23. Denne metoden har færre trinn sammenlignet med ABE og kan på samme måte brukes til å oppdage protein S-acylation i et bredt spekter av prøver1.
Acyl-RAC består av 4 hovedtrinn (Figur 1) 1. Blokkering av gratis tiolgrupper; 2. Selektiv spalting av cystein-acyl tioester bånd med nøytral hydroksylamin (HAM) for å avsløre cystein tiol grupper; 3. Fangst av lipiderte cysteinmed en tiol-reaktiv harpiks; 4. Selektiv berikelse av S-acylated proteiner etter elution med reduserende buffer.
De fangede proteinene kan deretter analyseres ved immunblotting eller utsatt for massespektrometri (MS) basert proteomics for å vurdere S-acylated proteome i et variert utvalg av arter og vev22,24,25. Individuelle S-acylation nettsteder kan også identifiseres ved trypsin fordøyelse n av fanget proteiner og analyse av de resulterende peptider av LC-MS/MS22. Her viser vi hvordan acyl-RAC kan brukes til samtidig påvisning av S-acylation av flere proteiner i både en cellelinje og en vevsprøve.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

Protein S-acylation, også referert til som S-palmitoylering, er en reversibel post-translasjonell modifikasjon av cysteinrester med lange kjedefettsyrer via en labile tioester binding. S-acylation, som fremstår som en utbredt regulatorisk mekanisme, kan modulere nesten alle aspekter av den biologiske aktiviteten til proteiner, fra kompleks dannelse til proteinhandel og proteinstabilitet. Den nylige fremgangen i forståelsen av den biologiske funksjonen til protein S-acylation ble oppnådd i stor grad på grunn av utviklingen av nye biokjemiske verktøy som tillater robust og sensitiv påvisning av protein S-acylation i en rekke biologiske prøver. Her beskriver vi acyl harpiksassistert fangst (Acyl-RAC), en nylig utviklet metode basert på selektiv fangst av endogene S-acylated proteiner av tiol-reaktive sepharose perler. Sammenlignet med eksisterende tilnærminger, acyl-RAC krever færre trinn og kan gi mer pålitelige resultater når kombinert med massespektrometri for identifisering av nye S-acylation mål. En stor begrensning i denne teknikken er mangelen på evne til å diskriminere mellom fettsyrearter knyttet til cystein via samme tioester binding.

Etter protokollen beskrevet ovenfor, vi først brukt acyl-RAC å samtidig oppdage S-acylation av flere proteiner i Jurkat celler, en udødeliggjort T cellelinje opprinnelig avledet fra perifert blod av en T celle leukemi pasient27. Regulatoriske T celle proteiner tidligere identifisert som S-acylated9,28,29 ble valgt for å demonstrere nytten av denne metoden. Som vist i figur 2A,</st...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) er en svært følsom, pålitelig og enkel å utføre metode for å oppdage reversibel lipidmodifikasjon av cysteinrester (S-acylation) i en rekke biologiske prøver.

Påvisning av protein s-acylasjon ved hjelp av Acyl-harpiks assistert fangst

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-harpiks assistert fangst eller Acyl-RAC er en følsom og pålitelig metode som kan brukes til å oppdage protein S-acylering i en rekke biologiske prøver. Denne protokollen omgår noen av begrensningene av metabolsk merking og radiomerking, og tillater samtidig påvisning av S-acylering av flere proteiner. Ikke bare levende celler, men også primære vev og frosne prøver.S-acylering kan regulere en rekke cellulære prosesser som proteinhandel, plasmamembran målretting, signaltransduksjon, jerntransport og protein-protein interaksjoner. Det er viktig å bruke nylaget hydroksylaminløsning med nøye justert pH for hvert eksperiment for å sikre en effektiv og spesifikk spaltning av tioesterbindingen. Med en demonstrasjon av denne metoden er det avgjørende for trinn som kloroform, metanol nedbør.Pannekakeformpellet oppnådd under dette trinnet bør håndteres veldig nøye. Det kan være skjør og delvis tap av prøven under trinnet kan føre til ujevn prøvegjenoppretting. Å demonstrere prosedyren vil være Savannah West, en utdannet student fra laboratoriet vårt.For å få cellelyater, samle cellene av interesse i et konisk sentrifugerør. Og fjern eventuelle celleavfall ved sentrifugering. Vask pelleten i 5 milliliter PBS.Og umiddelbart gjenbruke cellene i 600 mikroliter av nylaget lysis buffer. Agiter prøven ved 1500 omdreininger per minutt i en termoshaker i 30 minutter ved fire grader Celsius. Før rydding av lysates, pellet vaskemiddel og løselig materiale ved sentrifugering.På slutten av sentrifugering, samle ryddet lysate i en pre-avkjølt 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør på is. Og utfør en Bradford- eller bicinchoninsyreanalyse for å estimere proteinkonsentrasjonen i henhold til standardprotokoller. Tilsett metanol og kloroform for å lysere med et 2:1-forhold.Rist grundig for å skape en homogen suspensjon og sentrifuge prøven for å samle en proteinpellet på grensesnittet mellom vandige og organiske faser. Vippe røret, bruk en nål eller en gel lasting tips for å aspirere så mye løsemiddel som mulig. Lufttørk proteinpellet i noen minutter.Før du forsiktig blander rørinnholdet med 600 mikroliter metanol, må du være forsiktig så du ikke bryter opp pelleten. Etter nøye fjerning av metanolvasken, tørk proteinpellet på en benkeplate i ca. fem minutter. Deretter bruker proteinpellet i 200 mikroliter 2SHB buffer.Og virvel ved 42 grader Celsius og 1500 omdreininger per minutt i en termoshaker. Når pelleten er oppløst, legg til 200 mikroliter på 0,2% MMTS i 2SHB til prøven. Og inkuber proteinet i 15 minutter ved 42 grader Celsius og 1500 omdreininger per minutt i en termoshaker.På slutten av inkubasjonen, utføre 3:4 kloroform-metanol nedbør som demonstrert. For å fjerne MMTS, oppløs pelleten i 100 mikroliter med fersk 2SHB buffer med vortexing. Og fortynne prøven med 300 mikroliter buffer A etter hver nedbør.Etter den endelige nedbøren oppløs prøvene i 200 mikroliter med 2SHB buffer og fortynne med 240 mikroliter buffer A.Mål proteinkonsentrasjonen igjen og sett av en 40 mikroliter fra hver prøve som inngangskontroller. Del prøver i to like volumer på 200 mikroliter. Og merk rørene som pluss hydroksylamin og minus hydroksylamin.Tilsett 50 mikroliter nylaget nøytralt to molarhydroksylamin til en endelig konsentrasjon på 400 millimolar til pluss hydroksylaminrøret. Og 50 mikroliter nøytrale to molarnatriumklorid til negativ kontroll, et minus hydroksylaminrør. Tilsett deretter 30 mikroliter TS perleslam til hvert rør.Og roter rørene i en til to timer ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen vask perlene fire ganger med 1% SDS i buffer A for å fjerne eventuelle gjenværende hydroksylamin. Etter den siste vasken, vask alle perleprøvene med tre milde ett minutt mikrocentrifugations.Aspirer forsiktig supernativa og resuspending perlene i 500 mikroliter på 1% SDS i buffer A ved hver vask. Etter siste vask, forsiktig spinne ned perlene som demonstrert. Og aspirer så mye overnaturlig som mulig uten å forstyrre perlene.For å gjenopprette proteinene fra perlene, tilsett 50 mikroliter med 4% SDS-prøvebuffer til hvert rør og inkuber prøvene ved 80 grader Celsius og 1500 omdreininger per minutt i 15 minutter i en termoshaker. På slutten av inkubasjonen, la prøvene avkjøles før sentrifuging til helt pellet perlene. Bruk deretter en gellastetips for å overføre de eluted proteinene til nye 1,5 milliliter rør.Og kjør prøvene på en SDS-PAGE gel for å analysere S-acylering av proteiner av interesse ved vestlig blotting. Tyrosinkinase Lck kan påvises i lysater behandlet med nøytralt to molarhydroksylamin. å holde tioesterbindet mellom cysteinrester og fettsyremoaety.Stripping og reprobing med antistoffer mot proteiner Fyn og LAT viser at acyl-harpiks assistert fangst analyse kan brukes til å analysere S-acylering av flere proteiner samtidig. I tillegg kan S-acylation av Lck, Fyn og LAT lett oppdages i primære museplenocytter. Indikerer at denne modifikasjonen er bevart mellom to arter.I tillegg til identifisering av nye S-acylated proteiner, kan denne metoden også brukes til å vurdere endringer i protein S-acylation under forskjellige biologiske forhold. Antallet nyidentifiserte S-acylated proteiner har økt enormt etter at dobbelt opp betydde en rask, og pålitelig teknikk som Acyl-RAC. I tillegg til identifisering av nye S-acylated proteiner, kan denne metoden også brukes til å vurdere endringer i protein S-acylation under forskjellige biologiske forhold.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Deteksjon og visualisering av DNA-skadeinducerte proteinkomplekser i suspensjoncellekulturer ved bruk av næringslysanalysen

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese for forbedret deteksjon av protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteksjon av Heterodimerization av Protein isoformene bruker in Situ nærhet Ligation analysen

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Studere Protein Import i Chloroplasts bruker Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fangst og identifikasjon av RNA-bindende proteiner ved hjelp av Klikk kjemi-assistert RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...