Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения грантов 5R01GM115446 и 1R01GM130840.

Мыши, используемые в этом протоколе, были усыплены в соответствии с руководящими принципами NIH. Комитет по защите животных в Научном центре здравоохранения Техасского университета в Хьюстоне одобрил все работы с животными.
1. Подготовка клеточных лисатов
<ol><li>Подготовк?...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina,+heart,+and+liver.">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin.">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li><li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets.">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li><li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets.">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li><li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes.">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pfl&#252;gers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).</li><li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+palmitoylation,+raft+localization,+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids.">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li><li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck.">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li><li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwissPalm:+Protein+Palmitoylation+database.">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4, 1-23 (2015).</li><li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+[3H]palmitic+acid.">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li><li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+are+IntechOpen+,+the+world's+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists.">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li><li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue.">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li><li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters.">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li><li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

Здесь мы успешно использовали ацил-RAC анализ для обнаружения S-ацилирования отдельных белков как в культивированных человеческих клеток и первичных клеток, полученных из ткани мыши. Этот метод прост, чувствителен и может быть легко выполнен с минимальными требованиями к оборудованию с...

S-ациляция является обратимой пост-трансляционной модификации с участием добавления жировой цепи ацила к внутренним остаткам цистеина на целевой белок через лабильный тиоэфир облигации1. Впервые сообщалось, как модификация белков с palmitate, насыщенных 16-углеродной жирной кислоты2, и поэтому эта модификация часто называют S-palmitoylation. В дополнение к пальмитату, белки могут быть обратимы различными более длинными и короткими насыщенными (миристейстом и стеатом), мононенасыщенными (олеатом) и полиненасыщенными (арачидонаинат и эйкозапентановат) жирными кислотами3,,4,5,,6,,7. В эукариотических клетках, S-ацилирование является катализатором семьи ферментов, известных как DHHC белка ацилтрансферазы и обратная реакция цистеина деакилиации является катализируется белка thioesterases, большинство из которых до сих пор остаются загадочными8.
Lability связи тиоэстера делает эту липидную модификацию обратимой, позволяя ей динамически регулировать кластеризацию белков, локализацию плазменной мембраны, внутриклеточный оборот, белково-белковые взаимодействия и стабильность белка9,10. Следовательно, S-акилирование было связано с несколькими расстройствами, включая болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера и несколько видов рака (простата, желудок, мочевой пузырь, легкие, колоректальные), что требует разработки надежных методов для обнаружения этого пост-переводного белка модификации11.
Метаболическая маркировка с радиоактивным (No3H,14C) или125Я) palmitate был одним из первых подходов, разработанных для проверки белка S-ацилинг12,13,14. Тем не менее, радиомаркировка на основе методов настоящее здоровье проблем, не очень чувствительны, отнимает много времени, и только обнаружить липидацию очень обильные белки15. Быстрее и нерадиоактивной альтернативой радиомаркировке является метаболическая маркировка биоортогональными жирными кислотными зондами, которые регулярно используются для проверки динамики белка S-acylation16. В этом методе, жирные кислоты с химическим репортером (алкин или азид группы) включена в S-ацилатированный белок белка ацилтрансферазы. Азидея-алкин huisgen циклоaddition реакции (нажмите химии) может быть использован для присоединения функционализованной группы, такие как фторофор или биотин, к интегрированной жирной кислоты, что позволяет для обнаружения S-ацилатированный белок17,18,19.
Ацил-биотин обмен (ABE) является одним из широко используемых биохимических методов для захвата и идентификации S-ацилатных белков, что обходит некоторые недостатки метаболической маркировки, такие как непригодность для образцов тканей15. Этот метод может быть применен для анализа S-ациляции в различных биологических образцов, в том числе тканей и замороженных образцов клеток20,21. Этот метод основан на селективном расщеплении тиоэстерной связи между ациловой группой и остатками цистеина нейтральным гидроксиламином. Освобожденные группы тиола затем захватываются с тиол-реактивной производной биотина. Генерируемые биоинтинилапотированные белки затем сродство очищается с помощью стрептавидина агарозы и анализируются с помощью иммуноблоттинга.
Альтернативный подход называется acyl-resin помощь захвата (Acyl-RAC) был позже введен, чтобы заменить биотинилационный шаг с прямым спряжением свободных цистеинов тиол-реактивного ресина22,23. Этот метод имеет меньше шагов по сравнению с ABE и аналогичным образом может быть использован для обнаружения белка S-ациляции в широком диапазоне образцов1.
Acyl-RAC состоит из 4 основных ступеней(рисунок 1), 1. Блокирование свободных групп тиола; 2. Селективное расщепление цистеино-ациловый тиоэстер связи с нейтральным гидроксиламином (HAM) для разоблачения цистеина тиол групп; 3. Захват липидных цистеинов с тиол-реактивным ресином; 4. Избирательное обогащение S-ацилатированных белков после elution с уменьшением буфера.
Захваченные белки могут быть проанализированы с помощью иммуноблоттинга или подвергнуты массовой спектрометрии (MS) на основе протеомики для оценки S-ацилата протеома в различных видов и тканей22,24,25. Индивидуальные s-ацилирования сайты также могут быть определены путем трипсина переваривания захваченных белков и анализа в результате пептиды LC-MS/MS22. Здесь мы демонстрируем, как ацил-РАК может быть использован для одновременного обнаружения S-ацилирования нескольких белков как в клеточной линии, так и в образце ткани.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

Белок S-ациляция, также называют S-palmitoylation, является обратимой пост-переводной модификации цистеина остатков с длинноцепочечными жирными кислотами через лабильное тиоэфирное крепление. S-ациляция, которая становится широко распространенным регулирующим механизмом, может модулировать почти все аспекты биологической активности белков, от комплексного образования до торговли белками и стабильности белка. Недавний прогресс в понимании биологической функции белка S-acylation был достигнут в значительной степени благодаря разработке новых биохимических инструментов, позволяющих надежно и чувствительное обнаружение белка S-ацилирования в различных биологических образцах. Здесь мы описываем ацил-ресинуажный захват (Acyl-RAC), недавно разработанный метод, основанный на селективном улавливании эндогенно S-ацилатированных белков тиол-реактивными бусинами сефарозы. По сравнению с существующими подходами, Acyl-RAC требует меньше шагов и может дать более надежные результаты в сочетании с масс-спектрометрией для идентификации новых целей S-acylation. Основным ограничением в этой технике является отсутствие способности различать виды жирных кислот, прикрепленных к цистеинам через ту же связь тиостера.

Следуя описанному выше протоколу, мы впервые использовали ацил-РАК для одновременного обнаружения S-ацилирования нескольких белков в клетках Jurkat, увековеченной линии Т-клеток, первоначально полученной из периферической крови пациента с лейкемией Т-клеток27. Регуляторные ?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) является высокочувствительным, надежным и простым в выполнении методом обнаружения обратимой липидной модификации остатков цистеина (S-acylation) в различных биологических образцах.

Обнаружение белка S-Acylation с использованием acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-resin assisted capture или Acyl-RAC является чувствительным и надежным методом, который может быть использован для обнаружения белка S-acylation в различных биологических образцах. Этот протокол обходит некоторые ограничения метаболической маркировки и радиосвязи, а также позволяет одновременно обнаруживать S-ациляцию нескольких белков. Не только живые клетки, но и первичные ткани и замороженные образцы.S-acylation может регулировать различные клеточные процессы, такие как торговля белками, плазменная мембрана ориентации, трансдукция сигнала, транспортировка железа, и белково-белковых взаимодействий. Важно использовать свежеприготовленный раствор гидроксиламина с тщательно скорректированным рН для каждого эксперимента, чтобы обеспечить эффективное и специфическое расщепление тиоэстерной связи. С демонстрацией этого метода очень важно для таких шагов, как хлороформ, метанол осадков.Гранулы блинной формы, полученные во время этого шага, должны обрабатываться очень осторожно. Это может быть хрупким и частичная потеря образца во время шага может привести к неравномерному восстановлению выборки. Демонстрацией процедуры будет Саванна Уэст, аспирант нашей лаборатории.Чтобы получить лизы клеток, соберите клетки, представляющие интерес в коническую центрифугу трубки. И удалите любой клеточный мусор путем центрифугации. Вымойте гранулы в 5 миллилитров PBS.И сразу же повторно помесить клетки в 600 микролитров свежеприготовленного буфера лиза. Агитировать образец на 1500 оборотов в минуту в термо шейкер в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию. Перед очисткой ликатов, гранул моющего средства и растворимого материала центрифугированием.В конце центрифугации соберите очищенный лизат в предварительно охлажденные 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку на льду. И выполнить Брэдфорд или бицинхониновой кислоты анализ для оценки концентрации белка в соответствии со стандартными протоколами. Добавьте метанол и хлороформ к лисату при соотношении 2:1.Встряхните строго, чтобы создать однородную суспензию и центрифугу образца, чтобы собрать белковые гранулы на стыке между аквеозной и органической фазами. Наклоняя трубку, используйте иглу или наконечник погрузки геля, чтобы аспирировать как можно больше растворителя. Воздух высушит белковые гранулы в течение нескольких минут.Перед тем, как аккуратно смешать содержимое трубки с 600 микролитров метанола, заботясь, чтобы не разбить гранулы. После тщательного удаления метанола мыть, высушить белковые гранулы на скамейке верхней около пяти минут. Далее, повторное потребление белковых гранул в 200 микролитров буфера 2SHB.И вихрь при 42 градусах Цельсия и 1500 оборотов в минуту в термо шейкере. Когда гранулы растворяются, добавьте в образец 200 микролитров 0,2%MMTS в 2SHB. И инкубировать белок в течение 15 минут при 42 градусах Цельсия и 1500 оборотов в минуту в термо шейкере.В конце инкубации выполнить 3:4 хлороформ-метанол осадков, как попродемонстрировано. Чтобы удалить MMTS, растворите гранулы в 100 микролитров свежего буфера 2SHB с вихрем. И разбавить образец 300 микролитров буфера А после каждого осадка.После окончательного осадка растворите образцы в 200 микролитров буфера 2SHB и разбавьте 240 микролитров буфера A.Измерьте концентрацию белка снова и отложите 40 микролитров из каждого образца в качестве входного контроля. Разделите образцы на два равных тома по 200 микролитров. И отметь трубки как плюс гидроксиламин и минус гидроксиламин.Добавьте 50 микролитров свежеприготовленных нейтральных двух толярных гидроксиламинов в окончательную концентрацию 400 миллимоляров в плюс гидроксиламиновую трубку. И 50 микролитров нейтральных двух молярных хлорида натрия к отрицательному контролю, минус гидроксиламиновая трубка. Затем добавьте 30 микролитров навоза шарика TS в каждую трубку.И поверните трубки на один-два часа при комнатной температуре. В конце инкубации мыть бисер четыре раза с 1%SDS в буфере, чтобы удалить любые остаточные гидроксиламин. После последней стирки, мыть все образцы бисера с тремя нежными одну минуту микроцентрифугации.Тщательно аспирации supernatants и resuspending бусы в 500 микролитров 1%SDS в буфере А при каждой стирке. После последнего мытья, осторожно спина вниз бисера, как попродемонстрировано. И аспирировать как можно больше супернатантных, насколько это возможно, не нарушая бисера.Чтобы восстановить белки из бисера, добавьте 50 микролитров буфера образца 4%SDS в каждую трубку и инкубировать образцы при 80 градусах Цельсия и 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут в термо шейкере. В конце инкубации, дайте образцам остыть перед центрифугой, чтобы полностью гранулировать бисер. Затем используйте наконечник загрузки геля для переноса элеваторных белков в новые 1,5 миллилитровые трубки.И запустить образцы на SDS-PAGE гель для анализа S-ацилляции белков, представляющих интерес для западных blotting. Тирозинкиназа Lck может быть обнаружена в лизатах, обработанных нейтральными двумя молярными гидроксиламинами. чтобы расщепить связь тиоэстер между остатками цистеин и жировых кислот moiety.Зачистка и reprobing с антителами против белков Fyn и LAT показывают, что ацил-смола помощь захвата анализ может быть использован для анализа S-ацилляции нескольких белков в то же время. Кроме того, S-ациляция Lck, Fyn и LAT может быть легко обнаружена в первичных сплайкоцитах мыши. Указание на то, что эта модификация сохраняется между двумя видами.В дополнение к идентификации новых S-acylated белков, этот метод также может быть использован для оценки изменений в белке S-ацилляции в различных биологических условиях. Количество вновь выявленных S-acylated белков значительно увеличилось после двойного вверх означало быстрый, и надежный метод, такой как Acyl-RAC. В дополнение к идентификации новых S-acylated белков, этот метод также может быть использован для оценки изменений в белке S-ацилляции в различных биологических условиях.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Взаимодействие с мРНК из протопластов растений

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Горизонтальный гель-электрофорез для расширенного обнаружения комплексов протеин-РНК

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Обнаружение Heterodimerization изоформ белка, используя Assay в Situ близости лигирование

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Изучая белка импорта в хлоропластов, используя протопластов

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...