Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health grants 5R01GM115446 och 1R01GM130840.

Möss som används i detta protokoll avlivades enligt NIH riktlinjer. Djurskyddskommittén vid University of Texas Health Science Center i Houston godkände allt djurarbete.
1. Beredning av cell lysates
<ol><li>Förbered lysbuffert enligt beskrivningen i tabell 1. Till 10 ml PBS, tillsätt 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside tvättmedel (DDM) och rotera för att lösa upp. Tillsätt 100 μl fosfatashämmare cocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) och proteashämmare cocktail (1x...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina,+heart,+and+liver.">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin.">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li><li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets.">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li><li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets.">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li><li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes.">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pfl&#252;gers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).</li><li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+palmitoylation,+raft+localization,+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids.">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li><li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck.">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li><li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwissPalm:+Protein+Palmitoylation+database.">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4, 1-23 (2015).</li><li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+[3H]palmitic+acid.">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li><li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+are+IntechOpen+,+the+world's+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists.">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li><li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue.">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li><li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters.">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li><li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

Här har vi framgångsrikt utnyttjat acyl-RAC-analysen för att upptäcka S-acylation av utvalda proteiner i både odlade mänskliga celler och primära celler som härrör från musvävnad. Denna metod är enkel, känslig och kan enkelt utföras med minimala utrustningskrav med hjälp av standardbiokemitekniker. Denna metod har visat sig framgångsrikt identifiera nya S-acylaterade proteiner såsom β-underenheten i proteinflyttningssystemet (Sec61b), ribosomalt protein S11 (Rps11) och microsomal glutation-S-tr...

S-acylation är en reversibel post-translationell modifiering som innebär tillsats av en fet acylkedja till en intern cystein rester på ett målprotein via en labile tiooter bindning1. Det rapporterades först som en ändring av proteiner med palmitat, en mättad 16-kolfettsyra2, och därför denna ändring kallas ofta S-palmitoylation. Förutom palmitat kan proteiner vördas av en mängd längre och kortare mättade (myristate och stearate), enkelomättade (oleat) och fleromättade (arachidonate och eicosapentanoate) fettsyror3,,4,,5,,6,7. I eukaryota celler, S-acylation katalyseras av en familj av enzymer som kallas DHHC protein acyltransferases och den omvända reaktionen av cystein deacylation är katalyserad av protein tioesteraser, varav de flesta fortfarande gåtfulla8.
Labiliteten hos tioesterbindningen gör denna lipidmodifiering reversibel, vilket gör det möjligt att dynamiskt reglera proteinkluster, plasmamembranlokalisering, intracellulär handel, protein-proteininteraktioner och proteinstabilitet9,10. Följaktligen har S-acylation kopplats till flera sjukdomar inklusive Huntingtons sjukdom, Alzheimers sjukdom och flera typer av cancer (prostata, mag, urinblåsa, lunga, kolorektal), vilket kräver utveckling av tillförlitliga metoder för att upptäcka denna post-translationella protein modifiering11.
Metabolisk märkning med radioaktiv ([3H], [14C] eller [125I]) palmitat var en av de första metoder som utvecklats för att analysera proteinet S-acylation12,13,14. Men radiolabeling-baserade metoder presentera hälsoproblem, är inte särskilt känsliga, tidskrävande, och bara upptäcka lipidering av mycket rikliga proteiner15. Ett snabbare och icke-radioaktivt alternativ till radiomärkning är metabolisk märkning med bioorthogonala fettsyror sonder, som används rutinmässigt för att analysera dynamiken i proteinet S-acylation16. I denna metod, en fettsyra med en kemisk reporter (alkyne eller azide grupp) ingår i S-acylaterade proteinet av ett protein acyltransferase. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaktion (klicka kemi) kan sedan användas för att fästa en funktionaliserad grupp, såsom en fluorofore eller biotin, till den integrerade fettsyran möjliggör detektion av S-acylated protein17,18,19.
Acyl-biotin utbyte (ABE) är en av de omfattande använda biokemiska metoder för avskiljning och identifiering av S-acylaterade proteiner som kringgår några av bristerna i metabolisk märkning såsom olämplighet för vävnadsprover15. Denna metod kan användas för analys av S-acylation i ett varierat antal biologiska prover, inklusive vävnader och frysta cellprover20,21. Denna metod är baserad på selektiv klyvning av tioesterbindningen mellan acylgruppen och cysteinresterna genom neutral hydroxylamin. De befriade tioolgrupperna fångas sedan med ett tioolreaktivt biotinderivat. De genererade biotinylerade proteinerna renas sedan med hjälp av streptavidin agarose och analyseras genom immunoblotting.
En alternativ metod som kallas acyl-harts assisterad fångst (Acyl-RAC) infördes senare för att ersätta biotinylation steg med direkt konjugering av fria cysteiner med en tiool-reaktiv harts22,23. Denna metod har färre steg jämfört med ABE och på samma sätt kan användas för att upptäcka protein S-acylation i ett brett spektrum av prover1.
Acyl-RAC består av 4 huvudsteg (figur 1), 1. Blockering av fria tioolgrupper. 2. Selektiv klyvning av cystein-acyl tioesterbindning med neutral hydroxylamin (HAM) för att exponera cysteintiosgrupper. 3. Fånga av lipiderade cysteiner med en tioolreaktiv harts; 4. Selektiv anrikning av S-acylaterade proteiner efter eluering med reducerande buffert.
De fångade proteinerna kan sedan analyseras genom immunblottning eller utsättas för masspektrometri (MS) baserade proteomik för att bedöma S-acylaterad proteom i ett varierat antal arter och vävnader22,24,25. Enskilda S-acylation platser kan också identifieras genom trypsin matsmältningen av de fångade proteinerna och analys av de resulterande peptiderna av LC-MS/MS22. Här visar vi hur acyl-RAC kan användas för samtidig detektion av S-acylation av flera proteiner i både en cellinje och ett vävnadsprov.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

Protein S-acylation, även kallad S-palmitoylering, är en reversibel post-translationell modifiering av cysteinrester med långkedjiga fettsyror via en labile tiooter bindning. S-acylation, som håller på att växa fram som en utbredd regleringsmekanism, kan modulera nästan alla aspekter av proteinernas biologiska aktivitet, från komplex bildning till proteinhandel och proteinstabilitet. Den senaste tidens framsteg i förståelsen av proteinets biologiska funktion S-acylation uppnåddes till stor del på grund av utvecklingen av nya biokemiska verktyg som möjliggör robust och känslig detektion av protein S-acylation i en mängd olika biologiska prover. Här beskriver vi acyl harts-assisted capture (Acyl-RAC), en nyligen utvecklad metod baserad på selektiv fångst av endogent S-acylated proteiner av tiool-reaktiva Sepharose pärlor. Jämfört med befintliga metoder kräver Acyl-RAC färre steg och kan ge mer tillförlitliga resultat i kombination med masspektrometri för identifiering av nya S-acylation mål. En stor begränsning i denna teknik är bristen på förmåga att diskriminera mellan fettsyra arter knutna till cysteiner via samma tiode bond.

Efter protokollet som beskrivs ovan använde vi först acyl-RAC för att samtidigt upptäcka S-acylation av flera proteiner i Jurkat-celler, en förevigad T-cellinje som ursprungligen härrör från perifert blod hos en T-cellsleukemipatient27. Regulatory T cell proteiner som tidigare identifierats som S-acylated9,28,29 valdes för att visa nyttan av denna metod. Som visas i figur 2A<...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) är en mycket känslig, tillförlitlig och lätt att utföra metod för att upptäcka reversibel lipidmodifiering av cysteinrester (S-acylation) i en mängd olika biologiska prover.

Detektion av Protein S-Acylation med Acyl-Harts Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-harts assisterad avskiljning eller Acyl-RAC är en känslig och tillförlitlig metod som kan användas för att detektera protein S-acylation i en mängd olika biologiska prover. Detta protokoll kringgår några av begränsningarna av metabolisk märkning och radiomärkning, och gör det möjligt att samtidig detektering av S-acylation av flera proteiner. Inte bara levande celler utan även primära vävnader och frysta prover.S-acylation kan reglera en mängd olika cellulära processer såsom proteinhandel, plasmamembraninriktning, signaltransduktion, järntransport och proteinproteininteraktioner. Det är viktigt att använda nyberedd hydroxylaminlösning med noggrant justerat pH-värde för varje experiment för att säkerställa en effektiv och specifik klyvning av thioesterbindningen. Med en demonstration av denna metod är det viktigt för steg som kloroform, metanol nederbörd.Pannkaksformen pellet som erhålls under detta steg bör hanteras mycket noggrant. Det kan vara ömtåligt och partiell förlust av provet under steget kan leda till ojämn provåterhämtning. Visar förfarandet kommer att Savannah West, en doktorand från vårt laboratorium.För att erhålla cell lysates, samla in de celler av intresse i en konisk centrifug röret. Och ta bort alla cellskräp genom centrifugeringen. Tvätta pelleten i 5 milliliter PBS.Och omedelbart resuspend cellerna i 600 mikroliter av nyberedd lysbuffert. Agitera provet vid 1, 500 varv per minut i en termoskaker i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Innan lysaterna klarnar, pellettvättmedel och lösligt material genom centrifugering.I slutet av centrifugering, samla den rensade lysate i en förkyld 1,5 milliliter mikrocentrifugrör på is. Och utföra en Bradford eller bicinchoninsyra analys för att uppskatta proteinkoncentrationen enligt standardprotokoll. Tillsätt metanol och kloroform till lysate vid förhållandet 2:1.Skaka noggrant för att skapa en homogen suspension och centrifugera provet för att samla en proteinpellet vid gränssnittet mellan de vattenhaltiga och organiska faserna. Luta röret, använd en nål eller en gel lastspets för att aspirera så mycket lösningsmedel som möjligt. Lufttorka proteinpelleten i några minuter.Innan försiktigt blanda röret innehållet med 600 mikroliter metanol, var noga med att inte bryta upp pelleten. Efter att försiktigt ha tagit bort metanoltvätten torkar du proteinpelleten på en bänkskiva i cirka fem minuter. Därefter återanvänder proteinpelleten i 200 mikroliter av 2SHB-buffert.Och virvel på 42 grader Celsius och 1, 500 varv per minut i en termo shaker. När pelleten är upplöst, tillsätt 200 mikroliter på 0,2%MMTS i 2SHB till provet. Och inkubera proteinet i 15 minuter vid 42 grader Celsius och 1, 500 varv per minut i en termoskak.Vid slutet av inkubationen, utför 3:4 kloroform-metanol precipitations som visats. För att avlägsna MMTS: t, lös pelleten i 100 mikroliter av färsk 2SHB buffert med vortexing. Och späd provet med 300 mikroliter av buffert A efter varje nederbörd.Efter den slutliga utfällningen löses proverna i 200 mikroliter av 2SHB-buffert och späds ut med 240 mikroliter buffert A.Mät proteinkoncentrationen igen och ställ undan en 40 mikroliter från varje prov som ingångskontroller. Dela upp proverna i två lika stora volymer på 200 mikroliter. Och markera rören som plus hydroxylamin och minus hydroxylamin.Tillsätt 50 mikroliter av nyberedda neutrala två molarhydroxylamin till en slutkoncentration på 400 millimolar till plus hydroxylaminröret. Och 50 mikroliter av neutral två molar natriumklorid till den negativa kontrollen, ett minus hydroxylaminrör. Tillsätt sedan 30 mikroliter av TS pärla slurry till varje rör.Och rotera rören i en till två timmar i rumstemperatur. I slutet av inkubationen tvätta pärlorna fyra gånger med 1%SDS i buffert A för att avlägsna eventuella kvarvarande hydroxylamin. Efter den sista tvätten, tvätta alla pärla prover med tre milda en minut mikrocentrifugeringar.Aspirera försiktigt supernatanterna och resuspending pärlorna i 500 mikroliter av 1% SDS i buffert A vid varje tvätt. Efter den sista tvätten snurrar du försiktigt ner pärlorna som visats. Och aspirera så mycket supernatant som möjligt utan att störa pärlorna.För att återvinna proteinerna från pärlorna, tillsätt 50 mikroliter av 4%SDS provbuffert till varje rör och inkubera proverna på 80 grader Celsius och 1, 500 varv per minut i 15 minuter i en termoskakare. I slutet av inkubationen, låt proverna svalna före centrifugering till att helt pelleta pärlorna. Använd sedan en gel lastning spets för att överföra eluted proteiner i nya 1,5 milliliter rör.Och kör proverna på en SDS-PAGE gel för att analysera S-acylation av proteiner av intresse av västra blotting. Tyrosinkinas Lck kan detekteras i lysater som behandlats med neutral två molarhydroxylamin. att klyva thioesterbindningen mellan cysteinrester och fettsyramoiety.Strippning och reprobing med antikroppar mot proteiner Fyn och LAT visar att acyl-harts assisterad fånga analys kan användas för att analysera S-acylation av flera proteiner samtidigt. Dessutom kan S-acylation av Lck, Fyn, och LAT lätt detekteras i primära mus splenocytes. Som anger att denna modifiering bevaras mellan två arter.Förutom identifiering av nya S-acylated proteiner, denna metod kan också användas för att bedöma förändringar i protein S-acylation under olika biologiska förhållanden. Antalet nyligen identifierade S-acylated proteiner har ökat enormt efter den dubbla upp innebar en snabb, och tillförlitlig teknik som Acyl-RAC. Förutom identifiering av nya S-acylated proteiner, denna metod kan också användas för att bedöma förändringar i protein S-acylation under olika biologiska förhållanden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detektion och visualisering av DNA-skada-inducerad proteinkomplex i suspensionscellkulturer med användning av Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA-interaktomfångst från plant protoplaster

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontell gelelektrofores för förbättrad detektion av protein-RNA-komplex

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisande av Heterodimerization av Protein isoformer använder en in Situ närhet Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Studera Protein Import till kloroplaster som använder Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fånga och identifiering av RNA-bindande proteiner med hjälp av klick kemi-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...