Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde 5R01GM115446 e 1R01GM130840.

Os camundongos utilizados neste protocolo foram eutanizados de acordo com as diretrizes do NIH. O Comitê de Bem-Estar Animal do Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas, em Houston, aprovou todo o trabalho animal.
1. Preparação de lysates celulares
<ol><li>Prepare o buffer de lysis conforme descrito na Tabela 1. A 10 mL de PBS, adicione 0,1 g de n-dodecil β-D-maltoside detergente (DDM) e gire para dissolver. Adicione 100 μL de coquetel inibidor de fosfatase...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina,+heart,+and+liver.">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin.">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li><li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets.">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li><li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets.">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li><li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck.">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li><li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwissPalm:+Protein+Palmitoylation+database.">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4, 1-23 (2015).</li><li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+[3H]palmitic+acid.">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li><li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+are+IntechOpen+,+the+world's+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists.">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li><li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue.">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li><li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters.">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li><li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

Aqui, utilizamos com sucesso o ensaio acil-RAC para detectar a ciação S de proteínas selecionadas em células humanas cultivadas e células primárias derivadas do tecido do camundongo. Este método é simples, sensível e pode ser facilmente realizado com requisitos mínimos de equipamento usando técnicas padrão de bioquímica. Este método tem sido demonstrado para identificar com sucesso novas proteínas S-acylated, como a β-subunidade do sistema de translocação de proteínas (Sec61b), proteína ribossômica S...

A s-acilação é uma modificação pós-translacional reversível que envolve a adição de uma cadeia de acila gordurosa a um resíduo de cisteína interna em uma proteína alvo através de uma ligação de thioester labile1. Foi relatado pela primeira vez como uma modificação de proteínas com palmitato, um ácido graxo saturado de 16carbonos 2, e, portanto, esta modificação é frequentemente referida como S-palmitoylation. Além do palmitato, as proteínas podem ser reversivelmente modificadas por uma variedade de ácidos graxos mais longos e curtos saturados (myristate e esteato), monoinsaturados (oleato) e poliinsaturados (aracidonate e eicosapentanoato) ácidos graxos3,4,5,6,7. Em células eucarióticas, a s-acilação é catalisada por uma família de enzimas conhecidas como aciltransferases de proteína DHHC e a reação reversa da deacinada cisteína é catalisada por thioesterases protéicas, a maioria das quais ainda permanecem enigmáticas8.
A labilidade da ligação tioester torna reversível essa modificação lipídica, permitindo-lhe regular dinamicamente o agrupamento de proteínas, a localização da membrana plasmática, o tráfico intracelular, as interações proteína-proteína e a estabilidade proteica9,10. Consequentemente, a s-acilação tem sido associada a vários distúrbios, incluindo a doença de Huntington, doença de Alzheimer e vários tipos de câncer (próstata, gástrico, bexiga, pulmão, colorretal), o que requer o desenvolvimento de métodos confiáveis para detectar essa modificação proteica pós-translacional11.
A rotulagem metabólica com palmitato radioativo([3H], [14C] ou [125I]) foi uma das primeiras abordagens desenvolvidas para ensaio de proteína S-acilação12,13,14. No entanto, os métodos baseados em rotulagem por radiorotulagem apresentam preocupações de saúde, não são muito sensíveis, demorados e detectam apenas lipidação de proteínas altamente abundantes15. Uma alternativa mais rápida e não radioativa à rotulagem radioativa é a rotulagem metabólica com sondas de ácidos graxos bioortogonais, que é usada rotineiramente para ensaio dinâmico da proteína S-acilação16. Neste método, um ácido graxo com um repórter químico (grupo alquina ou azida) é incorporado na proteína S-acylated por uma proteína aciltransferase. A reação de cicloadição de Azide-alquino Huisgen (química do clique) pode então ser usada para anexar um grupo funcionalizado, como um floróforo ou biotina, ao ácido graxo integrado que permite a detecção da proteína S-acylated17,18,19.
A troca de acilina (ABE) é um dos métodos bioquímicos amplamente utilizados para captura e identificação de proteínas S-acyladas que ignora algumas das deficiências da rotulagem metabólica, como a inadequação para amostras de tecido15. Este método pode ser aplicado para análise da s-acilação em uma variedade diversificada de amostras biológicas, incluindo tecidos e amostras de células congeladas20,21. Este método baseia-se no decote seletivo da ligação tioester entre o grupo acile e o resíduo de cisteína por hidroxilamina neutra. Os grupos thiol liberados são então capturados com um derivado de biotina tiol-reativo. As proteínas biotinyladas geradas são então purificadas por afinidade usando agarose de streptavidin e analisadas por imunoblotting.
Uma abordagem alternativa denominada captura assistida de acilina (Acyl-RAC) foi posteriormente introduzida para substituir a etapa de biotinylation por conjugação direta de cisteínas livres por uma resina tiol-reativa22,23. Este método tem menos passos em comparação com a ABE e da mesma forma pode ser usado para detectar aciação de proteína S em uma ampla gama de amostras1.
A Cil-RAC consiste em 4 passos principais (Figura 1), 1. Bloqueio de grupos de tiol livres; 2. Decote seletivo da ligação cisteine-acila thioester com hidroxilamina neutra (HAM) para expor grupos de cisteína thiol; 3. Captura das cisteínas lipidados com resina tiol-reativa; 4. Enriquecimento seletivo das proteínas S-acylated após elução com a redução do tampão.
As proteínas capturadas podem então ser analisadas por imunoblotting ou submetidas à espectrometria de massa (MS) para avaliar o proteoma s-acylado em uma variedade variada de espécies e tecidos22,24,25. Os locais individuais de s-acilação também podem ser identificados pela digestão da tripsina das proteínas capturadas e análise dos peptídeos resultantes por LC-MS/MS22. Aqui, demonstramos como a acil-RAC pode ser usada para detecção simultânea de s-acilação de múltiplas proteínas em uma linha celular e uma amostra de tecido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

A proteína S-acilação, também referida como S-palmitoylation, é uma modificação pós-translacional reversível de resíduos de cisteína com ácidos graxos de cadeia longa através de uma ligação de tiéster labile. A acilação s, que está emergindo como um mecanismo regulatório generalizado, pode modular quase todos os aspectos da atividade biológica das proteínas, desde a formação complexa até o tráfico de proteínas e a estabilidade proteica. O recente progresso na compreensão da função biológica da proteína S-acilação foi alcançado em grande parte devido ao desenvolvimento de novas ferramentas bioquímicas permitindo a detecção robusta e sensível da proteína S-acilação em uma variedade de amostras biológicas. Aqui, descrevemos a captura assistida por acilina (Acyl-RAC), um método recentemente desenvolvido baseado na captura seletiva de proteínas endógenas S-acylated por contas de Sefarrose reativas de tiol. Em comparação com as abordagens existentes, a Acyl-RAC requer menos passos e pode produzir resultados mais confiáveis quando associada à espectrometria de massa para identificação de novos alvos de acilação S. Uma grande limitação nesta técnica é a falta de capacidade de discriminação entre espécies de ácidos graxos ligadas a cisteínas através da mesma ligação thioester.

Seguindo o protocolo descrito acima, primeiro usamos acil-RAC para detectar simultaneamente a acilação de S de várias proteínas em células de Jurkat, uma linha de células T imortalizada originalmente derivada do sangue periférico de um paciente com leucemia de células T27. As proteínas de células T regulatórias previamente identificadas como S-acylated9,28,29 foram escolhidas para demonstrar a ...

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Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

A Cil-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) é um método altamente sensível, confiável e fácil de executar para detectar modificações lipídicas reversíveis de resíduos de cisteína (S-acilação) em uma variedade de amostras biológicas.

Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Captura assistida por acicl-resina ou Acyl-RAC é um método sensível e confiável que pode ser usado para detectar aciilação de proteínas em uma variedade de amostras biológicas. Este protocolo contorna algumas das limitações da rotulagem metabólica e rotulagem de rádio, e permite a detecção simultânea da S-acylation de múltiplas proteínas. Não só células vivas, mas também tecidos primários e amostras congeladas.A aciilação de S pode regular uma variedade de processos celulares, como tráfico de proteínas, segmentação de membrana plasmática, transdução de sinal, transporte de ferro e interações proteína-proteína. É importante usar a solução de hidroxilamina recém-preparada com pH cuidadosamente ajustado para cada experimento para garantir um decote eficiente e específico da ligação do tioester. Com uma demonstração deste método é fundamental para passos como clorofórmio, precipitação de metanol.A pelota de forma de panqueca obtida durante esta etapa deve ser manuseada com muito cuidado. Pode ser frágil e a perda parcial da amostra durante a etapa pode levar à recuperação desigual da amostra. Demonstrando o procedimento será Savannah West, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório.Para obter lisescelulares, colete as células de interesse em um tubo de centrífuga cônica. E remova qualquer detrito celular por centrifugação. Lave a pelota em 5 mililitros de PBS.E imediatamente resuspensa as células em 600 microliters de tampão de lise recém-preparado. Agitar a amostra a 1.500 revoluções por minuto em um agitador termo por 30 minutos a 4 graus Celsius. Antes de limpar os lises, detergente de pelota e material solúvel por centrifugação.No final da centrifugação, colete o lysate limpo em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro no gelo. E realize um ensaio de ácido bradford ou bicinchonínico para estimar a concentração de proteína de acordo com os protocolos padrão. Adicione metanol e clorofórmio à lise a uma proporção de 2:1.Agite rigorosamente para criar uma suspensão homogênea e centrifugar a amostra para coletar uma pelota de proteína na interface entre as fases aquosa e orgânica. Inclinando o tubo, use uma agulha ou uma ponta de carregamento de gel para aspirar o máximo de solvente possível. O ar secou a pelota de proteína por alguns minutos.Antes de misturar suavemente o conteúdo do tubo com 600 microliters de metanol, tomando cuidado para não quebrar a pelota. Depois de remover cuidadosamente a lavagem do metanol, seque a pelota de proteína em uma parte superior do banco por aproximadamente cinco minutos. Em seguida, resuspenja a pelota de proteína em 200 microliters de tampão 2SHB.E vórtice a 42 graus Celsius e 1.500 revoluções por minuto em um agitador termo. Quando a pelota for dissolvida, adicione 200 microliters de 0,2% MMTS em 2SHB à amostra. E incubar a proteína por 15 minutos a 42 graus Celsius e 1.500 revoluções por minuto em um agitador termo.No final da incubação, realize precipitações de clorofórmio-metanol 3:4, como demonstrado. Para remover o MMTS, dissolva a pelota em 100 microliters de tampão 2SHB fresco com vórtice. E diluir a amostra com 300 microliters de tampão A após cada precipitação.Após a precipitação final, dissolva as amostras em 200 microliters de tampão 2SHB e diluir com 240 microliters de buffer A.Meça novamente a concentração proteica e reserve 40 microliters de cada amostra como controles de entrada. As amostras divididas em dois volumes iguais de 200 microliters. E marque os tubos como mais hidroxilamina e menos hidroxilamina.Adicione 50 microliters de hidroxilamina neutra recém-preparada a uma concentração final de 400 mililitros ao tubo de hidroxilamina plus. E 50 microliters de dois cloretos de sódio molar neutro para o controle negativo, um tubo de hidroxilamina menos. Em seguida, adicione 30 microliters de chorume de contas TS a cada tubo.E gire os tubos por uma a duas horas em temperatura ambiente. No final da incubação lave as contas quatro vezes com 1%SDS no buffer A para remover qualquer hidroxilamina residual. Após a última lavagem, lave todas as amostras de contas com três microcentrifugações suaves de um minuto.Aspirando cuidadosamente os supernantes e reutilizando as contas em 500 microlitres de 1%SDS no buffer A em cada lavagem. Após a última lavagem, gire suavemente as contas como demonstrado. E aspirar o máximo de supernascida possível sem perturbar as contas.Para recuperar as proteínas das contas, adicione 50 microliters de 4%SDS tampão de amostra em cada tubo e incubar as amostras a 80 graus Celsius e 1.500 revoluções por minuto durante 15 minutos em um agitador termo. No final da incubação, deixe as amostras esfriarem antes de centrifugar para pastar completamente as contas. Em seguida, use uma ponta de carregamento de gel para transferir as proteínas elucidadas em novos tubos de 1,5 mililitro.E execute as amostras em um gel SDS-PAGE para analisar a S-acylation das proteínas de interesse por manchas ocidentais. Tyrosine quinase Lck pode ser detectado em lysates tratados com hidroxilamina molar neutra. para cortar a ligação thioester entre resíduos de cisteína e a moiety ácido graxo.Descascando e rerobinando com anticorpos contra proteínas Fyn e LAT demonstram que o ensaio de captura assistida aciila-resina pode ser usado para analisar a aciilação de múltiplas proteínas ao mesmo tempo. Além disso, a aciilação de Lck, Fyn e LAT pode ser prontamente detectada em esplenócitos de camundongos primários. Indicando que esta modificação é conservada entre duas espécies.Além da identificação de novas proteínas S-acylated, este método também pode ser usado para avaliar mudanças na proteína S-acylation em diferentes condições biológicas. O número de proteínas S-acylated recém-identificadas aumentou tremendamente após o double-up significou uma técnica rápida e confiável, como a Acyl-RAC. Além da identificação de novas proteínas S-acylated, este método também pode ser usado para avaliar mudanças na proteína S-acylation em diferentes condições biológicas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Estudando a importação de proteínas em cloroplastos usando protoplastas

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...