Name: acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins at JoVE.com

המחברים מודים לג וולפריי לקבלת ייעוץ וכניסה בנוגע לשיטת ה-אפגס. מחקרים אלה היו ממומנים על ידי מענקי מחקר כדי E.D. מן הקרן וייטהול ו NIH-NIMH (1R01MH119347).

כל הליכים בעלי חיים בעקבות ההנחיות שנקבעו על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת קליפורניה, דיוויס.
1. הכנת קרום מוח העכבר
<ol><li>עכבר מערוף את ראשו באמצעות מכשיר הגיליוטינה ולנתח את המוח החוצה במהירות (ב< 1 דקות, אם אפשרי, כדי...

<ol>
	<li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins?.">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?.</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li><li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections.">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li><li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners.">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li><li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG1:+an+activity-regulated,+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development.">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li><li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability,+Localization,+and+Function.">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li><li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+proteins:+purification+and+identification.">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li><li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+(APEGS)+Assay.">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li><li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation.">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li><li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes.">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+The+Western+Blot.">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo.">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG4/Prrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function.">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li><li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP.">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li><li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79/150.">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li></ol>

בעבודה הקודמת שלנו, אנו משתמשים באותו שיטת אייב כדי להדגים כי SynDIG1 הוא palmitoylated בשני משקעי juxta שימור ממברנה Cys (נמצא כל החלבונים SynDIG חפור) באופן תלוי הפעילות כדי לווסת את היציבות, הלוקליזציה, פונקציה6. מגבלה היא כי שיטת אייב דורש טיהור אהדה עם שרפים agarose מצומת אבידין moieties כשלב הסופ?...

S-palmitoylation הוא שינוי הפיך לאחר השינוי של חלבונים היעד המסדיר האיגוד קרום יציב, סחר בחלבונים, ואינטראקציות חלבונים חלבון1. זה כולל תוספת של 16-פחמן palmitate moiety כדי שאריות ציסטאין באמצעות הצמדה מזרז ההצמדה של palmitoyl (PAT) אנזימים. חלבונים סינפטית רבים במוח הם palmitoylated, כולל האמפא-Rs ו-PSD-95, באופן התלוי בפעילות כדי להסדיר את היציבות, הלוקליזציה והפונקציה2,3,4. שינויים ברמות הסינפטית של AMPARs ב-PSD באמצעות האינטראקציה של גורמי עזר עם הפיגומים הסינפטית כגון PSD-95 ביסוד הפלסטיות הסינפטית; לכן, שיטות לקבוע את מצב הפלמיטלציה של חלבונים סינפטית מספק תובנה חשובה למנגנונים של פלסטיות סינפטית.
בעבר, זיהינו את משפחת SynDIG של ארבעה גנים (SynDIG1-4) קידוד המוח מסוים חלבונים טרנסקרום הקשר עם AMPARs5. ביטוי יתר או להפיל את SynDIG1 בתוך היפואת הנוירונים ההיפוקמא היפוקרטס מגדילה או פוחתת, בהתאמה, מזהה ה-, מספר ה-הסינפסה-R ו-x ב-~ 50% כפי שזוהה באמצעות האימונוציטוכימיה ואלקטרופיזיולוגיה5. אנו מנוצל החליפין acyl-biotin (אייב) מאפשר להדגים כי SynDIG1 הוא palmitoylated בשני שאריות juxta-transממברני (נמצא בכל החלבונים SynDIG חפור) באופן תלוי הפעילות כדי לווסת את היציבות, הלוקליזציה, פונקציה6. השיטת אייב מסתמכת על חילופי ביוטין על cysteines מוגן על ידי שינוי וטיהור אהדה הבאים7. כאן, אנו מתארים גישה ביוכימית חדשנית, שינוי החליפין של ה-acyl-pegyl (אפגס), הקובע8,9,10,11,12, שאינו דורש טיהור אהדה ובמקום זאת מנצל שינויים בניידות ג'ל כדי לקבוע את מספר השינויים עבור חלבון מעניין. הפרוטוקול מתואר לחקירה של חלבונים ממברנה אנדודוגני ממוח העכבר שעבורו נוגדנים מתאימים זמינים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td>
			<td>NOF</td>
			<td>ME-050MA</td>
			<td>MW ~5000 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmalemide (NEM)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>34115</td>
			<td>Highly toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical imager for densitometry</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Sapphire Biomolecular Imager</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (glass)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>580560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins

שינויים תלויי-הפעילות ברמות קולטני הסינפטיות (AMPARs) בתוך צפיפות הפוסט-סינפטית (PSD) נחשבת לייצוג מנגנון הסלולר ללמידה ולזיכרון. Palmitoylation מסדיר את הלוקליזציה והתפקוד של חלבונים סינפטיים רבים כולל אמפא-Rs, גורמי עזר ומקפלים סינפטיים באופן תלוי-פעילות. זיהינו את הסינפסה המושרה גן (syndig) משפחה של ארבעה גנים (SynDIG1-4) קידוד המוח מסוים חלבונים חלבון טראנסממברנלי השייך ampars ולווסת את הכוח סינפסה. SynDIG1 הוא palmitoylated בשני שאריות ציסטאין הממוקמים במיקום 191 ו 192 באזור juxta-טרנסקרום חשוב עבור פיתוח התפתחות הפעולה התלויית-סינפסה. כאן, אנו מתארים גישה חדשנית ביוכימית, משמרת ג'ל החליפין של acyl-PEGyl (אפגס), כדי לחקור את מצב הפלמיטלציה של כל חלבון של עניין ולהדגים את כלי השירות שלה עם משפחת הסינדיג של חלבונים במוח העכבר lysates.

המוח החיסוני עם נוגדנים נגד חלבון הריבית חושף את המדינה palmitoylated (לא, ביחידים, כפליים, וכו ') במוחו מוחית העכבר כפי שנקבע על ידי משמרת ניידות לעומת דגימות שבהן HAM לא נכלל. קודם לכן, הדגמנו שSynDIG1 הייתה בשני אתרים באמצעות שיטת אייב6; עם זאת, לא יכולנו לקבוע אם שני האת?...

Watch this Scientific Journal Video about Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins at JoVE.com

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Palmitoylation כרוך התאגדות של 16-פחמן palmitate moiety לשקעי ציסטאין של חלבונים היעד בצורה הפיכה. כאן, אנו מתארים גישה ביוכימית, השינוי של ה-acyl-PEGyl משמרת ג'ל, כדי לחקור את מצב הפלמיטלציה של כל חלבון של עניין במוח העכבר ליסביטים.

Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

שיטה ביוכימית זו מאפשרת לקבוע את מצב הפלמיטוילציה של כל חלבון קרום המובע במוח שעבורו זמין נוגדן מתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת טיהור זיקה ובמקום זאת משתמשת בשינויים בניידות הג'ל כדי לקבוע את מספר השינויים של חלבון מעניין. לאחר ניתוח המוח, הומוגניזציה זה מיד 10 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה homogeneizer זכוכית על קרח.באמצעות כ 12 משיכות, צנטריפוגה lysates במשך 15 דקות ב 1400 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס. העבר את העל-טבעי לצינור חדש על הקרח. תן שימוש חוזר את גלולה ב 10 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה.הומוגניזציה זה באמצעות כשש משיכות. צנטריפוגה ההשעיה ב 710 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מערבבים את העל-טבעיים ואת הצנטריפוגות ב-40,000 פעמים G ו-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את שבר הממברנה המוגלתי במאגר הומוגניזציה על-ידי פירוק גלולה עם קצה פיפטה וצנרת למעלה ולמטה. בצע בדיקת ABCA לכמת את רמות החלבון. כדי לבצע את בדיקת APEGS, מקם 470 מיקרוליטרים של מאגר A בצינור של 1.5 מיליליטר והוסף כ-100 עד 200 מיליגרם חלבון.Sonicate הצינור ולאחר מכן להפריד את החלבון מסיסים על ידי צנטריפוגה הצינור ב 25 מעלות צלזיוס ומינימום של 13, 000 פעמים G במשך 10 דקות. מעבירים את החלבון המבודד לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. ראשית, לשבש את הקשרים disulphide על ידי דגירה חלבון מסולובל ב 25 microliters של TCEP במשך 60 דקות ב 55 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לחסום ציסטאינים חינם על ידי דגירה הפתרון עם 12.5 microliters של פתרון המלאי של NEM במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להתחיל את התהליך של משקעים מתנול כלורופורם. מעבירים את ת פתרון החלבון מצינור 1.5 מיליליטר לצינור פוליפרופילן או זכוכית שניתן לצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד במהירות צנועה.מוסיפים שני מיליליטר של מתנול ומערבולת לזמן קצר. הוסף מיליליטר אחד של כלורופורם ומערבולת בקצרה. לאחר מכן להוסיף 1.5 מיליליטר של מים deionized ומערבולת בקצרה שוב.במידת הצורך, להפוך את הצינור כדי להבטיח ערבוב יסודי. צנטריפוגה הדגימות ב 3000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות רוטור דלי מתנדנד. בזהירות להסיר ולזרוק את השלב העליון של הפתרון בצינור.הוסף 1.5 מיליליטר של מתנול. מערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך עדין של הצינור, נזהרים לא לפצל את פנקייק החלבון אטום. צנטריפוגה המדגם ב 3000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות רוטור דלי מתנדנד.באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית, להסיר כמה שיותר של השלב העליון של הפתרון ככל האפשר מבלי להפריע פנקייק חלבון. בזהירות לשטוף את גלולה עם מיליליטר אחד של מתנול ולאפשר לו אוויר יבש לפחות 10 דקות. עם משקעים מתנול כלורופורם להשלים, להתחיל את המחשוף של הקישורים thioester palmitoyl על ידי שימוש חוזר את החלבון לזרז 125 microliters של חיץ A.Transfer לצינור חדש 1.5 מיליליטר.Sonicate הצינור לזמן קצר ולאחר מכן צנטריפוגה זה ב 13, 000 פעמים G ומעלה ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר חומר מסיס. מעבירים את החלבון המבודד לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר ומוסיפים 375 מיקרוליטרים של חיץ H או חיץ T.לאחר הדגירה של הדגימות במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, חזרו על משקעים כלורופורם מתנול. כדי להוסיף m-PEG לציסטאין לא מוגן, התחל על ידי שימוש חוזר את גלולה ב 100 microliters של חיץ A המכיל 10 מיליון או יותר TCEP.ואז להעביר את ההשעיה לצינור 1.5 מיליליטר. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תוסף M-PEG 5K למלאי וערבבו לפי צינורות. דגירה בטמפרטורת החדר עם סוף על סיבוב סוף.לאחר 60 דקות של דגירה, להסיר m-PEG 5K מאוגד על ידי ביצוע משקעים מתנול כלורופורם שוב. צנטריפוגה מעל 13, 000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את השלב העליון כמו קודם, הימנעות עבה, פנקייק flocculent.מוסיפים מיליליטר אחד של מתנול ומערבבים בעדינות אך ביסודיות. צנטריפוגה מעל 13, 000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולשטוף את גלולה עם מיליליטר אחד של מתנול.שוב, צנטריפוגה מעל 13, 000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר ייבוש האוויר את גלולה, resuspend אותו 50 microliters של חיץ A ללא TCEP או כל סוכן צמצום. שמור 5 מיקרוליטרים של הפתרון עבור כימות חלבון BCA.לאחר כימות, להוסיף כמות מתאימה של מאגר מדגם 4x Laemmli. טען את הדגימה לג'ל דף SDS. השתמש בפרוטוקולי העברה וזיהוי סטנדרטיים של הפרדה עבור כתמים מערביים.כדי לחקור את מצב palmitoylation של חלבוני SynDIG, שברי קרום P2 ממוחות עכבר הומוגניים היו נתונים לבדיקת APEGS. הפרדה ובדיקת נוגדנים הראו כי SynDIG1, SynDIG4 Prrt1, ו Prrt2 הם palmitoylated במוח העכבר. מטרת משקעים מתנול כלורופורם היא למנוע כימיקל אחד, כגון NEM, להפריע לשלב הבא של הפרוטוקול.משקעים מתנול כלורופורם נאות יסיר כימיקלים לא רצויים תוך מזעור אובדן חלבון. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על lysates המוח מעכברים בגילאים שונים או מאזורי מוח שונים כדי לחקור את התקנות המרחביות-זמניות של palmitoylation.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support