Name: acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins at JoVE.com

Yazarlar tavsiye ve APEGS tayini üzerinde giriş için K. Woolfrey teşekkür ederim. Bu çalışmalar, Whitehall Vakfı ve NIH-NIMH'den (1R01MH119347) E.D.'ye yapılan araştırma hibeleri ile finanse edilmiştir.

Tüm hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından belirlenen yönergeleri takip ve California Üniversitesi, Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Fare beyin zarlarının hazırlanması
<ol><li>Bir giyotin aparatı kullanarak fareyi decapitate ve hızlı bir şekilde beyin dışarı diseksiyon (in <1 dk, mümkünse, diseksiyon işlemi sırasında oluşabilir palmitoylation değişiklikleri en aza indirmek için). 10 mL'lik ...

<ol>
	<li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins?.">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?.</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li><li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections.">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li><li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners.">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li><li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG1:+an+activity-regulated,+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development.">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li><li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability,+Localization,+and+Function.">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li><li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+proteins:+purification+and+identification.">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li><li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5.">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li><li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+(APEGS)+Assay.">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li><li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation.">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li><li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation.">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li><li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes.">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+The+Western+Blot.">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).</li><li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo.">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SynDIG4/Prrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function.">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li><li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP.">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li><li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79/150.">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li></ol>

Önceki çalışmamızda, SynDIG1'in stabiliteyi, lokalizasyonu ve fonksiyon6'yıdüzenlemek için aktiviteye bağımlı bir şekilde iki korunmuş yan yana transmembran Kis kalıntısı (tüm SynDIG proteinlerinde bulunan) palmitoylated olduğunu göstermek için ABE tsayını kullandık. Bir sınırlama ABE tahlil avidin moieties prosedürün son adım olarak konjuge agarose reçine ile yakınlık arınma gerektirir, kantitatif analiz karmaşık sinyal önemli kaybına neden. Ayrıca, ABE tsay b...

S-palmitoylation kararlı membran ilişkisi, protein ticareti ve protein-proteinetkileşimleridüzenleyen hedef proteinlerin geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyon 1. Palmitoyl acyltransferaz (PAT) enzimleri tarafından katalize edilen tiyoester bağlantısı ile sistein kalıntılarına 16 karbonlu palmitat moiety eklenmesini içerir. Beyindeki birçok sinaptik proteinler palmitoylated, AMPA-Rs ve PSD-95 dahil, bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar düzenlemek için, lokalizasyon, ve fonksiyon2,3,4. PSD-95 gibi sinaptik silikatüritlik ile yardımcı faktörlerin etkileşimi yoluyla PSD sinaptik AMPAR düzeylerinde değişiklikler sinaptik plastisite altında; böylece sinaptik proteinlerin palmitoylation durumunu belirleme yöntemleri sinaptik plastisite mekanizmalarına önemli bir bakış açısı sağlar.
Daha önce,ampaper5 ile ilişkilendirmek beyin özgü transmembran proteinleri kodlama dört gen (SynDIG1-4) SynDIG aile tespit . Aşırı ekspresyon veya parçalanmış sıçan hipokampal nöronlar SynDIG1 knock-down artar veya azalır, sırasıyla, AMPA-R sinaps boyutu ve sayısı ~ 50% olarak immünositokimya ve elektrofizyoloji kullanılarak tespit5. Biz syndig1 iki korunmuş yan yana transmembran Cys kalıntılar (tüm SynDIG proteinlerde bulunan) bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar, lokalizasyon ve fonksiyon6düzenlemek için palmitoylated olduğunu göstermek için acyl-biotin değişimi (ABE) tsay kullanılmıştır. ABE tsay modifikasyon ve sonraki yakınlık saflaştırma7tarafından korunan sistein biotin değişimi dayanır. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, acyl-PEGyl döviz jel vardiya (APEGS) tsay8,9,10,11,12,hangi yakınlık arınma gerektirmez ve bunun yerine ilgi bir protein için modifikasyon sayısını belirlemek için jel hareketlilik değişiklikleri kullanır. Protokol, fare beyninden gelen ve uygun antikorların bulunduğu endojen membran proteinlerinin araştırılması için tanımlanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HAM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td>
			<td>NOF</td>
			<td>ME-050MA</td>
			<td>MW ~5000 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmalemide (NEM)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>34115</td>
			<td>Highly toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical imager for densitometry</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Sapphire Biomolecular Imager</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (glass)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-27D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>or equivalent equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>580560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acyl-pegyl exchange gel shift assay for quantitative determination of palmitoylation of brain membrane proteins

Postsinaptik yoğunluk (PSD) içindeki sinaptik AMPA reseptörlerinin (AMPA) düzeylerindeki aktiviteye bağlı değişikliklerin öğrenme ve hafıza için hücresel bir mekanizmayı temsil olduğu düşünülmektedir. Palmitoylation ampa-Rs, yardımcı faktörler ve sinaptik iskeleler gibi birçok sinaptik proteinin lokalizasyonunu ve işlevini aktiviteye bağlı bir şekilde düzenler. AMPA'larla ilişki içinde olan ve sinaps gücünü düzenleyen, beyne özgü transmembran proteinlerini kodlayan dört genden oluşan sinaps farklılaşma (SynDIG) ailesini (SynDIG1-4) belirledik. SynDIG1, aktiviteye bağlı eksitatory sinaps gelişimi için önemli olan yan yana-transmembran bölgesinde 191 ve 192 pozisyonlarında bulunan iki sistein kalıntısında palmitoylatedtir. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, asil-PEGyl değişim jel shift (APEGS) tsay, ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak ve fare beyin lysates proteinlerin SynDIG ailesi ile yarar göstermek için.

İlgi proteinine karşı antikorlarla immünoblotlama, HAM'in dahil olmadığı örneklere kıyasla hareket kabiliyetine göre fare beynindeki palmitoylated durumunu (non, tek başına, iki kat, vb.) ortaya çıkarır. Daha önce, SynDIG1'in ABE tsay6kullanarak iki yerde palmitoylated olduğunu göstermiştik; Ancak her iki sitenin de beyin dokusunda modifiye edilip edilmediği belirlenemedi. Burada SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 ve Prrt2'nin fare beyninde palmitoylat oldu...

Watch this Scientific Journal Video about Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins at JoVE.com

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Palmitoylation geri dönüşümlü bir şekilde hedef proteinlerin sistein artıkları için 16 karbon palmitate moiety dahil gerektirir. Burada, fare beyin lysates ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak için, bir biyokimyasal yaklaşım, asil-PEGyl değişim jel vardiya (APEGS) tsay açıklar.

Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Bu biyokimyasal yöntem, uygun bir antikor mevcut olduğu beyinde ifade edilen herhangi bir membran proteininin palmitoylation durumunun belirlenmesini sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, yakınlık arınması gerektirmez ve bunun yerine ilgi bir protein in modifikasyon sayısını belirlemek için jel hareketlilik değişiklikleri kullanır. Beyin dışarı diseksiyon sonra, buz üzerinde bir cam homogenizer homojenizasyon tampon 10 mililitre hemen homojenize.Yaklaşık 12 vuruş kullanarak, 1400 kez G ve dört derece santigrat 15 dakika lysates santrifüj. Supernatant'ı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. 10 mililitre homojenizasyon tamponunda peleti yeniden askıya alın.Yaklaşık altı vuruş kullanarak homojenize edin. Süspansiyonu 710 kez G ve 4 santigrat derece 10 dakika santrifüj edin. Supernatants birleştirin ve 20 dakika boyunca 40, 000 kez G ve dört derece santigrat onları santrifüj.Supernatant atın ve bir pipet ucu ile pelet kırarak ve yukarı ve aşağı pipetleme bir homojenizasyon tampon pelet membran fraksiyonu resuspend. Protein düzeylerini quantitate için ABCA tayini gerçekleştirin. APEGS tayini gerçekleştirmek için, 1,5 mililitrelik bir tüpe 470 mikrolitre tampon A yerleştirin ve yaklaşık 100 ila 200 miligram protein ekleyin.Tüpü sonicate ve sonra 25 santigrat derece ve 10 dakika boyunca 13.000 kez G en az 13.000 kez gaz önsantrak tarafından çözünmez protein ayırın. Solubalize proteini yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. İlk olarak, 55 santigrat derecede 60 dakika boyunca TCEP 25 mikrolitre solubalize protein kuluçka ile disülfür bağları bozabilir.Daha sonra, oda sıcaklığında üç saat boyunca NEM stok çözeltisinin 12,5 mikrolitre sistein ile inkübünle serbest sisteinları bloke edin. Sonra, kloroform metanol yağış süreci başlar. Protein çözeltisini 1,5 mililitrelik tüpten, sallanan kova rotorunda mütevazı bir hızda santrifüj edilebilen polipropilen veya cam tüpe aktarın.Kısaca iki mililitre metanol ve girdap ekleyin. Kısaca bir mililitre kloroform ve girdap ekleyin. Sonra tekrar kısaca deiyonize su ve girdap 1,5 mililitre ekleyin.Gerekirse, tam karıştırma sağlamak için tüp ters. Numuneleri 3000 kez G ve 25 santigrat derecede 30 dakika sallayarak kova rotorunda santrifüj edin. Çözeltinin üst fazını dikkatlice çıkarın ve bir tüpe atın.Metanol 1.5 mililitre ekleyin. Opak protein gözleme parçalamak için dikkatli olmak, tüp nazik ters tarafından hafifçe ama iyice karıştırın. Numuneyi 3000 kez G ve 25 santigrat derecede 10 dakika sallayarak kova rotorunda santrifüj edin.Cam serolojik pipet kullanarak, protein gözleme bozmadan mümkün olduğunca çözeltinin üst fazı kadar çıkarın. Peleti bir mililitre metanolle dikkatlice durulayın ve en az 10 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Kloroform metanol yağışı tamamlandığında, palmitoyl tiyoester bağlantılarının bölünmesine başlanın ve 125 mikrolitrelik tampon A.Transfer'deki protein çökeltisini yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın.Tüpü kısa bir süre sonicate ve sonra 13, 000 kez G veya daha yüksek ve 25 derece santigrat 10 dakika çözünmez malzeme kaldırmak için santrifüj. Yeni 1.5 mililitre tüpler için solubalized protein aktarın ve tampon H veya tampon T.375 mikrolitre ekleyin.Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnekleri kuluçkasonra, kloroform metanol yağış tekrarlayın. Korumasız sisteinlara m-PEG eklemek için, peleti 10 mil veya daha fazla TCEP içeren 100 mikrolitre arabellek A'da yeniden sulayarak başlayın.Daha sonra süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Stok m-PEG 5K çözeltisi 25 mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Sonunda dönüş üzerinde oda sıcaklığında kuluçka.60 dakikalık kuluçkadan sonra, kloroform metanol çökeltisi tekrar gerçekleştirerek unincorporated m-PEG 5K çıkarın. 13,000 kez G ve 25 santigrat derece 10 dakika dan fazla santrifüj. Kalın, flocculent gözleme kaçınarak, daha önce olduğu gibi dikkatle üst faz kaldırın.Metanol bir mililitre ekleyin ve yavaşça ama iyice karıştırın. 13,000 kez G ve 25 santigrat derece 10 dakika dan fazla santrifüj. Dikkatle supernatant çıkarın ve metanol bir mililitre ile pelet durun.Yine, 13,000 kez G ve 25 derece santigrat derece 10 dakika dan fazla santrifüj. Pelet hava kurutultuktan sonra, TCEP veya herhangi bir azaltma maddesi olmadan tampon A 50 mikrolitre resuspend. BCA protein quantitation için çözeltinin 5 mikrolitre rezerv.Nicel likten sonra, uygun miktarda 4x Laemmli örnek arabellek ekleyin. Örneği bir SDS sayfa jeline yükleyin. Batı lekeleme için standart ayırma aktarım ve algılama protokollerini kullanın.SynDIG proteinlerinin palmitoylation durumunu araştırmak için, homojenize fare beyinlerinden P2 membran fraksiyonları APEGS tizine tabi tutuldu. Antikorlarla ayırma ve sondalama SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 ve Prrt2'nin fare beyninde palmitoylated olduğunu gösterdi. Kloroform metanol çökeltisinin amacı, NEM gibi bir kimyasalın protokolün bir sonraki adımına müdahale etmesini önlemektir.Uygun bir kloroform metanol yağış protein kaybını en aza indirirken istenmeyen kimyasalları kaldıracaktır. Bu yöntem, palmitoylation'un mekansal-zamansal düzenlemelerini araştırmak için farklı yaşlardaki farelerden veya farklı beyin bölgelerinden gelen beyin lysates'lerine uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler