Name: acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins at JoVE.com

Forfatterne takker K. Woolfrey for råd og innspill på APEGS-analysen. Disse studiene ble finansiert av forskningstilskudd til E.D. fra Whitehall Foundation og NIH-NIMH (1R01MH119347).

Alle dyreprosedyrer fulgte retningslinjer fastsatt av National Institutes of Health (NIH) og har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Davis.
1. Forberedelse av mus hjernemembraner
<ol><li>Halshugge musen ved hjelp av et giljotinapparat og dissekere hjernen ut raskt (i <1 min, om mulig, for å minimere palmitoyleringsendringer som kan oppstå under disseksjonsprosedyren). Homogeniser umiddelbart i 10 ml homogeniseringsbuffer (Tabe...

<ol>
	<li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins?.">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?.</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li><li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections.">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li><li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners.">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li><li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG1:+an+activity-regulated,+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development.">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li><li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability,+Localization,+and+Function.">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li><li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+proteins:+purification+and+identification.">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li><li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+(APEGS)+Assay.">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li><li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation.">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li><li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes.">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+The+Western+Blot.">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo.">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG4/Prrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function.">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li><li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP.">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li><li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79/150.">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li></ol>

I vårt tidligere arbeid benyttet vi ABE-analysen til å vise at SynDIG1 er palmitoylated ved to konserverte juxta-transmembrane Cys rester (finnes i alle SynDIG proteiner) på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering og funksjon6. En begrensning er at ABE-analysen krever affinitetsrensing med agaroseharpikser som konjugeres til avidin moieties som det siste trinnet i prosedyren, noe som resulterer i betydelig tap av signal som kompliserer kvantitativ analyse. Videre ka...

S-palmitoylering er en reversibel post-translasjonell modifikasjon av målproteiner som regulerer stabil membranforening, proteinhandel og proteinproteininteraksjoner1. Det innebærer tillegg av en 16-karbon palmitat moiety til cystein rester via thioester linkage katalysert av palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymer. Mange synaptiske proteiner i hjernen er palmitoylert, inkludert AMPA-Rs og PSD-95, på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering og funksjon2,3,4. Endringer i nivåene av synaptiske AMPARs i PSD via interaksjon av hjelpefaktorer med synaptiske stillas som PSD-95 ligger til grunn for synaptisk plastisitet; dermed gir metoder for å bestemme palmitoyleringstilstanden til synaptiske proteiner viktig innsikt i mekanismer for synaptisk plastisitet.
Tidligere identifiserte vi SynDIG-familien med fire gener (SynDIG1-4) koding av hjernespesifikke transmembranproteiner som forbinder med AMPARs5. Overexpression eller knock-down av SynDIG1 i dissosierte rotte hippocampal nevroner øker eller reduseres, henholdsvis AMPA-R synapse størrelse og nummer med ~ 50% som detektert ved hjelp av immuncytokjemi og elektrofysiologi5. Vi benyttet acyl-biotin utveksling (ABE) analyse for å vise at SynDIG1 er palmitoylated på to konserverte juxta-transmembrane Cys rester (finnes i alle SynDIG proteiner) på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering, og funksjon6. ABE-analysen er avhengig av utveksling av biotin på cysteiner beskyttet av modifikasjon og påfølgende affinitetsrensing7. Her beskriver vi en innovativ biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse8,9,10,11,12, som ikke krever affinitet rensing og i stedet benytter endringer i gel mobilitet for å bestemme antall modifikasjoner for et protein av interesse. Protokollen er beskrevet for undersøkelse av endogene membranproteiner fra musehjernen som egnede antistoffer er tilgjengelige for.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td>
			<td>NOF</td>
			<td>ME-050MA</td>
			<td>MW ~5000 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmalemide (NEM)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>34115</td>
			<td>Highly toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical imager for densitometry</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Sapphire Biomolecular Imager</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (glass)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>580560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins

Aktivitetsavhengige endringer i nivåene av synaptiske AMPA-reseptorer (AMPARs) innenfor den postsynaptiske tettheten (PSD) antas å representere en cellulær mekanisme for læring og minne. Palmitoylation regulerer lokalisering og funksjon av mange synaptiske proteiner, inkludert AMPA-Rs, hjelpefaktorer og synaptiske stillas på en aktivitetsavhengig måte. Vi identifiserte synapsedifferensieringsindusertgen (SynDIG) av fire gener (SynDIG1-4) koding hjernespesifikke transmembrane proteiner som forbinder med AMPARs og regulerer synapsestyrke. SynDIG1 er palmitoylated ved to cysteinrester som ligger i stillinger 191 og 192 i den juxta-transmembrane regionen viktig for aktivitetsavhengig spenningssynapse utvikling. Her beskriver vi en innovativ biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse, for å undersøke palmitoylering tilstand av noe protein av interesse og demonstrere sin nytte med SynDIG familien av proteiner i mus hjernen lysates.

Immunblotting med antistoffer mot proteinav interesse avslører palmitoylated tilstand (ikke, enkeltvis, dobbelt, etc.) i mus hjernen lysates som bestemmes av mobilitet skift sammenlignet med prøver der HAM ikke var inkludert. Tidligere hadde vi vist at SynDIG1 ble palmitoylated på to steder ved hjelp av ABE analyse6; Vi kunne imidlertid ikke avgjøre om begge nettstedene ble endret i hjernevev. Her viser vi at SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 og Prrt2 er palmitoylated i m...

Watch this Scientific Journal Video about Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins at JoVE.com

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Palmitoylation innebærer inkorporering av en 16-karbon palmitat moiety til cystein rester av målproteiner på en reversibel måte. Her beskriver vi en biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse, for å undersøke palmitoylering tilstand av ethvert protein av interesse for mus hjernen lysates.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analyse for kvantitativ bestemmelse av palmitoylering av hjernemembranproteiner

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Denne biokjemiske metoden gjør det mulig å bestemme palmitoyleringstilstanden til ethvert membranprotein uttrykt i hjernen som et egnet antistoff er tilgjengelig for. Den største fordelen med denne teknikken er at det ikke krever affinitetsrensing og i stedet benytter endringer i gelmobilitet for å bestemme antall modifikasjoner av et protein av interesse. Etter dissekering ut hjernen, homogenisere det umiddelbart i 10 milliliter homogenisering buffer i et glass homogenisator på is.Ved hjelp av ca 12 slag, sentrifugere lysates i 15 minutter ved 1400 ganger G, og fire grader Celsius. Overfør det overnaturlige til et nytt rør på is. Resuspend pellet i 10 milliliter homogenisering buffer.Homogenisere den ved hjelp av omtrent seks slag. Sentrifuger suspensjonen ved 710 ganger G og fire grader Celsius i 10 minutter. Kombiner supernativa og sentrifuge dem på 40, 000 ganger G og fire grader Celsius i 20 minutter.Kast den overnaturlige og resuspend pelleted membranfraksjonen i en homogeniseringsbuffer ved å bryte opp pelleten med en pipettespiss og pipettering opp og ned. Utfør ABCA-analyse for å kvantate proteinnivåer. For å utføre APEGS-analysen plasserer du 470 mikroliter buffer A i et 1,5 milliliter rør og tilsetter ca. 100 til 200 milligram protein.Sonicate røret og deretter skille uoppløselig protein ved å sentrifugere røret ved 25 grader Celsius og minst 13,000 ganger G i 10 minutter. Overfør det solubaliserte proteinet til et nytt 1,5 milliliter rør. Først forstyrrer disulfidbindingene ved å inkubere det solubaliserte proteinet i 25 mikroliter TCEP i 60 minutter ved 55 grader Celsius.Deretter blokkerer du frie cysteiner ved å inkubere løsningen med 12,5 mikroliter av lagerløsningen til NEM i tre timer ved romtemperatur. Deretter begynner prosessen med kloroform metanol nedbør. Overfør proteinløsningen fra 1,5 ml til et polypropylen- eller glassrør som kan sentrifugeres i en svingende bøtterotor med beskjeden hastighet.Tilsett to milliliter metanol og vortex kort. Tilsett en milliliter kloroform og vortex kort. Tilsett deretter 1,5 milliliter av deionisert vann og virvel kort igjen.Om nødvendig, inverter røret for å sikre grundig blanding. Sentrifuger prøvene ved 3000 ganger G og 25 grader Celsius i 30 minutter i en svingende bøtterotor. Fjern og kast forsiktig den øvre fasen av oppløsningen i et rør.Tilsett 1,5 milliliter metanol. Bland forsiktig, men grundig ved mild inversjon av røret, vær forsiktig så du ikke fragmenterer det ugjennomsiktige proteinpannekaken. Sentrifuger prøven ved 3000 ganger G og 25 grader Celsius i 10 minutter i en svingende bøtterotor.Bruk en glass serologisk pipette, fjern så mye av den øverste fasen av løsningen som mulig uten å forstyrre proteinpannekaken. Skyll pelleten forsiktig med ett milliliter metanol og la den lufttørke i minst 10 minutter. Med kloroform metanol nedbør fullført, begynne spaltning av palmitoyl thioester linker ved å gjenopplive proteinutfelling i 125 mikroliter buffer A.Transfer til en ny 1,5 milliliter rør.Sonicate røret kort og deretter sentrifuge det på 13, 000 ganger G eller høyere og 25 grader Celsius i 10 minutter for å fjerne uoppløselig materiale. Overfør det solubaliserte proteinet til nye 1,5 milliliter rør og tilsett 375 mikroliter buffer H eller buffer T.Etter inkubering av prøvene i 60 minutter ved romtemperatur, gjenta kloroformmetanrenen. For å legge m-PEG til ubeskyttede cysteiner, begynn med å gjenbruke pelleten i 100 mikroliter buffer A som inneholder 10 mil eller mer TCEP.Deretter overfører du suspensjonen til et 1,5 milliliter rør. Tilsett 25 mikroliter lager m-PEG 5K oppløsning og bland ved pipettering. Inkuber ved romtemperatur med ende over ende rotasjon.Etter 60 minutter med inkubasjon, fjern unincorporated m-PEG 5K ved å utføre kloroform metanol nedbør igjen. Sentrifuge på mer enn 13, 000 ganger G og 25 grader Celsius i 10 minutter. Fjern forsiktig den øvre fasen som før, unngå den tykke, flocculent pannekake.Tilsett en milliliter metanol og bland forsiktig, men grundig. Sentrifuge på mer enn 13, 000 ganger G og 25 grader Celsius i 10 minutter. Fjern forsiktig supernatanten og skyll pelleten med en milliliter metanol.Igjen, sentrifuge på mer enn 13, 000 ganger G og 25 grader Celsius i 10 minutter. Etter lufttørking av pelleten, resuspend det i 50 mikroliter buffer A uten TCEP eller noen reduksjonsmiddel. Reserver 5 mikroliter av oppløsningen for BCA proteinmengde.Etter kvantitet legger du til en passende mengde 4x Laemmli-prøvebuffer. Legg prøven på en SDS sidegel. Bruk standard separasjons- og deteksjonsprotokoller for vestlig blotting.For å undersøke palmitoyleringstilstanden til SynDIG-proteiner ble P2-membranfraksjoner fra homogeniserte musehjerner utsatt for APEGS-analysen. Separasjon og sondering med antistoffer viste at SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 og Prrt2 er palmitoylert i musehjernen. Formålet med kloroformmetankolrenskning er å forhindre at ett kjemikalie, som NEM, forstyrrer neste trinn i protokollen.En skikkelig kloroform metanol nedbør vil fjerne uønskede kjemikalier samtidig minimere protein tap. Denne metoden kan brukes på hjernelylater fra mus i ulike aldre eller fra forskjellige hjerneregioner for å undersøke de romlige-temporale forskriftene for palmitoylering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

En optimalisert protokoll for Elektro Mobility Skift Assay bruker infrarød Fluorescent Dye-merkede oligonukleotider

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkonkurranseanalyse for fosforyleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning av vaskemiddel-sensitive interaksjoner mellom membran proteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Bruk av rekombinant Fusion proteiner i en fluorescerende Protease analysen plattform og deres i-gel-Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte