Name: acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins at JoVE.com

De auteurs danken K. Woolfrey voor advies en input op de APEGS-test. Deze studies werden gefinancierd door onderzoekssubsidies aan E.D. van de Whitehall Foundation en de NIH-NIMH (1R01MH119347).

Alle dierlijke procedures gevolgd richtlijnen uiteengezet door de National Institutes of Health (NIH) en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Californië, Davis.
1. Voorbereiding van muishersenmembranen
<ol><li>Onthoofd de muis met behulp van een guillotine-apparaat en ontleed de hersenen snel (in <1 min, indien mogelijk, om palmitoylation veranderingen die kunnen optreden tijdens dissectie procedure te minimaliseren). Homogeniseer onmi...

<ol>
	<li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins?.">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?.</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li><li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections.">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li><li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners.">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li><li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG1:+an+activity-regulated,+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development.">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li><li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability,+Localization,+and+Function.">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li><li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+proteins:+purification+and+identification.">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li><li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+(APEGS)+Assay.">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li><li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation.">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li><li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes.">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+The+Western+Blot.">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo.">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG4/Prrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function.">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li><li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP.">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li><li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79/150.">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li></ol>

In ons vorige werk gebruikten we de ABE-test om aan te tonen dat SynDIG1 palmitoylated is op twee geconserveerde nevenprovliecys-residuen (gevonden in alle SynDIG-eiwitten) op een activiteitsafhankelijke manier om stabiliteit, lokalisatie en functie te reguleren6. Een beperking is dat de ABE-test affiniteitszuivering vereist met agaroseharsen die tot avidin moieties worden vervoegd als de laatste stap in de procedure, wat resulteert in een aanzienlijk verlies van signaal dat kwantitatieve analyse ...

S-palmitoylation is een omkeerbare post-translationele modificatie van doeleiwitten die stabiele membraanassociatie, eiwithandel en eiwit-eiwitinteracties reguleert1. Het gaat om toevoeging van een 16-koolstof palmitaat moiety aan cysteïne residuen via thioester linkage gekatalyseerd door palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymen. Veel synaptische eiwitten in de hersenen zijn palmitoylated, met inbegrip van AMPA-R's en PSD-95, op een activiteit-afhankelijke manier om stabiliteit, lokalisatie, en functie2te reguleren,3,4. Veranderingen in de niveaus van synaptische AMPARs in de PSD via interactie van hulpfactoren met synaptische steigers zoals PSD-95 liggen ten grondslag aan synaptische plasticiteit; methoden om de palmitoylation-toestand van synaptische eiwitten te bepalen, bieden dus belangrijk inzicht in mechanismen van synaptische plasticiteit.
Eerder identificeerden we de SynDIG-familie van vier genen (SynDIG1-4) die hersenspecifieke transmembraaneiwitten coderen die associëren met AMPARs5. Overexpressie of knock-down van SynDIG1 in gescheiden rat hippocampal neuronen neemt toe of vermindert, respectievelijk, AMPA-R synapsgrootte en aantal met ~ 50% zoals gedetecteerd met behulp van immunocytochemie en elektrofysiologie5. We gebruikten de acyl-biotine uitwisseling (ABE) test om aan te tonen dat SynDIG1 is palmitoylated op twee geconserveerde nevennoa-transmembraan Cys residuen (gevonden in alle SynDIG eiwitten) op een activiteit-afhankelijke manier om stabiliteit te reguleren, lokalisatie, en functie6. De ABE-test is gebaseerd op de uitwisseling van biotine op cysteïnen beschermd door modificatie en daaropvolgende affiniteitzuivering7. Hier beschrijven we een innovatieve biochemische aanpak, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test8,9,10,11,12, die geen affiniteit zuivering vereist en in plaats daarvan maakt gebruik van veranderingen in gel mobiliteit om het aantal wijzigingen voor een eiwit van belang te bepalen. Het protocol wordt beschreven voor onderzoek naar endogene membraaneiwitten uit muizenhersenen waarvoor geschikte antilichamen beschikbaar zijn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td>
			<td>NOF</td>
			<td>ME-050MA</td>
			<td>MW ~5000 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmalemide (NEM)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>34115</td>
			<td>Highly toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical imager for densitometry</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Sapphire Biomolecular Imager</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (glass)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>580560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins

Activiteitsafhankelijke veranderingen in de niveaus van synaptische AMPA-receptoren (AMPARs) binnen de postsynaptische dichtheid (PSD) wordt beschouwd als een cellulair mechanisme voor leren en geheugen. Palmitoylation regelt lokalisatie en functie van vele synaptische eiwitten, waaronder AMPA-R's, hulpfactoren en synaptische steigers op een activiteitsafhankelijke manier. We identificeerden de synapsdifferentiatie geïnduceerde gen (SynDIG) familie van vier genen (SynDIG1-4) die hersenspecifieke transmembraaneiwitten coderen die associëren met AMPARs en synapssterkte reguleren. SynDIG1 is palmitoylated bij twee cysteïneresiduen die zich op posities 191 en 192 in het nevenxta-transmembraangebied bevinden dat belangrijk is voor activiteitsafhankelijke excitatory synapsenontwikkeling. Hier beschrijven we een innovatieve biochemische benadering, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test, om de palmitoylation toestand van elk eiwit van belang te onderzoeken en het nut ervan aan te tonen met de SynDIG familie van eiwitten in muis hersenen lysaten.

Immunoblotting met antilichamen tegen het eiwit van belang onthult de palmitoylated staat (niet, afzonderlijk, dubbel, enz.) in muis hersenen lysaten zoals bepaald door mobiliteit verschuiving in vergelijking met monsters waarin HAM niet was opgenomen. Eerder hadden we aangetoond dat SynDIG1 was palmitoylated op twee locaties met behulp van de ABE test6; we konden echter niet bepalen of beide sites werden gewijzigd in hersenweefsel. Hier laten we zien dat SynDIG1, ...

Watch this Scientific Journal Video about Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins at JoVE.com

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Palmitoylation houdt de integratie in van een 16-koolstof palmitaat moiety aan cysteïneresiduen van doelproteïnen op een omkeerbare manier. Hier beschrijven we een biochemische benadering, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test, om de palmitoylation toestand van een eiwit van belang in muis hersenen lysaten te onderzoeken.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay voor kwantitatieve bepaling van palmitoylation van Brain Membrane Eiwitten

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Deze biochemische methode maakt het mogelijk om de palmitoylation-toestand te bepalen van elk membraaneiwit uitgedrukt in de hersenen waarvoor een geschikt antilichaam beschikbaar is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het geen affiniteitszuivering vereist en in plaats daarvan veranderingen in gelmobiliteit gebruikt om het aantal wijzigingen van een eiwit van belang te bepalen. Na het ontleden van de hersenen, homogeniseren het onmiddellijk in 10 milliliter van homogeneisatie buffer in een glas homogenisator op ijs.Met behulp van ongeveer 12 slagen, centrifuge de lysates gedurende 15 minuten op 1400 keer G, en vier graden Celsius. Breng de supernatant naar een nieuwe buis op ijs. Resuspend de pellet in 10 milliliter van homogeneisatie buffer.Homogeniseren met ongeveer zes slagen. Centrifuge de suspensie op 710 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Combineer de supernatants en centrifuge ze op 40,000 keer G en vier graden Celsius gedurende 20 minuten.Gooi de supernatant weg en zet de gepelde membraanfractie opnieuw op in een homogeneisatiebuffer door de pellet op te breken met een pipetpunt en op en neer te pipetten. Voer ABCA-test uit op kwantitate eiwitniveaus. Om de APEGS-test uit te voeren, plaatst u 470 microliter buffer A in een buis van 1,5 milliliter en voegt u ongeveer 100 tot 200 milligram eiwit toe.Soniceer de buis en scheid vervolgens het onoplosbare eiwit door de buis te centrifugeren bij 25 graden Celsius en minimaal 13.000 keer G gedurende 10 minuten. Breng het gesaneerde eiwit over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Verstoor eerst de disulfidebindingen door het gesaneerde eiwit in 25 microliter van TCEP gedurende 60 minuten bij 55 graden Celsius uit te broeden.Blokkeer vervolgens gratis cysteines door de oplossing uit te broeden met 12,5 microliter van de voorraadoplossing van NEM gedurende drie uur bij kamertemperatuur. Begin vervolgens met het proces van chloroforme methanolneerslag. Breng de eiwitoplossing van de buis van 1,5 milliliter over naar een polypropyleen of glazen buis die met een bescheiden snelheid in een swingende emmerrotor kan worden gecentrifugeerd.Voeg twee milliliter methanol en vortex kort. Voeg een milliliter chloroform en vortex kort. Voeg vervolgens 1,5 milliliter gedeïsized water en vortex kort weer.Keer indien nodig de buis om om een grondige menging te garanderen. Centrifugeren de monsters op 3000 keer G en 25 graden Celsius gedurende 30 minuten in een swingende emmer rotor. Verwijder en gooi de bovenste fase van de oplossing voorzichtig in een buis.Voeg 1,5 milliliter methanol toe. Meng zachtjes maar grondig door zachte omkering van de buis, voorzichtig niet te fragmenteren de ondoorzichtige eiwit pannenkoek. Centrifugeren het monster op 3000 keer G en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten in een swingende emmer rotor.Verwijder met behulp van een glazen serologische pipet zoveel mogelijk van de bovenste fase van de oplossing zonder de eiwitpannenkoek te verstoren. Spoel de pellet voorzichtig af met een milliliter methanol en laat deze minstens 10 minuten aan de lucht drogen. Met de chloroforme methanol neerslag compleet, begin het decolleté van de palmitoyl thioester koppelingen door het eiwit neerlopen in 125 microliter van buffer A.Transfer naar een nieuwe 1,5 milliliter buis.Soniceer de buis kort en centrifugeer het vervolgens op 13, 000 keer G of hoger en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten om onoplosbaar materiaal te verwijderen. Breng het gesaneerde eiwit over op nieuwe buizen van 1,5 milliliter en voeg 375 microliter buffer H of buffer T.Na het uitbroeden van de monsters gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur, herhaal de chloroforme methanolneerslag. Om m-PEG toe te voegen aan onbeschermde cysteines, beginnen met het opnieuw toewijzen van de pellet in 100 microliter van buffer A met 10 mil of meer TCEP.Breng de vering vervolgens over op een buis van 1,5 milliliter. Voeg 25 microliter stock m-PEG 5K oplossing toe en meng door pipetting. Incubeer bij kamertemperatuur met eind over eindrotatie.Na 60 minuten incubatie, verwijder niet-opgenomen m-PEG 5K door het uitvoeren van chloroforme methanol neerslag opnieuw. Centrifuge op meer dan 13,000 keer G en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de bovenste fase zoals voorheen, het vermijden van de dikke, floccullent pannenkoek.Voeg een milliliter methanol toe en meng voorzichtig maar grondig. Centrifuge op meer dan 13,000 keer G en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant en spoel de pellet af met een milliliter methanol.Nogmaals, centrifuge op meer dan 13,000 keer G en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na het drogen van de pellet in de lucht, opnieuw op te stellen in 50 microliter buffer A zonder TCEP of een reducerend middel. Reserveer 5 microliter van de oplossing voor BCA eiwitkwantificering.Voeg na kwantificering een geschikte hoeveelheid 4x Laemmli-monsterbuffer toe. Laad het monster op een SDS-paginagel. Gebruik standaard scheidings- en detectieprotocollen voor westerse blotting.Om de palmitoylation staat van SynDIG eiwitten te onderzoeken, werden P2 membraanfracties van gehomogeniseerde muizenhersenen onderworpen aan de APEGS-test. Scheiding en indringende met antilichamen aangetoond dat SynDIG1, SynDIG4 Prrt1, en Prrt2 zijn palmitoylated in de muis hersenen. Het doel van de chloroforme methanolneerslag is om te voorkomen dat een chemische stof, zoals NEM, de volgende stap van het protocol verstoort.Een goede chloroforme methanolneerslag verwijdert ongewenste chemicaliën terwijl eiwitverlies wordt geminimaliseerd. Deze methode kan worden toegepast op hersenlysates van muizen van verschillende leeftijden of uit verschillende hersengebieden om de ruimtelijke-temporele regelgeving van palmitoylation te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning