Name: detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Bu çalışma 5R01GM115446 ve 1R01GM130840 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Bu protokolde kullanılan fareler NIH kurallarına göre ötenazi yedirildi. Houston Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Hayvan Refahı Komitesi tüm hayvan çalışmaları onayladı.
1. Hücre lisatlarının hazırlanması
<ol><li>Tablo 1'deaçıklandığı gibi lysis arabelleği hazırlayın. 10 mL PBS'ye 0,1 g n-dodeyl β-D-maltoside deterjan (DDM) ekleyin ve çözülecek şekilde döndürün. 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyl 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM...

<ol>
	<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li><li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells.">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li><li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage.">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li><li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina,+heart,+and+liver.">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li><li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin.">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li><li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets.">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li><li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets.">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li><li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes.">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pfl&#252;gers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).</li><li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+palmitoylation,+raft+localization,+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids.">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li><li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck.">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li><li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwissPalm:+Protein+Palmitoylation+database.">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4, 1-23 (2015).</li><li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+[3H]palmitic+acid.">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li><li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+are+IntechOpen+,+the+world's+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists.">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li><li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation.">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li><li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells.">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li><li>Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lipidome:+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins.">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li><li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue.">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li><li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters.">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li><li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast.">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li><li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture.">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications.">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li><li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+protein+S-acylation:+spotlight+on+structure,+mechanisms,+and+dynamics.">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li><li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods.">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes.">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+"null"+and+"T"+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling.">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li><li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells.">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li><li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins.">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li><li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+(PAG),+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein,+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation.">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li><li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling.">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li><li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization.">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li><li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+(LYPLA1)+and+lysophospholipase+2+(LYPLA2).">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li><li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling.">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis.">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li></ol>

Burada, hem kültürlü insan hücrelerinde hem de fare dokusundan elde edilen birincil hücrelerde seçilen proteinlerin S-aylayasyonunu tespit etmek için asil-RAC analizini başarıyla kullandık. Bu yöntem basit, duyarlı ve standart biyokimya teknikleri kullanılarak minimum ekipman gereksinimleri ile kolayca yapılabilir. Bu yöntem, protein translokasyon sisteminin β-subunit (Sec61b), ribozomal protein S11 (Rps11) ve mikrozomal glutatyon-S-transferaz 3 (MGST3)22gibi yeni S-acylat...

S-acylation bir labile tiyoesterbağı1 ile bir hedef protein üzerinde bir iç sistein kalıntısı bir yağlı asil zincir eklenmesi içeren bir geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyondur. İlk olarak palmitat ile proteinlerin bir değişiklik olarak bildirilmiştir, doymuş 16-karbon yağ asidi2, ve bu nedenle bu değişiklik genellikle S-palmitoylation olarak adlandırılır. Palmitat ek olarak, proteinler geri daha uzun ve kısa doymuş çeşitli tarafından değiştirilebilir (myristate ve stearate), tekli doymamış (oleat) ve çoklu doymamış (arachidonate ve eikosapentanoat) yağ asitleri3,4,5,6,7. Ökaryotik hücrelerde, S-aylasyon DHHC protein ayltransferazlar olarak bilinen enzimler bir aile tarafından katalize edilir ve sistein deamilasyonu ters reaksiyon protein tiyoesterases tarafından katalize edilir, çoğu hala esrarengiz kalır8.
Tiyoester bağının lability bu lipid modifikasyonu geri dönüşümlü hale getirir, dinamik protein kümelenme düzenleyen izin, plazma membran lokalizasyonu, hücre içi ticareti, protein-protein etkileşimleri ve protein stabilitesi9,10. Sonuç olarak, S-acylation Huntington hastalığı, Alzheimer hastalığı ve kanser çeşitli türleri (prostat, mide, mesane, akciğer, kolorektal) dahil olmak üzere çeşitli bozukluklar ile bağlantılı olmuştur, bu post-çeviriprotein modifikasyonu tespit etmek için güvenilir yöntemlergeliştirilmesini gerektirir11.
Radyoaktif metabolik etiketleme ([3H], [14C] veya [125I]) palmitat, protein S-aylasyonunu saymak için geliştirilen ilk yaklaşımlardan biridir12,13,14. Ancak, radyolabeling tabanlı yöntemler sağlık endişeleri mevcut, çok hassas değildir, zaman alıcı, ve sadece son derece bol proteinlerin lipidasyon tespit15. Radiolabeling için daha hızlı ve radyoaktif olmayan bir alternatif biyoortogonal yağ asidi probları ile metabolik etiketleme, hangi rutin protein S-acylation dinamikleri hesaplamak için kullanılır16. Bu yöntemde, bir kimyasal muhabir (alkine veya azit grubu) ile bir yağ asidi bir protein ayltransferaz tarafından S-asilat protein içine dahil edilmiştir. Azide-alkyne Huisgen sikloek reaksiyonu (tıklama kimyası) daha sonra bir florofor veya biyotin gibi işlevselleştirilmiş bir grup eklemek için kullanılabilir, Entegre yağ asidi S-acylated protein tespiti için izin17,18,19.
Acyl-biotin değişimi (ABE) doku örnekleri için uygun olmayan gibi metabolik etiketleme eksiklikleri bazı atlar S-acylated proteinlerin yakalanması ve belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan biyokimyasal yöntemlerden biridir15. Bu yöntem, dokular ve dondurulmuş hücre örnekleri20,21dahil olmak üzere biyolojik örnekler, çeşitli s-acilesyon analizi için uygulanabilir. Bu yöntem, nötr hidroksilin ile asil grup ve sistein kalıntısı arasındaki tiyoester bağının selektif bölünmesine dayanır. Serbest tiyol grupları daha sonra bir tiol-reaktif biotin türevi ile yakalanır. Üretilen biyotinylated proteinler daha sonra afinite-streptavidin agarose kullanılarak saflaştırılmış ve immünoblotting tarafından analiz edilir.
Alternatif bir yaklaşım acyl-reçine destekli yakalama denir (Acyl-RAC) daha sonra bir tiyol-reaktif reçine22,,23tarafından serbest sistein doğrudan konjugasyon ile biyotinylation adım yerine tanıtıldı . Bu yöntem, ABE ile karşılaştırıldığında daha az adıma sahiptir ve benzer şekilde çok çeşitli örneklerde protein S-alasyonunun saptanması için kullanılabilir1.
Acyl-RAC 4 ana adımdan oluşur (Şekil 1), 1. Serbest tiyol gruplarının engellenmesi; 2. Nötr hidroksilin ile sistein-asil tiyoester bağıseçici bölünme (HAM) sistein tiyol grupları ortaya çıkarmak için; 3. Bir tiyol-reaktif resin ile lipideli sistein yakalama; 4. Tampon azaltarak elüsyondan sonra S-asitli proteinlerin seçici zenginleşmesi.
Yakalanan proteinler daha sonra immünoblotting veya kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik türler ve dokuların çeşitli sitifom değerlendirmek için tabi analiz edilebilir22,24,25. Bireysel S-aylasyon siteleri de yakalanan proteinlerin tripsin sindirim ve LC-MS/MS22ile ortaya çıkan peptidlerin analizi ile tespit edilebilir. Burada, hem hücre hattında hem de doku örneğinde birden fazla proteinin S-amilasyonunun eşzamanlı olarak saptanmasında nasıl asil-RAC kullanılabileceğini gösteriyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="746">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11836170001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">159417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini tube rotator</td>
			<td>LabForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ML211</td>
			<td>Cayman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonics Quantrex Sonicator</td>
			<td>L &#38; R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein s-acylation using acyl-resin assisted capture

Protein S-aylasyon, ayrıca S-palmitoylation olarak anılacaktır, bir labile tiyoester bağı ile uzun zincirli yağ asitleri ile sistein kalıntıları ters çevrilebilir bir post-çevirici modifikasyonudur. Yaygın bir düzenleyici mekanizma olarak ortaya çıkan S-aylasyonu, kompleks oluşumundan protein ticaretine ve protein stabilitesine kadar proteinlerin biyolojik aktivitesinin neredeyse tüm yönlerini modüle edebilir. Protein S-aylasyonunun biyolojik işlevini anlamada son zamanlarda kaydedilen ilerleme, büyük ölçüde çeşitli biyolojik örneklerde protein S-amilasyonunun sağlam ve hassas bir şekilde algılanmasına olanak sağlayan yeni biyokimyasal aletlerin geliştirilmesi sayesinde gerçekleşetmiştir. Burada, endojen S-acylated proteinlerin tiol-reaktif Sepharose boncuklar tarafından seçici olarak ele geçirilmesine dayanan, son zamanlarda geliştirilen bir yöntem olan acyl reçin destekli yakalamayı (Acyl-RAC) tanımlıyoruz. Mevcut yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, Acyl-RAC daha az adım gerektirir ve yeni S-acylation hedeflerinin belirlenmesi için kütle spektrometresi ile birleştiğinde daha güvenilir sonuçlar verebilir. Bu teknikteki önemli bir sınırlama, aynı tiyoester bağı ile sisteinlara bağlı yağ asidi türleri arasında ayrım yapma becerisinin olmamasıdır.

Yukarıda açıklanan protokolü takiben, ilk olarak jurkat hücrelerinde çeşitli proteinlerin S-aylayasyon tespit etmek için ilk acyl-RAC kullanılan, bir ölümsüzleştirilmiş T hücre hattı aslında bir T hücreli lösemi hastasının periferik kan türetilmiştir27. Düzenleyici T hücre proteinleri daha önce S-acylatedolaraktanımlanan 9,28,29 bu yöntemin yarar göstermek için seçildi. <str...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture at JoVE.com

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-RAC (Acyl-Reçin Destekli Yakalama), çeşitli biyolojik örneklerde sistein kalıntılarının (S-aylasyon) geri dönüşümlü lipid modifikasyonunu tespit etmek için son derece hassas, güvenilir ve kolay bir yöntemdir.

Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-reçin destekli yakalama veya Acyl-RAC biyolojik örneklerin çeşitli protein S-acylation tespit etmek için kullanılabilecek hassas ve güvenilir bir yöntemdir. Bu protokol, metabolik etiketleme ve radyo etiketlemenin bazı sınırlamalarını atlar ve birden fazla proteinin S-alasyonunun eşzamanlı olarak algılanmasını sağlar. Sadece canlı hücreler değil, aynı zamanda birincil dokular ve dondurulmuş örnekler.S-aylasyon protein ticareti, plazma membran hedefleme, sinyal transdüksiyonu, demir taşıma ve protein-protein etkileşimleri gibi çeşitli hücresel süreçleri düzenleyebilir. Tiyoester bağının verimli ve spesifik bir dekoltesini sağlamak için her deney için özenle ayarlanmış pH ile taze hazırlanmış hidroksilin çözeltisi kullanmak önemlidir. Bu yöntemin bir gösteri ile kloroform, metanol yağış gibi adımlar için kritik.Bu adımda elde edilen gözleme şekli pelet çok dikkatli kullanılmalıdır. Bu kırılgan olabilir ve adım sırasında numunenin kısmi kaybı düzensiz numune kurtarma yol açabilir. Prosedürü gösteren Savannah West, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.Hücre lysates elde etmek için, konik bir santrifüj tüp içine ilgi hücreleri toplamak. Ve santrifüj ile herhangi bir hücre enkaz kaldırın. PBS 5 mililitre pelet yıkayın.Ve hemen taze hazırlanmış lysis tampon 600 mikrolitre hücreleri askıya. Numuneyi dakikada 1,500 devirde bir termo shaker'da 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede çalkalayın. Lysates, pelet deterjan ve çözünür malzeme yi temizlemeden önce santrifüj ile.Santrifüj sonunda, önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik mikrocentrifuge tüp buz üzerinde temizlenmiş lysate toplamak. Ve standart protokollere göre protein konsantrasyonu tahmin etmek için bir Bradford veya bicinchoninic asit test gerçekleştirin. 2:1 oranında lysate metanol ve kloroform ekleyin.Homojen bir süspansiyon oluşturmak için titizlikle çalkalayın ve sulu ve organik evreler arasındaki arabirimde bir protein peleti toplamak için numuneyi santrifüj edin. Tüpü yatırarak, mümkün olduğunca çok çözücü aspire etmek için bir iğne veya jel yükleme ucu kullanın. Protein peletini hava birkaç dakika kurutun.Yavaşça metanol 600 mikrolitre ile tüp içeriğini karıştırmadan önce, pelet kırmak için değil dikkat. Dikkatle metanol yıkama çıkardıktan sonra, yaklaşık beş dakika boyunca bir tezgah üst üzerinde protein pelet kuru. Daha sonra, 2SHB tampon 200 mikrolitre protein pelet resuspend.Ve 42 santigrat derece ve bir termo shaker dakikada 1,500 devrimler girdap. Pelet çözündüğünde, numuneye 2SHB'de %0,2 MMTS'lik 200 mikrolitre ekleyin. Ve proteini 42 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yaslayın ve termoshake'de dakikada 1,500 devir.Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi 3:4 kloroform-metanol yağışları gerçekleştirin. MMTS'yi çıkarmak için peleti 100 mikrolitre taze 2SHB tamponu girdapla eritin. Ve her yağıştan sonra 300 mikrolitre tampon A ile numuneyi seyreltin.Son yağıştan sonra, numuneleri 2SHB tamponunun 200 mikrolitresinde çözün ve 240 mikrolitre tampon a.Measure ile seyreltin ve her numuneden giriş kontrolleri olarak 40 mikrolitre ayırın. Örnekleri 200 mikrolitrelik iki eşit hacime bölün. Tüpleri artı hidroksilin ve eksi hidroksilin olarak işaretleyin.Artı hidroksilin tüpüne 400 milimolar son konsantrasyonuna taze hazırlanmış nötr iki molar hidroksilin 50 mikrolitre ekleyin. Ve negatif kontrole nötr iki azılı sodyum klorür 50 mikrolitre, eksi hidroksilamin tüpü. Sonra her tüp için TS boncuk bulamaç 30 mikrolitre ekleyin.Ve tüpleri oda sıcaklığında 1-2 saat döndürün. Kuluçka sonunda herhangi bir artık hidroksilin kaldırmak için tampon A% 1 SDS ile boncuk dört kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, tüm boncuk örneklerini üç nazik bir dakikalık mikrosantrifüjlerle yıkayın.Supernatants dikkatle spirating ve her yıkamada tampon A% 1 SDS 500 mikrolitre boncuk resucan. Son yıkamadan sonra, yavaşça gösterildiği gibi boncuk aşağı spin. Ve boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok süpernatant aspire edin.Boncuklardan proteinleri kurtarmak için, her tüpe %4 SDS numune tamponunun 50 mikrolitresini ekleyin ve numuneleri termo shaker'da 15 dakika boyunca dakikada 80 santigrat derece ve 1,500 devirde kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, tamamen boncuk pelet için santrifüj önce örnekleri soğumaya bırakın. Daha sonra yeni 1.5 mililitretüpler içine eluted proteinleri aktarmak için bir jel yükleme ucu kullanın.Ve örnekleri Bir SDS-PAGE jelüzerinde çalıştırın batı lekeleme tarafından ilgi proteinlerin S-acylation analiz etmek. Tirozin kinaz Lck nötr iki molar hidroksilin ile tedavi lizatlarda saptayabilir. sistein kalıntıları ve yağ asidi moiety arasındaki tiyoester bağı cleave.Soyunma ve proteinlere karşı antikorlar ile reprobing asil-rezorin destekli yakalama test aynı anda birden fazla protein S-aylation analiz etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, Lck, Fyn ve LAT S-acylation kolayca birincil fare splenositler tespit edilebilir. Bu modifikasyonun iki tür arasında korunduğuna işaret ediyor.Yeni S-asilated proteinlerin tanımlanmasına ek olarak, bu yöntem farklı biyolojik koşullar altında protein S-acilesyon değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir. Yeni tanımlanan S-acylated proteinlerin sayısı çift kadar acyl-RAC gibi hızlı ve güvenilir bir teknik anlamına geliyordu sonra muazzam artmıştır. Yeni S-asilated proteinlerin tanımlanmasına ek olarak, bu yöntem farklı biyolojik koşullar altında protein S-acilesyon değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...