Name: acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00
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著者らは、APEGSアッセイに関するアドバイスとインプットをK.ウールフリーに感謝する。これらの研究は、ホワイトホール財団とNIH-NIMH(1R01MH119347)からE.D.への研究助成金によって資金提供されました。

すべての動物の手順は、国立衛生研究所(NIH)が定めたガイドラインに従い、カリフォルニア大学デービス校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。
1. マウス脳膜の調製
<ol><li>ギロチン装置を使用してマウスの首を切り落とし、脳を急速に解剖する(可能であれば、解剖中に起こり得るパルミトイル化の変化を最小限に抑えるために、可能であれば、...

<ol>
	<li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins?.">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?.</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li><li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections.">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li><li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners.">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li><li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG1:+an+activity-regulated,+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development.">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li><li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability,+Localization,+and+Function.">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li><li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+proteins:+purification+and+identification.">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li><li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+(APEGS)+Assay.">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li><li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation.">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li><li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes.">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+The+Western+Blot.">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo.">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG4/Prrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function.">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li><li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP.">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li><li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79/150.">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li></ol>

前の研究では、SynDIG1が2つの保存された並膜貫通Cys残基(すべてのSynDIGタンパク質に見られる)で、安定性、局在化、機能を調節する活性依存的な方法でパルミトレートされていることを実証するためにABEアッセイを利用しました。制限は、ABEアッセイは、手順の最終ステップとしてアビジン部分に結合したアガロース樹脂との親和性精製を必要とし、定量分析を複雑にするシ...

S-パルミトリューションは、安定した膜会合、タンパク質の密売、およびタンパク質とタンパク質相互作用を調節する標的タンパク質の可逆的な翻訳後修飾である。パルミトイルアシルトランスセファーゼ(PAT)酵素によって触媒チオエステルリンケージを介してシステイン残基に16-炭素パルミチン酸部分を添加することを含む。脳内の多くのシナプスタンパク質は、安定性、局在化,、および機能,2、3、4を調節する活動依存的な方法で、AMPA-RsおよびPSD-95を含むパルミトレート化される。24PSD-95のようなシナプス足場との補助因子の相互作用によるPSD中のシナプスAMPプラスチックのレベルの変化は、シナプス可塑性を下にしている。したがって、シナプスタンパク質のパルミトイル化状態を決定する方法は、シナプス可塑性のメカニズムに関する重要な洞察を提供する。
以前は、AMPA5と関連する脳特異的な膜貫通タンパク質をコードする4つの遺伝子(SynDIG1-4)の5SynDIGファミリーを同定した。解約されたラット海馬ニューロンにおけるSynDIG1の過剰発現またはノックダウンは、それぞれ増加または減少し、AMPA-Rシナプスサイズおよび数は免疫細胞化学および電気生理学を用いて検出された〜50%ずつ増加または減少する。我々は、アシルビオチン交換(ABE)アッセイを利用して、SynDIG1が2つの保存された並膜貫通Cys残基(全SynDIGタンパク質に見られる)でパルミトレートされ、安定性、局在化、機能6を調節する活性依存的な方法で実証した。ABEアッセイは、改変とその後の親和性精製によって保護されたシステインに対するビオチンの交換に依存する7。ここでは、アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイ,88、9、10、11、1210,11という革新的な生化学的アプローチについて説明します。,912プロトコルは、適切な抗体が利用可能なマウス脳からの内因性膜タンパク質の調査のために記述されている。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td>
			<td>NOF</td>
			<td>ME-050MA</td>
			<td>MW ~5000 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmalemide (NEM)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>34115</td>
			<td>Highly toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical imager for densitometry</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Sapphire Biomolecular Imager</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (glass)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>580560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins

シナプス後密度(PSD)内のシナプスAMPA受容体(AMPA)のレベルにおける活動依存的変化は、学習および記憶のための細胞メカニズムを表していると考えられている。パルミトイル化は、AMPA-Rs、補助因子、シナプス足場を含む多くのシナプスタンパク質の局在化と機能を活動依存的に調節します。我々は、AMPAに関連付け、シナプス強度を調節する脳特異的な膜貫通タンパク質をコードする4つの遺伝子(SynDIG1-4)のシナプス分化誘導遺伝子(SynDIG)ファミリーを同定した。SynDIG1は、活性依存性励起シナプスの発達に重要な並置膜貫通領域の位置191および192に位置する2つのシステイン残基でパルミトレート化される。ここでは、革新的な生化学的アプローチであるアシルPEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイについて、目的のタンパク質のパルミトリューション状態を調査し、マウス脳リセート中のSynDIGファミリーのタンパク質との有用性を実証する。

目的のタンパク質に対する抗体を用いた免疫ブロッティングは、HAMが含まれていないサンプルと比較して移動性シフトによって決定されるマウス脳ライゼにおけるパルミトレート状態(非、独り、二重など)を明らかにする。以前は、SynDIG1がABEアッセイ6を用いて2つのサイトでパルミトレートされていることを実証しました。しかし、両方の部位が脳?...

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Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

パルミトイル化は、16炭素パルミチン酸部分を、可逆的に標的タンパク質のシステイン残基に取り込む必要があります。ここでは、生化学的アプローチ、アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイについて、マウス脳ライセートに関心のある任意のタンパク質のパルミトイル化状態を調べる。

脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

この生化学的方法は、適切な抗体が利用可能な脳内で発現される任意の膜タンパク質のパルミトイル化状態の決定を可能にする。この技術の主な利点は、アフィニティー精製を必要とせず、代わりにゲル移動性の変化を利用して、目的のタンパク質の改変数を決定することです。脳を解剖した後、氷上のガラスホモジナイザーで均質化バッファーの10ミリリットルですぐに均質化します。約12ストロークを使用して、1400倍Gで15分間、摂氏4度の間、ライセートを遠心分離する。上清を氷上の新しいチューブに移します。ペレットを均質化バッファーの 10 ミリリットルに再懸濁します。約6ストロークで均質化します。サスペンションを710倍Gで、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清と遠心分離機を40,000倍Gと摂氏4度で20分間組み合わせます。上清を捨て、ペレットをピペットチップで分解し、上下にピペット処理することで、ペレット化膜分率を均質化バッファーに再懸濁します。ABCAアッセイを実行してタンパク質レベルを定量化する。APEGSアッセイを実行するには、470マイクロリットルのバッファーAを1.5ミリリットルチューブに入れ、約100~200ミリグラムのタンパク質を加えます。チューブを超音波処理し、25°Cでチューブを遠心分離し、10分間Gの13,000倍以上で不溶性タンパク質を分離します。水化したタンパク質を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。まず、25マイクロリットルのTCEP中の溶解タンパク質を摂氏55度で60分間インキュベートすることにより、二硫化物結合を破壊する。次いで、NEMのストック溶液12.5マイクロリットルを室温で3時間インキュベートして遊離システインをブロックする。次に、クロロホルムメタノール沈殿のプロセスを開始する。1.5ミリリットルチューブからポリプロピレンまたはガラスチューブにタンパク質溶液を移し、適度な速度で揺れるバケットローターで遠心分離することができます。メタノールと渦を2ミリリットル加えます。クロロホルムと渦を1ミリリットル加えます。その後、1.5ミリリットルの脱イオン水と渦をもう一度短時間加えます。必要に応じて、チューブを反転して、徹底的な混合を確実にします。スイングバケットローターで30分間、Gの3000倍と摂氏25度でサンプルを遠心分離します。慎重に除去し、チューブ内の溶液の上相を捨てます.1.5ミリリットルのメタノールを加えます。不透明なタンパク質パンケーキを断片化しないように注意して、チューブの穏やかな反転によって穏やかだが徹底的に混ぜます。スイングバケットローターで10分間、Gの3000倍と摂氏25度でサンプルを遠心分離します。ガラス血清ピペットを使用して、タンパク質パンケーキを邪魔することなく、溶液のトップフェーズをできるだけ多く取り除きます。ペレットを1ミリリットルのメタノールで慎重にすすいで、少なくとも10分間空気乾燥させます。クロロホルムメタノール沈殿が完了したら、125マイクロリットルのバッファーA.Transferを新しい1.5ミリリットルチューブに再懸濁させることでパルミトイルチオエステル結合の切断を開始します。チューブを短時間超音波処理し、不溶性物質を除去するために13,000倍G以上、摂氏25度で遠心分離します。水化したタンパク質を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、375マイクロリットルのバッファーHまたはバッファT.室温でサンプルを60分間インキュベートした後、クロロホルムメタノール沈殿を繰り返します。保護されていないシステインにm-PEGを添加するには、10mil以上のTCEPを含む100マイクロリットルのバッファーAにペレットを再懸濁させることから始める。その後、懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。25マイクロリットルのストックM-PEG 5K溶液を加え、ピペットで混合します。終点回転で室温でインキュベートします。60分間のインキュベーションの後、クロロホルムメタノール沈殿を再度行うことにより非法人m-PEG5Kを除去した。13,000倍Gと摂氏25度を超える遠心分離機を10分間。厚くて凝集したパンケーキを避けて、以前と同じくらい慎重に上相を取り除きます。1ミリリットルのメタノールを加え、穏やかに、しかし十分に混ぜます。13,000倍Gと摂氏25度を超える遠心分離機を10分間。上清を慎重に取り除き、1ミリリットルのメタノールでペレットをすすきます。繰り返しますが、遠心分離機は13,000倍Gを超え、摂氏25度で10分間です。ペレットを空気乾燥させた後、TCEPまたは任意の還元剤を使用せずに50マイクロリットルのバッファーAで再懸濁する。BCAタンパク質定量用に溶液の5マイクロリットルを予約してください。定量後、適切な量の4倍のレムリサンプルバッファーを加えます。サンプルを SDS ページゲルにロードします。ウェスタンブロッティングには標準の分離転送および検出プロトコルを使用してください。SynDIGタンパク質のパルミトリューション状態を調べるため、均質化マウス脳からのP2膜画分をAPEGSアッセイに供した。抗体による分離とプローブは、SynDIG1、SynDIG4 Prrt1、およびPrrt2がマウス脳でパルミトレートされていることを実証した。クロロホルムメタノール沈殿の目的は、NEMのような1つの化学物質を防止し、プロトコルの次のステップを妨害することにある。適切なクロロホルムメタノール沈殿は、タンパク質の損失を最小限に抑えながら、望ましくない化学物質を除去します。この方法は、異なる年齢のマウスまたは異なる脳領域からの脳ライセートに適用され、パルミトイル化の空間的時間的規制を調査することができる。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support