Name: in situ hybridization for sipunculus nudus coelomic fluid
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل صندوق العلماء الشباب التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31801034)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة فوجيان، الصين (2016J01161)، وصناديق البحث العلمي في جامعة هواتياو (15BS306) والصندوق المبتكر للدراسات العليا في البحث العلمي بجامعة هواتشياو.

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان ورعاية الحيوان بجامعة هواتشياو على اجراء الحيوان .
1. ريبوسوبر التحضير
<ol><li>تصميم التمهيدي<ol>
<li>افتح برنامج التمهيدي 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). نسخ تسلسل dmrt1 (GenBank: MK182259) في إطار التسلسل.</li>
		<li>تعيين طول التمهيدي (23-25 نقطة في الثانية)، درجة حرا...

<ol>
	<li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li><li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization.">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li><li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes.">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo.">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos.">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li><li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract.">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li><li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences.">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).</li><li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics.">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li><li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721,+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice.">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li><li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract.">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li><li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta.">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li><li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrt1,+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators,+is+required+for+mammalian+testis+differentiation.">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes &amp; Development. 14, 2587-2595 (2000).</li><li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism.">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li><li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy.">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).</li><li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1.">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization.">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).</li></ol>

أظهرت الدراسات السابقة أن ISH مناسبة للكشف عن RNAs متعددة الهدف16،17،18. في هذا البروتوكول، وصفنا طريقة ISH عالية الدقة للكشف عن مرنا في السائل coelomic والتأكيد على ظروف التهجين الأمثل في سيبونكولوس nudus. أظهرت الإشارات الواضحة لـ dmrt1 التي ?...

ISH، وذلك باستخدام مسبار الحمض النووي المسمى للكشف عن الحمض النووي محددة أو تسلسل الحمض النووي الريبي من الفائدة، هو وسيلة مفيدة لوصف نمط التعبير المكاني للجينات المستهدفة في الأنسجة المحفوظة شكليا1،2،3. عادة ، يتم إنشاء تسلسل الهدف عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ثم يستخدم كقالب لتوليف مسبار الحمض النووي الريبي المضاد / الإحساس المسمى بيوريدين-5-ثلاثي الفوسفات digoxigenin. يتم إصلاح العينات وpermeabilized قبل الحضانة مع الريبوسبر. بعد غسل قبالة التحقيق الزائد، يتم تصور التهجين من قبل الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة للأكسجين، وهو القلوية فوسفاتاز مترافق3،,4،,5،,6.
Sipunculus nudus (فيلوم سيبوناولا؛ النظام Sipunculida: Sipunculidae) هو دودة بحرية غير مجزأة، coelomate ومتناظرة ثنائيا7،8. Sipunculus nudus هو نوع عالمي موزعة على نطاق واسع في المياه الساحلية الاستوائية والمعتدلة. كما أنها مورد صيد بحري مهم في جنوب الصين بسبب قيمها الغذائية والطبية العالية9،10. ومع ذلك ، فإن Sipunculus nudus في البيولوجيا الجزيئية لا يزال في مراحله الأولى. لفهم الدور البيولوجي للجينات بشكل كامل ، فإن التحقيق في أنماط تعبير الجينات في قرار خلوي هو أمر مهم بشكل كبير. في الكائن غير النموذجي Sipunculus nudus، لم يتم بعد إنشاء طريقة ISH ، وهي طريقة مثالية للكشف عن أنماط تعبير الجينات. يحتوي السائل الكائي على عدة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الحبيبية ، وخلايا الجر ، والخلايا العمودية ، والخلايا الجرثومية ، والكريات الحمراء ، وما إلى ذلك11. الجنس المزدوج / ماب-3 عامل النسخ ذات الصلة-1(dmrt1),تستخدم كجين تمثيلي في هذه الطريقة, هو منظم النسخ المحفوظة للغاية من تحديد الجنس والتمايز في معظم الأنواع التي تتراوح بين اللافقاريات إلى الثدييات12,,13. في مجموعة من الأنواع (أي الإباحية السوداء، وما إلى ذلك) 14, تم التعبير عن dmrt1 في خلايا سيرتولي, المحيطة الخلايا الانباتية, وظيفتها مماثلة لخلايا التروبهوبلاس سبونكولوس. لذلك ، افترضنا أن dmrt1 من Sipunculus nudus يتم التعبير عنه في الخلايا الغذائية من الحيوانات المنوية ، ونتيجة لطريقة ISH أكدت بوضوح الفرضية.
يصف هذا البروتوكول لأول مرة ISH ، مع تحقيقات antisense/sense ssense /sense ssense ، لتحديد أنماط تعبير مرنا في مسحة السائل الكوافي. يتم توفير ظروف التفاعل الأمثل ، والتي تسمح بتصور حساس للغاية للتعبير مرنا بدقة عالية. يمكن تطبيق طريقة ISH المطورة في أنواع سيباونكوليدا أكثر من Sipunculus nudus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:704px;" width="703">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agarose</td>
			<td style="width:121px;">Biowest</td>
			<td style="width:161px;">111860</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-digoxigenin-AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>5949-29-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid trisodium</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>4/3/6132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCGF60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>12/7/1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethyl pyrocarbonate, DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277073910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I, RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>431788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrophoresis gel imaging</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Universal Hood III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kits</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel-electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory</td>
			<td>DYY-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8/1/9041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>203637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maleic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>110-16-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Biofount</td>
			<td>JT0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraffin film</td>
			<td>Bemis Company, Inc.</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde, PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Proflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pins</td>
			<td>Deli</td>
			<td>16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>plus G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine treated microscope slides</td>
			<td>Liusheng</td>
			<td>VER_A01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRE0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase free water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30538. 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3335399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S. nudus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep serum</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide staining jar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FG010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide storage box</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FBX011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small autoclaved scissors</td>
			<td>Shuanglu</td>
			<td>sku_8330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA polymerases</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10881767001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RES3098T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td>Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial</td>
			<td>HH-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization for sipunculus nudus coelomic fluid

التهجين في الموقع (ISH) هو تقنية مفيدة للغاية لتقديم أنماط التوزيع الخلوي لجينات محددة (على سبيل المثال، مرنا وncRNA) في الأنسجة. دودة sipunculid Sipunculus nudus هو مورد مصائد الأسماك الحاسمة كما أن لديها قيم غذائية وطبية عالية. حاليا ، فإن البحوث على البيولوجيا الجزيئية من Nudus Sipunculus لا تزال في مهدها. الغرض من هذه المقالة هو تطوير طريقة حساسة لتوطين مرنا محددة في السائل الكوليسي سيبونكولوس. يتضمن البروتوكول خطوات مفصلة من ISH ، بما في ذلك antisense المسمى digoxigenin وإعداد الريبوسبر بالإحساس ، وجمع السوائل الكيوموإعداد القسم ، وتهجين الريبوسوم المحدد ، واحتضان الأجسام المضادة ، والتلوين وعلاجات ما بعد التلوين. يتم عرض النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من تجربة ناجحة باستخدام هذه الطريقة. وينبغي أن ينطبق البروتوكول على أنواع سيفونكولا الأخرى أيضا.

ويرد موجز للخطوات التي تنطوي عليها ISH في الشكل 1. تم تصنيع Antisense والريبوسبر اتى للdmrt1 من منتجات PCR تضخيمها من cDNAs السائل coelomic. وتم التحقق من صحة منتجات الـ PCR عن طريق التسلسل المباشر. تم تصنيع Riboprobes باستخدام تي 7 RNA البوليميراز وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة وتقرير سابق<sup ...

Watch this Scientific Journal Video about In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid at JoVE.com

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

يصف هذا البروتوكول نهج التهجين في الموقع الفعال للكشف عن مستويات التعبير mRNA والأنماط المكانية للجينات المستهدفة في السائل الكوليسي.

في الموقع التهجين لسيبونكولوس nudus Coelomic السائل

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

في التهجين في الموقع هو تقنية مفيدة جدا لتقديم أنماط التعبير مررنا و IncRNA من جينات محددة في الأنسجة. هدفنا في هذه المقالة هو تطوير طريقة حساسة للكشف عن توطين مرنا محددة في السائل coelomic من نوكلوس Sipunculus، وهو مورد السمكية الحاسمة. لقد عرضنا النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من تجاربنا الناجحة باستخدام هذه الطريقة.ومن المؤمل أن يتم تطبيق طريقتنا على الأنواع الأخرى من Sipuncula لتحديد أنماط التعبير من مرنا وشركة RNA محددة في السائل coelomic. إصلاح الـ Sipunculus nudus على طاولة التشريح. فتح الجسم من nudus Sipunculus مع مقص autoclaved الصغيرة.ثم جمع ونقل السائل coelomic مع ماصة إلى بولي D-ليسين يعامل شرائح المجهر، وانتشار أقل ما يقال. الهواء الجافة الشرائح لمدة ساعة في 37 درجة مئوية. غسل الشرائح مع DEPC-PBS لمدة ثلاث مرات، خمس دقائق لكل غسل مع التحريض لطيف.استنزاف برنامج تلفزيوني، إضافة محلول البروتينات K على الشرائح لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنزاف محلول البروتينات K. أضف حل PFA على الشرائح لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.استنزاف حل PFA. غسل الشرائح مع DEPC-PBS لمدة ثلاث مرات، خمس دقائق لكل غسل مع التحريض لطيف. استنزاف برنامج تلفزيوني.إضافة 50 ميكرولتر ريبوبروب. إضافة غطاء. وضع الشرائح في مربع الرطب وختم جيدا مع فيلم البارافين.التهجين بين عشية وضحاها في 60 درجة مئوية. اغمر الشرائح في مخزن الغسيل واتركه قائماً حتى تنزلق الأغطية تلقائيًا. اغسل الشرائح مع عازلة الغسيل المُحمّى مسبقاً مرتين عند درجة 65 درجة مئوية، 30 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف.اغسل الشرائح بمحلول SSC المُحمّى مسبقًا مرتين بمعدل 65 درجة مئوية، و30 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. اغسل الشرائح بمحلول MABT مرتين في درجة حرارة الغرفة. 30 دقيقة لكل غسل مع التحريض لطيف.استنزاف MABT. إضافة المخزن المؤقت للحظر. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات.استنزاف العازلة حظر. إضافة الأجسام المضادة، احتضان الشرائح في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. استنزاف حل الأجسام المضادة.اغسل الشرائح بمحلول MABT لمدة أربع مرات، و25 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. استنزاف MABT. إضافة العازلة فوسفاتيز القلوية لمدة ثلاث مرات، خمس دقائق لكل حضانة.إزالة العازلة فوسفاتاتيز القلوية. أضف حل تلطيخ BCIP-NBT. إبقاء الشرائح في الظلام.يختلف وقت التلطيخ من دقائق إلى ساعات، حتى خلال الليل، والذي يعتمد على شدة الإشارة. وينبغي التحقق من حالة تلطيخ أكثر تواترا في بداية تلطيخ. على سبيل المثال، مع فاصل زمني من عدة دقائق، وعدة ساعات على الأكثر من تلطيخ.وينبغي أن يكون وقت التدقيق قصيراً بقدر ما يمكن أن يكون لتجنب إدخال إشارات خلفية عالية بسبب التعرض للضوء. وتظهر الإشارات التمثيلية للتهجين في الموقع. في التهجين في الموقع من السائل النخاعي nudus coelomic مع ريبوبروفب المضادة للحس الذي يستهدف dmrt1 يشير إلى تلطيخ الأرجواني تتركز في الخلايا التروبوبلاست من spermatozeugmata، الشكل 2A وB.Sense ريبوبروفب ل dmrt1 لم يكشف أي إشارة التهجين، الشكل 2C.بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد جدا لكيفية تصور أنماط التعبير من الحمض النووي الريبي الهدف أو IncRNA في السائل coelomic من سيبو.

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

في الموقع التهجين لتوطين دقيقة من النصوص في النباتات

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

المشعة في الموقع التهجين، لتحديد متنوعة أنماط التعبير الجيني في الأنسجة

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

التوقيت كروموسوم النسخ المتماثل جنبا إلى جنب مع نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في الأجنة جبل الجامعة وعلم الأنسجة الخلية مقتبس عن Elasmobranchs البحرية

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...