Name: acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins at JoVE.com

المؤلفين أشكر ك. Woolfrey للحصول على المشورة والمدخلات على APEGS اقولها. تم تمويل هذه الدراسات من خلال منح بحثية لـ E.D. من مؤسسة وايتهول وNIH-NIMH (1R01MH119347).

اتبعت جميع الإجراءات الحيوانية المبادئ التوجيهية التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا، ديفيس.
1. إعداد أغشية الدماغ الماوس
<ol><li>قطع رأس الماوس باستخدام جهاز المقصلة وتشريح الدماغ...

<ol>
	<li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins?.">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?.</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li><li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections.">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li><li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners.">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li><li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG1:+an+activity-regulated,+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development.">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li><li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability,+Localization,+and+Function.">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li><li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+proteins:+purification+and+identification.">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li><li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+(APEGS)+Assay.">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li><li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation.">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li><li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes.">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+The+Western+Blot.">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo.">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG4/Prrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function.">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li><li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP.">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li><li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79/150.">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li></ol>

في عملنا السابق، استعملنا في ABE للتثبت من أن SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من المخلفات السّيّز ة التجاور المُحافظ عليها (الموجودة في جميع بروتينات SynDIG) بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار، التوطين، والوظيفة6. وهناك قيد هو أن مقافي ABE يتطلب تنقية تقارب مع راتنجات agarose مترافقة مع ?...

S-palmitoylation هو تعديل عكسها بعد الترجمة من البروتينات المستهدفة التي تنظم الارتباط غشاء مستقر، والاتجار البروتين، والتفاعلات البروتين والبروتين1. وهو ينطوي على إضافة البالميتات 16 الكربون moiety إلى بقايا السيستين عبر ربط ثيويستر حفز هاميسمنس البالميتوسيل acyltransferase (بات) الإنزيمات. العديد من البروتينات متشابك في الدماغ هي palmitoylated، بما في ذلك AMPA-Rs و PSD-95، بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار، والتعريب، وظيفة2،3،4. التعديلات في مستويات AMPARs متشابك في PSD عن طريق التفاعل بين العوامل المساعدة مع السقالات متشابك مثل PSD-95 يكمن اللدونة متشابك; وبالتالي ، فإن طرق تحديد حالة palmitoylation من البروتينات متشابك يوفر نظرة ثاقبة هامة في آليات اللدونة متشابك.
في السابق ، حددنا عائلة SynDIG من أربعة جينات (SynDIG1-4) ترميز البروتينات عبر الغشاء الدماغي المحددة التي ترتبط مع AMPARs5. الإفراط في التعبير أو ضرب أسفل SynDIG1 في الخلايا العصبية فرس النهر الفئران المنفصلة يزيد أو يقلل، على التوالي، AMPA-R حجم الاشتباك العصبي وعدد من قبل ~ 50٪ كما تم الكشف عنها باستخدام الكيمياء المناعية والفيزيولوجيا الكهربائية5. لقد استعينا في تبادل acyl-biotin (ABE) للتثبت من أن SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من بقايا Cys التجاور يُحفظ (الموجودة في جميع بروتينات SynDIG) بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار والتوطين والوظيفة6. يعتمد ازى ABE على تبادل البيوتين على السيستين اتى محمية بالتعديل وتنقية التقارب اللاحقة7. هنا، ونحن نصف نهج البيوكيميائية مبتكرة، وacyl-PEGyl تحويلهلام تبادل (APEGS) كمية88،9،,10،,11،,12،والتي لا تتطلب تنقية تقارب وبدلا من ذلك يستخدم التغييرات في التنقل هلام لتحديد عدد من التعديلات لبروتين الفائدة. يوصف البروتوكول للتحقيق في بروتينات الأغشية الذاتية من دماغ الماوس التي تتوفر لها أجسام مضادة مناسبة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td>
			<td>NOF</td>
			<td>ME-050MA</td>
			<td>MW ~5000 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmalemide (NEM)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>34115</td>
			<td>Highly toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical imager for densitometry</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Sapphire Biomolecular Imager</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (glass)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>580560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins

ويعتقد أن التعديلات التي تعتمد على النشاط في مستويات مستقبلات AMPA متشابك (AMPARs) داخل كثافة postynaptic (PSD) تمثل آلية خلوية للتعلم والذاكرة. البمنية ينظم توطين وظيفة العديد من البروتينات متشابك بما في ذلك AMPA-Rs, العوامل المساعدة وسقالات متشابك بطريقة تعتمد على النشاط. حددنا التمايز المتسبب في المشبك (SynDIG) الأسرة من أربعة جينات (SynDIG1-4) ترميز البروتينات عبر الغشاء الدماغ محددة التي ترتبط مع AMPARs وتنظيم قوة المشبك. SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من بقايا السيستين تقع في موقفين 191 و 192 في منطقة التجاور عبر الغشاء المهم لتطوير المشبك مثير يعتمد على النشاط. هنا، ونحن نصف نهج بيوكيميائية مبتكرة، وacyl-PEGyl تحويل هلام تبادل (APEGS) فحص، للتحقيق في حالة palmitoylation من أي بروتين الفائدة وإظهار فائدتها مع عائلة SynDIG من البروتينات في تحلل الدماغ الماوس.

Immunoblotting مع الأجسام المضادة ضد البروتين من الفائدة يكشف عن حالة palmitoylated (غير ، singly ، doublly ، الخ) في تحليل الدماغ الماوس كما يحددها تحول التنقل مقارنة مع العينات التي لم يتم تضمين HAM. سابقا، كنا قد أظهرت أن SynDIG1 كان palmitoylated في موقعين باستخدام ABE اساي6. ومع ذلك، لم نت?...

Watch this Scientific Journal Video about Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins at JoVE.com

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

البالميتويلية ينطوي على دمج البالميتات 16 الكربون moiety لمخلفات السيستين من البروتينات المستهدفة بطريقة قابلة للعكس. هنا، ونحن نصف نهج بيوكيميائية، وacyl-PEGyl تحويل هلام تبادل (APEGS) فحص، للتحقيق في حالة palmitoylation من أي بروتين من الفائدة في تحلل الدماغ الماوس.

Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

تسمح هذه الطريقة الكيميائية الحيوية لتحديد حالة الغشاء أي بروتين غشاء أعرب عنه في الدماغ الذي يتوفر له جسم مضاد مناسب. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب تنقية تقارب وبدلا من ذلك يستخدم التغييرات في تنقل هلام لتحديد عدد التعديلات من البروتين من الفائدة. بعد تشريح الدماغ ، التجانس على الفور في 10 ملليلتر من العازلة التجانس في التجانس الزجاج على الجليد.باستخدام ما يقرب من 12 السكتات الدماغية، والطرد المركزي lysates لمدة 15 دقيقة في 1400 مرة G، وأربع درجات مئوية. نقل المُنَتَكّل إلى أنبوب جديد على الجليد. إعادة بناء بيليه في 10 ملليلتر من العازلة التجانس.التجانس عليه باستخدام ما يقرب من ستة السكتات الدماغية. الطرد المركزي تعليق في 710 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. الجمع بين عظمى والطرد المركزي لهم في 40،000 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.تجاهل supernatant وإعادة فرض جزء الغشاء بيليه في عازلة التجانس عن طريق كسر بيليه مع طرف ماصة و pipetting صعودا وهبوطا. إجراء فحص ABCA إلى كمية مستويات البروتين. لأداء مقايسة APEGS، ضع 470 ميكرولترات من المخزن المؤقت A في أنبوب 1.5 ملليلتر وأضف ما يقرب من 100 إلى 200 ملليغرام من البروتين.سونيكات الأنبوب ومن ثم فصل البروتين غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي للأنبوب في 25 درجة مئوية والحد الأدنى من 13،000 مرات G لمدة 10 دقائق. نقل البروتين solubalized إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. أولاً، تعطيل روابط التخليد عن طريق احتضان البروتين المُزَوَّل في 25 ميكرولترات من TCEP لمدة 60 دقيقة عند 55 درجة مئوية.ثم، كتلة cysteines الحرة عن طريق احتضان الحل مع 12.5 ميكرولترات من محلول الأسهم من NEM لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. المقبل، تبدأ عملية هطول الأمطار الميثانول الكلوروفورم. نقل محلول البروتين من أنبوب 1.5 ملليلتر إلى أنبوب بولي بروبلين أو زجاج التي يمكن أن تكون طردية في دوار دلو يتأرجح بسرعة متواضعة.إضافة مليلترين من الميثانول ودوة قصيرة. إضافة ملليلتر واحد من الكلوروفورم ودوامة لفترة وجيزة. ثم إضافة 1.5 ملليلتر من المياه الأيونة ودوامة لفترة وجيزة مرة أخرى.إذا لزم الأمر، عكس أنبوب لضمان خلط دقيق. أجهزة الطرد المركزي العينات في 3000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الدوار دلو يتأرجح. إزالة بعناية وتجاهل المرحلة العليا من الحل في أنبوب.إضافة 1.5 ملليلتر من الميثانول. مزيج بلطف ولكن بدقة عن طريق عكس لطيف من الأنبوب، مع الحرص على عدم تجزئة فطيرة البروتين مبهمة. الطرد المركزي العينة في 3000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في الدوار دلو يتأرجح.باستخدام ماصة المصلية الزجاجية، وإزالة أكبر قدر من المرحلة العليا من الحل ممكن دون إزعاج فطيرة البروتين. شطف بعناية بيليه مع ملليلتر واحد من الميثانول والسماح لها للهواء الجاف لمدة 10 دقائق على الأقل. مع هطول الأمطار الكلوروفورم كاملة، تبدأ انشقاق من وصلات ثيريستر بالمتيل من خلال resuspending البروتين يترسب في 125 ميكرولترات من المخزن المؤقت A.Transfer إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر.سونيكات أنبوب لفترة وجيزة ومن ثم الطرد المركزي في 13، 000 مرات G أو أعلى و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة المواد غير قابلة للذوبان. نقل البروتين solubalized إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر وإضافة 375 ميكرولترات من H العازلة أو العازلة T.After احتضان العينات لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتكرار هطول الأمطار الميثانول الكلوروفورم. لإضافة m-PEG إلى cysteines غير المحمية، تبدأ من خلال إعادة بناء بيليه في 100 ميكرولترات من العازلة A التي تحتوي على 10 مل أو أكثر TCEP.ثم نقل التعليق إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة 25 ميكروليتر من الأسهم m-PEG 5K الحل ومزيج عن طريق الأنابيب. احتضان في درجة حرارة الغرفة مع نهاية على نهاية التناوب.بعد 60 دقيقة من الحضانة، وإزالة غير مدمج m-PEG 5K عن طريق أداء الأمطار الميثانول الكلوروفورم مرة أخرى. أجهزة الطرد المركزي في أكثر من 13،000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة بعناية المرحلة العليا كما كان من قبل، وتجنب سميكة، فطيرة flocculent.إضافة ملليلتر واحد من الميثانول ويخلط بلطف ولكن بدقة. أجهزة الطرد المركزي في أكثر من 13،000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة بعناية طفح وشطف بيليه مع ملليلتر واحد من الميثانول.مرة أخرى، أجهزة الطرد المركزي في أكثر من 13،000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تجفيف الهواء بيليه، resuspend في 50 ميكرولترات من العازلة A دون TCEP أو أي وكيل الحد. احتياطي 5 ميكرولترات من الحل لكمية البروتين BCA.بعد الكمية، إضافة كمية مناسبة من 4x Laemmli عينة المخزن المؤقت. قم بتحميل العينة على هلام صفحة SDS. استخدام معيار فصل نقل وكشف بروتوكولات لنشاف الغربية.للتحقيق في حالة النخيل من بروتينات SynDIG، تعرضت كسور غشاء P2 من أدمغة الماوس المتجانسة لمقايسة APEGS. الفصل والتسبر مع الأجسام المضادة أظهرت أن SynDIG1، SynDIG4 Prrt1، وPrrt2 هي palmitoylated في الدماغ الماوس. والغرض من ترسيب الميثانول الكلوروفورم هو منع مادة كيميائية واحدة، مثل النُهُو، من التدخل في الخطوة التالية من البروتوكول.وترسب الميثانول الكلوروفورم السليم يزيل المواد الكيميائية غير المرغوب فيها مع تقليل فقدان البروتين. يمكن تطبيق هذه الطريقة على lysates الدماغ من الفئران من مختلف الأعمار أو من مناطق الدماغ المختلفة للتحقيق في اللوائح المكانية والزمانية من palmitoylation.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

استخدام البروتينات الانصهار المؤتلف في منصة فحص حوزتي فلورسنت وما ريناتوريشن في جل

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support