Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por las becas 5R01GM115446 y 1R01GM130840 de los Institutos Nacionales de Salud.

Los ratones utilizados en este protocolo fueron eutanasiados de acuerdo con las directrices de NIH. El Comité de Bienestar Animal del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston aprobó todo el trabajo animal.
1. Preparación de los lysaatos celulares
<ol><li>Prepare el búfer de lisis como se describe en la Tabla 1. A 10 ml de PBS, añadir 0,1 g de detergente n-dodecílo-D-maltoside (DDM) y rotar para disolver. Añadir 100 l de cóctel inhibidor de...

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	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

Aquí, utilizamos con éxito el ensayo acyl-RAC para detectar La acilación S de proteínas seleccionadas tanto en células humanas cultivadas como en células primarias derivadas del tejido del ratón. Este método es simple, sensible y se puede realizar fácilmente con requisitos mínimos de equipos utilizando técnicas de bioquímica estándar. Se ha demostrado que este método identifica con éxito nuevas proteínas S-aciladas, como la subunidad del sistema de transubicación de proteínas (Sec61b), la proteína ribo...

La acilación S es una modificación post-traduccional reversible que implica la adición de una cadena de acilo graso a un residuo interno de cisteína en una proteína diana a través de una unión labile tioester1. Primero se informó como una modificación de proteínas con palmitato, un ácido graso saturado de 16 carbonos2,y por lo tanto esta modificación se conoce a menudo como S-palmitoylation. Además del palmitato, las proteínas pueden ser modificadas reversiblemente por una variedad de ácidos grasos saturados más largos y más cortos (miristate y estearato), monoinsaturados (oleato) y poliinsaturados (araquidonato y eicosapentanoato)3,4,5,6,7. En las células eucariotas, la acilación S es catalizada por una familia de enzimas conocidas como aciltransferasas de proteína DHHC y la reacción inversa de la deccilación de cisteína es catalizada por tilanarias de proteína, la mayoría de las cuales siguen siendo enigmáticas8.
La labilidad del enlace tioester hace que esta modificación lipídica sea reversible, lo que le permite regular dinámicamente el clustering de proteínas, la localización de membranas plasmáticas, el tráfico intracelular, las interacciones proteína-proteína y la estabilidad de proteínas9,,10. En consecuencia, la acilación S se ha relacionado con varios trastornos, incluyendo la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y varios tipos de cáncer (próstata, gástrico, vejiga, pulmón, colorrectal), que requiere el desarrollo de métodos confiables para detectar esta modificación de proteína post-traduccional11.
El etiquetado metabólico con palmitato radiactivo ([3H], [14C] o [125I]) fue uno de los primeros enfoques desarrollados para analizar la proteína S-acylation12,13,14. Sin embargo, los métodos basados en radioetiquetado presentan problemas de salud, no son muy sensibles, consumen mucho tiempo y sólo detectan la lipidedeción de proteínas altamente abundantes15. Una alternativa más rápida y no radioactiva al radioetiquetado es el etiquetado metabólico con sondas de ácidos grasos bioortogonales, que se utiliza rutinariamente para analizar la dinámica de la proteína S-acylation16. En este método, un ácido graso con un reportero químico (grupo de alquino o azida) se incorpora a la proteína S-acilado por una proteína acitransferasa. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaction (clic chemistry) se puede utilizar para unir un grupo funcionalizado, como un fluoróforo o biotina, al ácido graso integrado que permite la detección de la proteína S-acylated17,18,19.
El intercambio de acilina-acilo (ABE) es uno de los métodos bioquímicos ampliamente utilizados para la captura e identificación de proteínas s aciladas que evita algunas de las deficiencias del etiquetado metabólico, como la inadecuación para las muestras de tejido15. Este método se puede aplicar para el análisis de S-acylation en una amplia gama de muestras biológicas, incluyendo tejidos y muestras de células congeladas20,,21. Este método se basa en el escote selectivo del enlace tioéster entre el grupo de acilo y el residuo de cisteína por hidroxilamina neutra. Los grupos tiol liberados son capturados con un derivado de la biotina tiol-reactivo. Las proteínas biotiniladas generadas se purifican con afinidad mediante agarosa de estreptavidina y se analizan mediante inmunoblotting.
Más tarde se introdujo un enfoque alternativo llamado captura asistida de acilo-resina (Acyl-RAC) para reemplazar el paso de biotinylación por la conjugación directa de cisteínas libres por una resina tio-reactiva22,23. Este método tiene menos pasos en comparación con ABE y de forma similar se puede utilizar para detectar la proteína S-acylation en una amplia gama de muestras1.
Acyl-RAC consta de 4 pasos principales(Figura 1), 1. Bloqueo de grupos de tiol libres; 2. Escisión selectiva de la unión tioester de cisteína-acyl con hidroxilamina neutra (HAM) para exponer los grupos de tiol de cisteína; 3. Captura de las cisteínas lipicadas con una resina tiol-reactiva; 4. Enriquecimiento selectivo de las proteínas S-acylated después de la elución con tampón reductor.
Las proteínas capturadas pueden ser analizadas mediante inmunoblotting o sometidas a espectrometría de masas (MS) proteómica para evaluar el proteoma S-acilado en una variada gama de especies y tejidos22,,24,,25. Los sitios individuales de S-acylation también pueden ser identificados por la digestión de la trippsina de las proteínas capturadas y el análisis de los péptidos resultantes por LC-MS/MS22. Aquí, demostramos cómo acile-RAC se puede utilizar para la detección simultánea de S-acylation de múltiples proteínas tanto en una línea celular como en una muestra de tejido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

La proteína S-acylation, también conocida como S-palmitoylation, es una modificación post-traduccional reversible de residuos de cisteína con ácidos grasos de cadena larga a través de un enlace labile tioester. La acilación S, que está emergiendo como un mecanismo regulador generalizado, puede modular casi todos los aspectos de la actividad biológica de las proteínas, desde la formación compleja hasta el tráfico de proteínas y la estabilidad de las proteínas. Los recientes avances en la comprensión de la función biológica de la proteína S-acylation se lograron en gran medida debido al desarrollo de nuevas herramientas bioquímicas que permitieron la detección robusta y sensible de la proteína S-acylation en una variedad de muestras biológicas. Aquí, describimos la captura asistida por resina de acilo (Acyl-RAC), un método desarrollado recientemente basado en la captura selectiva de proteínas endógenamente S-aciladas por cuentas de sepharose tiol-reactivas. En comparación con los enfoques existentes, Acyl-RAC requiere menos pasos y puede producir resultados más fiables cuando se combina con espectrometría de masas para la identificación de nuevos objetivos de acilación S. Una limitación importante en esta técnica es la falta de capacidad para discriminar entre especies de ácidos grasos unidos a las cisteínas a través del mismo enlace tioester.

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, primero usamos acyl-RAC para detectar simultáneamente S-acylation de varias proteínas en las células de Jurkat, una línea de células T inmortalizada originalmente derivada de la sangre periférica de un paciente de leucemia de células T27. Las proteínas de células T reguladoras previamente identificadas como S-acylated9,28,29 fueron elegidas para demo...

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Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) es un método altamente sensible, confiable y fácil de realizar para detectar la modificación reversible de los residuos de cisteína (S-acylation) en una variedad de muestras biológicas.

Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

La captura asistida de acil-resina o Acyl-RAC es un método sensible y fiable que se puede utilizar para detectar la proteína S-acilación en una variedad de muestras biológicas. Este protocolo evita algunas de las limitaciones del etiquetado metabólico y el etiquetado radioeléctrico, y permite la detección simultánea de S-acilación de múltiples proteínas. No sólo células vivas, sino también tejidos primarios y muestras congeladas.La acilación S puede regular una variedad de procesos celulares como el tráfico de proteínas, la focalización de la membrana plasmática, la transducción de señales, el transporte de hierro y las interacciones proteína-proteína. Es importante utilizar una solución de hidroxilamina recién preparada con pH cuidadosamente ajustado para cada experimento para asegurar un escote eficiente y específico del enlace de tioester. Con una demostración de este método es fundamental para pasos como cloroformo, precipitación de metanol.El pellet de forma de panqueque obtenido durante este paso debe manejarse con mucho cuidado. Puede ser frágil y la pérdida parcial de la muestra durante el paso puede conducir a una recuperación de la muestra desigual. Demostrar el procedimiento estará Savannah West, una estudiante graduada de nuestro laboratorio.Para obtener los lysates celulares, recoja las células de interés en un tubo de centrífuga cónica. Y retire los restos celulares por centrifugación. Lavar el pellet en 5 mililitros de PBS.Y resuspender inmediatamente las células en 600 microlitros de tampón de lelisis recién preparado. Agitar la muestra a 1.500 revoluciones por minuto en un agitador térmico durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Antes de limpiar los lysates, detergente de pellets y material soluble por centrifugación.Al final de la centrifugación, recoger el izado despejado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preenfriado sobre hielo. Y realizar un ensayo de Bradford o ácido bicinchoninic para estimar la concentración de proteínas de acuerdo con los protocolos estándar. Añadir metanol y cloroformo para el izado en una proporción de 2:1.Agitar rigurosamente para crear una suspensión homogénea y centrifugar la muestra para recoger un pellet de proteína en la interfaz entre las fases acuosa y orgánica. Inclinar el tubo, utilizar una aguja o una punta de carga de gel para aspirar tanto disolvente como sea posible. Seque al aire el pellet proteico durante unos minutos.Antes de mezclar suavemente el contenido del tubo con 600 microlitros de metanol, teniendo cuidado de no romper el pellet. Después de retirar cuidadosamente el lavado de metanol, seque el pellet proteico en una mesa de banco durante aproximadamente cinco minutos. A continuación, resuspender el pellet de proteína en 200 microlitros de tampón 2SHB.Y vórtice a 42 grados Celsius y 1.500 revoluciones por minuto en un agitador térmico. Cuando el pellet se disuelva, agregue 200 microlitros de 0.2%MMTS en 2SHB a la muestra. E incubar la proteína durante 15 minutos a 42 grados Celsius y 1.500 revoluciones por minuto en un agitador térmico.Al final de la incubación, realizar 3:4 precipitaciones de cloroformo-metanol como se demuestra. Para eliminar el MMTS, disuelva el pellet en 100 microlitros de tampón 2SHB fresco con vórtice. Y diluir la muestra con 300 microlitros de tampón A después de cada precipitación.Después de la precipitación final, disolver las muestras en 200 microlitros de tampón 2SHB y diluir con 240 microlitros de tampón A.Medir la concentración de proteína de nuevo y reservar 40 microlitros de cada muestra como controles de entrada. Divida las muestras en dos volúmenes iguales de 200 microlitros. Y marcar los tubos como más hidroxiamina y menos hidroxiamina.Añadir 50 microlitros de dos hidroxiamina molares neutrales recién preparados a una concentración final de 400 mililitros al tubo de hidroxilamina más. Y 50 microlitros de cloruro de sodio molar neutro al control negativo, un tubo menos hidroxiamina. A continuación, agregue 30 microlitros de lodo de perlas TS a cada tubo.Y gire los tubos durante una o dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación lavar las cuentas cuatro veces con 1%SDS en el tampón A para eliminar cualquier hidroxilamina residual. Después del último lavado, lave todas las muestras de cuentas con tres microcentrifugaciones suaves de un minuto.Aspirar cuidadosamente los sobrenadantes y resuspender las perlas en 500 microlitros de 1%SDS en el tampón A en cada lavado. Después del último lavado, gire suavemente hacia abajo las cuentas como se ha demostrado. Y aspirar tanto sobrenadante como sea posible sin alterar las cuentas.Para recuperar las proteínas de las perlas, agregue 50 microlitros de tampón de muestra 4%SDS a cada tubo e incubar las muestras a 80 grados Celsius y 1.500 revoluciones por minuto durante 15 minutos en un agitador térmico. Al final de la incubación, deje que las muestras se enfríen antes de centrifugar para peletizar completamente las perlas. Luego usa una punta de carga de gel para transferir las proteínas eluidas a nuevos tubos de 1,5 mililitros.Y ejecuta las muestras en un gel SDS-PAGE para analizar la S-acilación de las proteínas de interés por western blotting. La tirosina quinasa Lck se puede detectar en licanatos tratados con dos hidroxiamina molares neutrales. para cortar el enlace de tioester entre los residuos de cisteína y la mitad de ácidos grasos.El despojo y el reproche con anticuerpos contra proteínas Fyn y LAT demuestran que el ensayo de captura asistida por acil-resina se puede utilizar para analizar la Acilación S de múltiples proteínas al mismo tiempo. Además, la Acilación S de Lck, Fyn y LAT se puede detectar fácilmente en los splenocitos primarios de ratón. Indicando que esta modificación se conserva entre dos especies.Además de la identificación de nuevas proteínas S-aciladas, este método también se puede utilizar para evaluar los cambios en la proteína S-acilación en diferentes condiciones biológicas. El número de proteínas S-aciladas recién identificadas ha aumentado enormemente después de que el doble significado una técnica rápida y confiable como Acyl-RAC. Además de la identificación de nuevas proteínas S-aciladas, este método también se puede utilizar para evaluar los cambios en la proteína S-acilación en diferentes condiciones biológicas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Investigación

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Electroforesis en gel horizontal para la detección mejorada de los complejos proteína-ARN

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Estudiando la importación de la proteína en cloroplastos con protoplastos

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

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Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Captura e identificación de proteínas de unión a RNA usando Click química asistida por ARN-interactoma capturan (CARIC) estrategia

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

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