Name: acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00
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저자는 APEGS 분석에 대한 조언과 입력K. 울프리 감사합니다. 이 연구 결과는 화이트홀 재단과 NIH-NIMH (1R01MH119347)에서 E.D.에 연구 보조금에 의해 투자되었습니다.

모든 동물 절차는 국립 보건원 (NIH)에 의해 명시된 지침을 따르고 캘리포니아 대학, 데이비스에 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 뇌막의 준비
<ol><li>기요틴 장치를 사용하여 마우스를 참수하고 뇌를 빠르게 해부하십시오 (<1 분, 가능하면 해부 절차 중에 발생할 수있는 팔미토일화 변화를 최소화하십시오). 얼음 에 유리 균질화 제 (~12 스트로크...

<ol>
	<li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins?.">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?.</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li><li>Globa, A. K., Bamji, S. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners.">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li><li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG1:+an+activity-regulated,+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development.">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li><li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability,+Localization,+and+Function.">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li><li>Wan, J., Roth, A. 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Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+The+Western+Blot.">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo.">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG4/Prrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function.">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li><li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP.">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li><li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79/150.">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li></ol>

전작에서는 ABE 분석서를 활용하여 SynDIG1이 안정성, 국소화 및 기능6을조절하는 활성 의존적 방식으로 보존된 두 개의 병치-막간 시스 잔류물(모든 SynDIG 단백질에서 발견)에서 팔미토화된다는 것을 입증했습니다. 한계는 ABE 분석이 절차의 마지막 단계로 아비딘 모에티에 공액 된 아가로즈 수지와의 친화정화가 필요하며, 이로 인해 정량적 분석이 복잡해지는 신호의 상당한 손실?...

S-팔미토일화는 안정적인 막 연관성, 단백질 인신 매매 및 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 표적 단백질의 가역적 번역 후변형1. 그것은 팔미토일 아실 트랜스퍼 라제 (PAT) 효소에 의해 촉매 티오 에스터 링키지를 통해 시스테인 잔기에 16 탄소 팔미테 모티의 추가를 포함한다. 뇌의 많은 시냅스 단백질은 AMPA-Rs 및 PSD-95를 포함하는, 안정성, 국소화 및 기능2,,3,,4를조절하는 활성 의존적 방식으로 팔미토틸화된다. PSD-95와 같은 시냅스 스캐폴드와 보조 요인의 상호 작용을 통해 PSD에 있는 시냅스 AMPARs의 수준에 있는 변경은 시냅스 가소성을 기초로 합니다; 따라서, 시냅스 단백질의 팔미토일화 상태를 결정하는 방법은 시냅스 가소성의 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공한다.
이전에는 AMPARs5와연관된 뇌 특이적 막 간 단백질을 코딩하는 4개의 유전자(SynDIG1-4)의 SynDIG 제품군을 확인했습니다. 해리된 랫트 해마 뉴런에서 SynDIG1의 과발현 또는 노크다운은 각각 면역세포화학 및전기생리학을사용하여 검출된 바와 같이, AMPA-R 시냅스 크기 및 수 ~50%에 의해 증가 또는 감소한다. 우리는 아실-비오틴 교환(ABE) 분석서를 활용하여 SynDIG1이 안정성, 국소화 및 기능을 조절하는 활성 의존적 방식으로 두 개의 보존된 병치-막간 시스 잔류물(모든 SynDIG 단백질에서 발견)에서 팔미토틸화된다는 것을 입증하였다6. ABE 분석은 변형 및 후속 친화성 정제에 의해 보호 시스테인에 비오틴의 교환에 의존7. 여기서, 우리는 혁신적인 생화학적 접근법, 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS)8분석8,9,10,,11,,12,친화성 정제를 필요로 하지 않고 대신 겔 이동성의 변화를 활용하여 관심 있는 단백질에 대한 수정 횟수를 결정한다., 프로토콜은 적합한 항체가 유효한 마우스 두뇌에서 내인성 막 단백질의 조사를 위해 기술됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td>
			<td>NOF</td>
			<td>ME-050MA</td>
			<td>MW ~5000 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmalemide (NEM)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>34115</td>
			<td>Highly toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical imager for densitometry</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Sapphire Biomolecular Imager</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (glass)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>580560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins

시 냅 스 AMPA 수용 체의 수준에서 활동 의존 변경 (AMPARs) 후 층 내 밀도 (PSD) 학습 및 메모리에 대 한 세포 메커니즘을 나타내는 것으로 생각 된다. 팔미토일화는 AMPA-Rs, 보조 인자 및 시냅스 스캐폴드를 포함한 많은 시냅스 단백질의 국소화 및 기능을 활성 의존적 방식으로 조절합니다. 우리는 4개의 유전자의 시냅스 분화 유도한 유전자 (SynDIG1-4) AMPA와 연관되고 시냅스 강도를 통제하는 두뇌 특정 막 막 단백질을 인코딩하는 것을 확인했습니다. SynDIG1은 활성 의존적 흥분성 시냅스 개발에 중요한 병타-트랜스멤브레인 영역에서 위치하는 2개의 시스테인 잔기에서 191 및 192에 위치한다. 여기에서, 우리는 혁신적인 생화확적인 접근법, 아실-PEGyl 교환 젤 시프트(APEGS) 분석법을 기술하여, 관심 있는 단백질의 팔미토일화 상태를 조사하고 마우스 뇌 용해액에 있는 단백질의 SynDIG 제품군과 그 유용성을 입증한다.

관심 있는 단백질에 대하여 항체를 가진 면역 blotting은 HAM가 포함되지 않은 견본과 비교된 이동성 교대에 의해 결정된 마우스 두뇌에 있는 palmitoylated 상태 (비, singly, 이중 등)를 제시합니다. 이전에는 SynDIG1이 ABE 분석6을사용하여 두 사이트에서 팔미토틸화되었다는 것을 입증했습니다. 그러나, 우리는 두 사이트가 뇌 조직에서 수정되었는지 여부를 확인?...

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Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

팔미토일화는 가역적인 방식으로 표적 단백질의 시스테인 잔류물까지 16탄소 팔미네이트 모이티의 혼입을 수반한다. 여기서, 우리는 생화학적 접근법, 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS) 분석법을 설명하고, 마우스 뇌 용해액에 관심 있는 임의의 단백질의 팔미토일화 상태를 조사한다.

아실-PEGyl 교환 젤 시프트 분석은 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 것입니다.

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

이러한 생화학적 방법은 적합한 항체가 가능한 뇌에서 발현되는 모든 멤브레인 단백질의 팔미토일화 상태를 판단할 수 있게 한다. 이 기술의 주요 장점은 친화성 정화를 필요로하지 않고 대신 관심있는 단백질의 수정 수를 결정하기 위해 젤 이동성의 변화를 활용한다는 것입니다. 뇌를 해부한 후, 얼음에 유리 균질화에 균질화 완충제의 10 밀리리터에서 즉시 균질화.약 12스트로크를 사용하여 1400회 G에서 15분 동안, 섭씨 4도에서 15분간 용해를 원심분리합니다. 얼음에 새로운 튜브에 상체를 전송합니다. 균일화 완충제의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.약 6개의 스트로크를 사용하여 균질화하십시오. 서스펜션은 710배, 섭씨 4도에서 10분간 분리합니다. 수퍼나티와 원심분리기를 40, 000배, 섭씨 4도에서 20분간 결합합니다.피펫 끝으로 펠릿을 분해하고 위아래로 파이펫을 하여 상체를 버리고 펠릿 막 분획을 균일화 버퍼에서 재연합니다. 단백질 수치를 양량화하기 위해 ABCA 분석기를 수행하십시오. APEGS 분석기를 수행하려면 버퍼 A 470 마이크로리터를 1.5 밀리리터 튜브에 넣고 약 100~200밀리그램의 단백질을 추가합니다.튜브를 초음파 처리한 다음 튜브를 섭씨 25도, 최소 13, 000배 G에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 단백질을 분리합니다. 용해성 단백질을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 첫째, 55°C에서 60분 동안 TCEP의 25마이크로리터에서 용액화된 단백질을 배양하여 이황류 결합을 방해합니다.그런 다음, 실온에서 3시간 동안 NEM의 스톡 용액의 12.5 마이크로리터로 용액을 배양하여 무료 시스테인을 차단합니다. 다음으로, 클로로폼 메탄올 강수량 과정을 시작합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 적당한 속도로 스윙 버킷 로터에서 원심분리될 수 있는 폴리프로필렌 또는 유리 튜브로 단백질 용액을 전달합니다.메탄올과 소용돌이의 두 밀리리터를 간단히 넣습니다. 클로로폼과 소용돌이 1밀리리터를 짧게 넣습니다. 그런 다음 1.5 밀리리터의 탈온된 물과 소용돌이를 다시 간략하게 추가합니다.필요한 경우 튜브를 뒤집어 철저한 혼합을 보장합니다. 시료를 G 3000배, 섭씨 25도에서 30분간 스윙 버킷 로터에서 원심분리합니다. 조심스럽게 제거하고 튜브에서 용액의 상층을 폐기.메탄올 1.5 밀리리터를 추가합니다. 튜브의 부드러운 반전으로 부드럽고 철저하게 섞어 불투명한 단백질 팬케이크를 조각하지 않도록 주의하십시오. 원심 분리는 스윙 버킷 로터에서 10 분 동안 3000 배 G 및 섭씨 25도에서 샘플을 원심 분리합니다.유리 세로지 피펫을 사용하여 단백질 팬케이크를 방해하지 않고 가능한 한 많은 용액을 제거하십시오. 펠릿을 메탄올 1밀리리터로 조심스럽게 헹구고 10분 이상 건조시키세요. 클로로폼 메탄올 침전이 완료되면, 완충 A.Transfer의 125 마이크로리터에서 단백질 침전을 재중단하여 팔미토일 티오에스테르 연계의 분열을 시작한다.튜브를 간략하게 초음파 처리한 다음 13, 000배 G 이상, 섭씨 25도에서 10분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거합니다. 용액화된 단백질을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 375마이크로리터의 완충 H 또는 버퍼 T.를 실온에서 60분 동안 배양한 후 클로로폼 메탄올 침전을 반복한다. 보호되지 않은 시스테인에 m-PEG를 추가하려면 10mil 이상을 포함하는 완충A의 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하여 시작합니다.그런 다음 서스펜션을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 스톡 m-PEG 5K 용액 25마이크로리터를 추가하고 파이펫팅으로 섞습니다. 끝 회전을 통해 끝과 실온에서 배양.60분 간 인큐베이션을 한 후 클로로폼 메탄올 강수량을 다시 수행하여 통합되지 않은 m-PEG 5K를 제거합니다. 원심분리기는 13배, 000배, 섭씨 25도를 10분 이상 입니다. 두껍고 부풀어 있는 팬케이크를 피하면서 이전과 같이 상판을 조심스럽게 제거하십시오.메탄올 1밀리리터를 넣고 부드럽고 철저하게 섞습니다. 원심분리기는 13배, 000배, 섭씨 25도를 10분 이상 입니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 메탄올 1 밀리리터로 펠릿을 헹구십시오.다시 말하지만, 원심분리기는 13배, 000배, 섭씨 25도를 10분 동안 초과합니다. 펠릿을 공기 건조 후, TCEP 또는 환원 제없이 완충 A의 50 마이크로 리터로 다시 중단. BCA 단백질 수량에 대한 용액 의 5 마이크로 리터를 예약하십시오.수량 후 적량의 4배 Laemmli 샘플 버퍼를 추가합니다. 샘플을 SDS 페이지 젤에 로드합니다. 서부 블로팅에 표준 분리 전송 및 감지 프로토콜을 사용합니다.SynDIG 단백질의 팔미토일화 상태를 조사하기 위해 균질화된 마우스 뇌에서 P2 멤브레인 분획은 APEGS 분석기를 실시하였다. 항체와의 분리 및 프로빙은 SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 및 Prrt2가 마우스 뇌에서 팔미토이트된다는 것을 입증했습니다. 클로로폼 메탄올 침전의 목적은 NEM과 같은 하나의 화학 물질을 방지하여 프로토콜의 다음 단계를 방해하는 것입니다.적절한 클로로폼 메탄올 강수량은 단백질 손실을 최소화하면서 바람직하지 않은 화학 물질을 제거합니다. 이 방법은 팔미토일화의 공간 측두체 규정을 조사하기 위해 다른 연령대의 마우스 또는 다른 뇌 영역에서 뇌 용액에 적용 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

연구

생화학

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support