Name: acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00
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Die Autoren danken K. Woolfrey für die Beratung und den Input zum APEGS-Assay. Diese Studien wurden durch Forschungsstipendien an E.D. von der Whitehall Foundation und dem NIH-NIMH (1R01MH119347) finanziert.

Alle tierischen Verfahren folgten den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, Davis, genehmigt.
1. Vorbereitung von Maus-Gehirnmembranen
<ol><li>Enthaupten Sie die Maus mit einem Guillotine-Apparat und sezieren Sie das Gehirn schnell (in <1 min, wenn möglich, um Palmitoylierungsänderungen zu minimieren, die während des Sezierens auftreten können). Homogenisieren Sie sofort in 10 ml Homoge...

<ol>
	<li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins?.">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?.</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li><li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections.">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li><li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners.">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li><li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG1:+an+activity-regulated,+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development.">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li><li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability,+Localization,+and+Function.">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li><li>Wan, J., Roth, A. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+proteins:+purification+and+identification.">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li><li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+(APEGS)+Assay.">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li><li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation.">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li><li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes.">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+The+Western+Blot.">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo.">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG4/Prrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function.">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li><li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP.">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li><li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79/150.">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li></ol>

In unserer vorherigen Arbeit haben wir den ABE-Test verwendet, um zu zeigen, dass SynDIG1 bei zwei konservierten Juxta-Transmembran-Cys-Rückständen (in allen SynDIG-Proteinen) in einer aktivitätsabhängigen Weise palmitoyiert wird, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion6zu regulieren. Eine Einschränkung ist, dass der ABE-Test eine Affinitätsreinigung mit Agaroseharzen erfordert, die als letzter Schritt im Verfahren mit Avidin-Moieties konjugiert werden, was zu einem signifikanten Signalve...

S-Palmitoylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation von Zielproteinen, die eine stabile Membranverbindung, Proteinhandel und Protein-Protein-Wechselwirkungen reguliert1. Es beinhaltet die Zugabe einer 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moiety zu Cystein-Rückständen über Thioester-Verbindung, die durch Palmitoyl-Acyltransferase (PAT)-Enzyme katalysiert wird. Viele synaptische Proteine im Gehirn sind palmitoylated, einschließlich AMPA-Rs und PSD-95, in einer aktivitätsabhängigen Weise, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion2,,3,4zu regulieren. Veränderungen der Konzentrationen synaptischer AMPARs in der PSD über die Wechselwirkung von Hilfsfaktoren mit synaptischen Gerüsten wie PSD-95 liegen der synaptischen Plastizität zugrunde; Daher bieten Methoden zur Bestimmung des Palmitoylierungszustands von synaptischen Proteinen wichtige Einblicke in Mechanismen der synaptischen Plastizität.
Zuvor haben wir die SynDIG-Familie von vier Genen (SynDIG1-4) identifiziert, die hirnspezifische Transmembranproteine kodieren, die mit AMPARs5assoziiert werden. Überexpression oder Knock-down von SynDIG1 in dissoziierten Ratten Hippocampus-Neuronen erhöht oder verringert, bzw. AMPA-R Synapse Größe und Zahl um 50%, wie mit Immunzytochemie und Elektrophysiologie nachgewiesen5. Wir nutzten den Acyl-Biotin-Austausch (ABE)-Test, um zu zeigen, dass SynDIG1 bei zwei konservierten Juxta-Transmembran-Cys-Rückständen (in allen SynDIG-Proteinen) in einer aktivitätsabhängigen Weise palmitoylated ist, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion6zu regulieren. Der ABE-Test stützt sich auf den Austausch von Biotin auf Cysteins, die durch Modifikation und anschließende Affinitätsreinigung geschützt sind7. Hier beschreiben wir einen innovativen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS) Assay8,9,10,11,12, der keine Affinitätsreinigung erfordert und stattdessen Änderungen in der Gelmobilität nutzt, um die Anzahl der Modifikationen für ein Protein von Interesse zu bestimmen. Das Protokoll wird für die Untersuchung von endogenen Membranproteinen aus dem Maushirn beschrieben, für die geeignete Antikörper zur Verfügung stehen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td>
			<td>NOF</td>
			<td>ME-050MA</td>
			<td>MW ~5000 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmalemide (NEM)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>34115</td>
			<td>Highly toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical imager for densitometry</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Sapphire Biomolecular Imager</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (glass)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>580560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins

Aktivitätsabhängige Veränderungen in den Konzentrationen von synaptischen AMPA-Rezeptoren (AMPARs) innerhalb der postsynaptischen Dichte (PSD) wird angenommen, um einen zellulären Mechanismus für das Lernen und Gedächtnis darstellen. Die Palmitoylierung reguliert die Lokalisierung und Funktion vieler synaptischer Proteine, einschließlich AMPA-Rs, Hilfsfaktoren und synaptischen Gerüste auf aktivitätsabhängige Weise. Wir identifizierten die Synapsendifferenzierunginduzierte Gen (SynDIG) Familie von vier Genen (SynDIG1-4), die hirnspezifische Transmembranproteine kodieren, die mit AMPARs assoziiert werden und die Synapsenstärke regulieren. SynDIG1 wird bei zwei Cysteinrückständen an den Positionen 191 und 192 in der für die aktivitätsabhängige Exzitatoren-Synapsenentwicklung wichtigen Region der Juxta-Transmembran palmitoyiert. Hier beschreiben wir einen innovativen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay, um den Palmitoylierungszustand eines beliebigen Proteins zu untersuchen und seinen Nutzen mit der SynDIG-Proteinfamilie in Maushirnlysaten zu demonstrieren.

Die Immunoblotting mit Antikörpern gegen das Protein von Interesse zeigt den palmitoylated Zustand (nicht, singly, doppelt, etc.) in Maus Gehirnlysaten, wie durch Mobilitätsverschiebung im Vergleich zu Proben, in denen HAM nicht enthalten war bestimmt. Zuvor hatten wir gezeigt, dass SynDIG1 an zwei Standorten mit dem ABE-Assay6palmitoylated wurde; Wir konnten jedoch nicht feststellen, ob beide Standorte im Hirngewebe verändert wurden. Hier zeigen wir, dass SynDI...

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Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Die Palmitoylierung beinhaltet die Umarbeitung einer 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moiety zu Cysteinrückständen von Zielproteinen in reversibler Weise. Hier beschreiben wir einen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay, um den Palmitoylierungszustand eines Proteins zu untersuchen, das für Maushirnlysate von Interesse ist.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay zur quantitativen Bestimmung der Palmitoylierung von Gehirnmembranproteinen

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Diese biochemische Methode ermöglicht die Bestimmung des Palmitoylationszustands jedes Membranproteins, das im Gehirn exprimiert wird und für das ein geeigneter Antikörper zur Verfügung steht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie keine Affinitätsreinigung erfordert und stattdessen Änderungen in der Gelmobilität nutzt, um die Anzahl der Modifikationen eines Proteins von Interesse zu bestimmen. Nach dem Aussezieren des Gehirns, homogenisieren Sie es sofort in 10 Milliliter Homogenisierungspuffer in einem Glas homogenisator auf Eis.Mit ca. 12 Schlägen zentrifugieren Sie die Lysate 15 Minuten bei 1400 mal G und vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre auf Eis. Das Pellet in 10 Milliliter Homogenisierungspuffer aussetzen.Homogenisieren Sie es mit etwa sechs Strichen. Zentrifugieren Sie die Federung bei 710 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Kombinieren Sie die Überstand und Zentrifuge sie bei 40, 000 mal G und vier Grad Celsius für 20 Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die pelletierte Membranfraktion in einem Homogenisierungspuffer wieder auf, indem Sie das Pellet mit einer Pipettenspitze aufbrechen und nach oben und unten pfeifen. Führen Sie ABCA-Assay durch, um den Proteinspiegel zu quantitieren. Um den APEGS-Test durchzuführen, legen Sie 470 Mikroliter Puffer A in eine 1,5-Milliliter-Röhre und fügen Sie etwa 100 bis 200 Milligramm Protein hinzu.Sonicate die Röhre und dann trennen Sie das unlösliche Protein durch Zentrifugieren der Röhre bei 25 Grad Celsius und einem Minimum von 13.000 mal G für 10 Minuten. Übertragen Sie das lösliche Protein in eine neue 1,5-Milliliter-Röhre. Erstens, stören Sie die Disulfidbindungen, indem Sie das lösliche Protein in 25 Mikroliter TCEP für 60 Minuten bei 55 Grad Celsius inkubieren.Dann blockieren Sie freie Cysteins, indem Sie die Lösung mit 12,5 Mikrolitern der Stammlösung von NEM für drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes beginnen Sie den Prozess der Chloroform Methanol Fällung. Übertragen Sie die Proteinlösung aus dem 1,5-Milliliter-Rohr auf ein Polypropylen- oder Glasrohr, das in einem schwingenden Schaufelrotor mit bescheidener Geschwindigkeit zentrifugiert werden kann.Fügen Sie zwei Milliliter Methanol und Wirbel kurz hinzu. Fügen Sie einen Milliliter Chloroform und Wirbel kurz hinzu. Dann 1,5 Milliliter entionisiertes Wasser und Wirbel kurz wieder hinzufügen.Falls erforderlich, invertieren Sie das Rohr, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die Proben bei 3000 mal G und 25 Grad Celsius für 30 Minuten in einem schwingenden Schaufelrotor. Entfernen und entsorgen Sie die obere Phase der Lösung vorsichtig in einem Rohr.1,5 Milliliter Methanol hinzufügen. Mischen Sie sanft, aber gründlich durch sanfte Umkehrung der Röhre, achten Sie darauf, nicht den undurchsichtigen Protein Pfannkuchen fragmentieren. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten in einem schwingenden Schaufelrotor.Mit einer serologischen Glaspipette so viel wie möglich von der Obersten Phase der Lösung entfernen, ohne den Proteinpfannkuchen zu stören. Spülen Sie das Pellet vorsichtig mit einem Milliliter Methanol ab und lassen Sie es mindestens 10 Minuten trocknen. Wenn die Chloroform Methanol-Fällung abgeschlossen ist, beginnen Sie die Spaltung der Palmitoyl-Thioester-Verbindungen, indem Sie den Proteinauslauf in 125 Mikroliter Puffer A.Transfer in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr wieder aufsetzen.Beschallen Sie das Rohr kurz und zentrifugieren Sie es dann bei 13 000 mal G oder höher und 25 Grad Celsius für 10 Minuten, um unlösliches Material zu entfernen. Übertragen Sie das lösliche Protein in neue 1,5-Milliliter-Röhren und fügen Sie 375 Mikroliter Puffer H oder Puffer T hinzu. Nach der Inkubation der Proben für 60 Minuten bei Raumtemperatur, wiederholen Sie die Chloroform Methanol-Ausfällung. Um m-PEG zu ungeschützten Cysteins hinzuzufügen, beginnen Sie mit dem Wiederaufsetzen des Pellets in 100 Mikroliter Puffer A, der 10 mil oder mehr TCEP enthält.Dann die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie 25 Mikroliter Der Vorrat m-PEG 5K Lösung und mischen durch Pipettieren. Bei Raumtemperatur mit End-over-End-Rotation inkubieren.Entfernen Sie nach 60 Minuten Inkubation m-PEG 5K ohne Inkorporation, indem Sie erneut Chloroform-Methanol-Fällung durchführen. Zentrifuge bei mehr als 13.000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig die obere Phase wie zuvor, um den dicken, flockigen Pfannkuchen zu vermeiden.Einen Milliliter Methanol dazugeben und schonend, aber gründlich mischen. Zentrifuge bei mehr als 13.000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und spülen Sie das Pellet mit einem Milliliter Methanol ab.Wieder Zentrifuge bei mehr als 13.000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Nach dem Lufttrocknen des Pellets in 50 Mikroliter Puffer A ohne TCEP oder einem Reduktionsmittel wieder aufsetzen. Reservieren Sie 5 Mikroliter der Lösung für die BCA-Proteinquantitation.Nach der Quantifizierung eine entsprechende Menge an 4x Laemmli-Probenpuffer hinzufügen. Laden Sie das Beispiel auf ein SDS-Seitengel. Verwenden Sie Standard-Trennübertragungs- und -erkennungsprotokolle für das Western-Blotting.Um den Palmitoylierungszustand von SynDIG-Proteinen zu untersuchen, wurden P2-Membranfraktionen aus homogenisierten Maushirnen dem APEGS-Assay unterzogen. Die Trennung und Untersuchung mit Antikörpern zeigte, dass SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 und Prrt2 im Mausgehirn palmitoylated sind. Der Zweck der Chloroform-Methanol-Ausfällung besteht darin, eine Chemikalie wie NEM zu verhindern, die den nächsten Schritt des Protokolls beeinträchtigt.Eine richtige Chloroform Methanol Fällung entfernt unerwünschte Chemikalien und minimiert gleichzeitig den Proteinverlust. Diese Methode kann auf Gehirnlysate von Mäusen unterschiedlichen Alters oder aus verschiedenen Hirnregionen angewendet werden, um die räumlich-zeitlichen Vorschriften der Palmitoylierung zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Forschung

Biochemie

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung