Name: in situ hybridization for sipunculus nudus coelomic fluid
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00
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Diese Arbeit wurde vom Young Scientists Fund der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), der Natural Science Foundation of Fujian Province, China (2016J01161), den Scientific Research Funds der Huaqiao University (15BS306) und dem Innovative Fund in Scientific Research der Huaqiao University unterstützt.

Das Tierverfahren wurde vom Animal Care and Welfare Committee der Huaqiao University genehmigt.
1. Riboprobe Vorbereitung
<ol><li>Primer-Design<ol>
<li>Öffnen Sie das Programm Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Kopieren Sie die dmrt1-Sequenz (GenBank: MK182259) in das Sequenzfenster.</li>
		<li>Grundierungslänge (23-25 bp), Schmelztemperatur (55-60 °C) und G/C-Gehalt (40-60%). Klicken Sie auf Primer auswählen. HINWEIS: Die für die RNA-So...

<ol>
	<li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li><li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization.">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li><li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes.">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo.">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos.">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li><li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract.">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li><li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences.">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).</li><li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics.">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li><li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721,+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice.">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li><li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract.">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li><li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta.">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li><li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrt1,+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators,+is+required+for+mammalian+testis+differentiation.">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes &amp; Development. 14, 2587-2595 (2000).</li><li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism.">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li><li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy.">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).</li><li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1.">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization.">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).</li></ol>

Frühere Studien zeigten, dass ISH zum Nachweis mehrerer Ziel-RNAs16,17,18geeignet ist. In diesem Protokoll haben wir eine hochauflösende ISH-Methode beschrieben, um die mRNA in coelomischer Flüssigkeit zu detektieren und die optimierten Hybridisierungsbedingungen in Sipunculus nudus hervorzuheben. Die offensichtlichen Signale von dmrt1, die wir beobachteten, zeigten die erfolgreiche Anwendung dieses Protokol...

Die ISH ist mit Hilfe einer markierten Nukleinsäuresonde, um die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz von Interesse zu erkennen, eine nützliche Methode, um das räumliche Expressionsmuster von Zielgenen in morphologisch konservierten Geweben1,2,3zu beschreiben. Normalerweise wird die Zielsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt und dann als Vorlage zur Synthese der antisense/sense RNA-Sonde mit Digoxigenin-Uridin-5'-Triphosphat verwendet. Die Proben werden vor der Inkubation mit Riboprobe fixiert und permeabilisiert. Nach dem Abwaschen der überschüssigen Sonde wird die Hybridisierung durch Immunhistochemie mit einem Anti-Digoxygenin-Antikörper visualisiert, der alkalische Phosphatase-konjugierte3,4,5,6ist.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; Ordnung Sipunculida: Sipunculidae) ist ein unsegmentierter, koeloatischer und bilateral symmetrischer Meereswurm7,8. Sipunculus nudus ist eine kosmopolitische Art, die in tropischen und gemäßigten Küstengewässern verbreitet ist. Es ist auch eine wichtige Meeresfischerei Ressource in Südchina wegen seiner hohen Nährwert und medizinische Werte9,10. Sipunculus nudus in der Molekularbiologie steckt jedoch noch in den Kinderschuhen. Um die biologische Rolle von Genen vollständig zu verstehen, ist die Untersuchung von Genexpressionsmustern bei einer zellulären Auflösung von großem Interesse. Im Nichtmodellorganismus Sipunculus nudusist die ISH-Methode, die eine ideale Methode zum Nachweis der Genexpressionsmuster ist, noch nicht etabliert. Seine koelomische Flüssigkeit enthält mehrere Zelltypen, einschließlich Granulozyten, Urnenzellen, vesikuläre Zellen, Keimzellen, Erythrozyten, etc11. Der Doppelsex/mab-3-bezogene Transkriptionsfaktor-1 (dmrt1), der als repräsentatives Gen bei dieser Methode verwendet wird, ist ein hochkonservierter Transkriptionsregulator für die Geschlechtsbestimmung und -differenzierung bei den meisten Arten, die von Wirbellosen bis zu Säugetieren reichen12,13. In einer Reihe von Arten (z. B. schwarze Porgie, etc.) 14, dmrt1 wurde in den Sertoli-Zellen ausgedrückt, die die Keimzellen umgeben, deren Funktion den Trophoblastenzellen von Sipunculus nudusähnelt. Daher vermuteten wir, dass dmrt1 von Sipunculus nudus in Trophoblastenzellen von Spermatozeugmata exprimiert wird, und das Ergebnis der ISH-Methode bestätigte eindeutig die Hypothese.
Dieses Protokoll beschreibt zum ersten Mal die ISH mit digoxigenin-markierten Antisense/Sense mRNA-Sonden, um mRNA-Expressionsmuster in ihrem coelomischen Flüssigkeitsabstrich zu bestimmen. Es werden optimale Reaktionsbedingungen bereitgestellt, die eine sehr empfindliche Visualisierung der mRNA-Expression bei hoher Auflösung ermöglichen. Die entwickelte ISH-Methode könnte möglicherweise bei mehr Sipunculida-Arten außer Sipunculus nudus angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:704px;" width="703">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agarose</td>
			<td style="width:121px;">Biowest</td>
			<td style="width:161px;">111860</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-digoxigenin-AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>5949-29-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid trisodium</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>4/3/6132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCGF60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>12/7/1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethyl pyrocarbonate, DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277073910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I, RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>431788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrophoresis gel imaging</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Universal Hood III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kits</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel-electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory</td>
			<td>DYY-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8/1/9041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>203637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maleic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>110-16-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Biofount</td>
			<td>JT0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraffin film</td>
			<td>Bemis Company, Inc.</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde, PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Proflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pins</td>
			<td>Deli</td>
			<td>16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>plus G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine treated microscope slides</td>
			<td>Liusheng</td>
			<td>VER_A01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRE0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase free water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30538. 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3335399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S. nudus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep serum</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide staining jar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FG010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide storage box</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FBX011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small autoclaved scissors</td>
			<td>Shuanglu</td>
			<td>sku_8330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA polymerases</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10881767001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RES3098T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td>Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial</td>
			<td>HH-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization for sipunculus nudus coelomic fluid

Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine sehr informative Technik, um zelluläre Verteilungsmuster bestimmter Gene (z. B. mRNA und ncRNA) in Geweben darzustellen. Der Sipunculid-Wurm Sipunculus nudus ist eine wichtige Fischereiressource, da er hohe nährwert- und medizinische Werte hat. Derzeit steckt die Erforschung der Molekularbiologie von Sipunculus nudus noch in den Kinderschuhen. Der Zweck dieses Artikels ist es, eine empfindliche Methode zur Lokalisierung spezifischer mRNA in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu entwickeln. Das Protokoll enthält detaillierte Schritte der ISH, einschließlich Digoxigenin-markierter Antisense- und Sense-Riboprobe-Vorbereitung, coelomischer Flüssigkeitssammlung und Abschnittsvorbereitung, spezifischer Riboprobe-Hybridisierung, Antikörperinkubation, Färbung und Nachfärbungsbehandlungen. Die repräsentativen Ergebnisse eines erfolgreichen Experiments mit dieser Methode werden demonstriert. Das Protokoll sollte auch für andere Sipuncula-Arten gelten.

Abbildung 1ist eine Zusammenfassung der Schritte der ISH dargestellt. Antisense und entsprechende Sense-Ribosonden für dmrt1 wurden aus PCR-Produkten synthetisiert, die aus der coelomischen Flüssigkeit cDNAs verstärkt wurden. Die Echtheit der PCR-Produkte wurde durch direkte Sequenzierung überprüft. Riboprobes wurden mit T7-RNA-Polymerasen nach den Protokollen des Herstellers und einem früheren Bericht4 mit einigen geringfügigen Modifikationen syntheti...

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In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Dieses Protokoll beschreibt einen effektiven In-situ-Hybridisierungsansatz, um die mRNA-Expressionsniveaus und räumlichen Muster von Zielgenen in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu erkennen.

In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In-situ-Hybridisierung ist eine sehr informative Technik, um mRNA- und IncRNA-Expressionsmuster bestimmter Gene in Geweben darzustellen. Unser Ziel in diesem Artikel ist es, eine empfindliche Methode zum Nachweis der spezifischen mRNA-Lokalisierung in koelomischer Flüssigkeit von Sipunculus nudus zu entwickeln, die eine wichtige Fischereiressource ist. Mit dieser Methode haben wir die repräsentativen Ergebnisse unserer erfolgreichen Experimente vorgestellt.Es ist zu hoffen, dass unsere Methode auf andere Sipuncula-Arten angewendet wird, um die Expressionsmuster der spezifischen mRNA und IncRNA in koelomischer Flüssigkeit zu identifizieren. Fixieren Sie den Sipunculus nudus auf dem Seziertisch. Öffnen Sie den Körper des Sipunculus nudus mit einer kleinen autoklaven Schere.Dann sammeln und übertragen Sie die coelomische Flüssigkeit mit Pipette auf Poly-D-Lysin behandelt Mikroskop-Dias, leicht verteilt. Die Rutschen werden eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius lufttrocken getrocknet. Waschen Sie die Dias mit DEPC-PBS dreimal, fünf Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung.Die PBS abtropfen lassen, die Proteinase-K-Lösung bei Raumtemperatur fünf Minuten lang auf die Dias geben. Die Proteinase-K-Lösung abtropfen lassen. Fügen Sie die PFA-Lösung 20 Minuten bei Raumtemperatur auf die Dias.Entleeren Sie die PFA-Lösung. Waschen Sie die Dias mit DEPC-PBS dreimal, fünf Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung. Entleeren Sie die PBS.50 Mikroliter Riboprobe hinzufügen. Fügen Sie einen Coverslip hinzu. Die Dias in die Nassbox stecken und mit Paraffinfolie gut versiegeln.Hybridisieren Sie über Nacht bei 60 Grad Celsius. Tauchen Sie die Dias in den Waschpuffer ein und lassen Sie ihn stehen, bis der Deckelrutsch automatisch abrutscht. Waschen Sie die Dias mit dem vorgeheizten Waschpuffer zweimal bei 65 Grad Celsius, 30 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung.Waschen Sie die Dias mit der vorgeheizten SSC-Lösung zweimal bei 65 Grad Celsius, 30 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung. Waschen Sie die Dias mit der MABT-Lösung zweimal bei Raumtemperatur. 30 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung.Entleeren Sie den MABT. Fügen Sie den Blockierungspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur für drei bis vier Stunden.Entleeren Sie den Sperrpuffer. Fügen Sie den Antikörper hinzu, inkubieren Sie die Dias bei vier Grad Celsius über Nacht. Entleeren Sie die Antikörperlösung.Waschen Sie die Dias mit der MABT-Lösung viermal, 25 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung. Entleeren Sie den MABT. Fügen Sie den alkalischen Phosphatasepuffer dreimal, fünf Minuten pro Inkubation hinzu.Entfernen Sie den alkalischen Phosphatasepuffer. Fügen Sie die BCIP-NBT-Färbelösung hinzu. Halten Sie die Dias im Dunkeln.Die Färbezeit variiert von Minuten bis Stunden, auch über Nacht, was von der Signalintensität abhängt. Der Färbezustand sollte zu Beginn der Färbung häufiger überprüft werden. Zum Beispiel mit einem Intervall von mehreren Minuten und spätestens mit mehreren Stunden der Färbung.Die Prüfzeit sollte so kurz wie möglich sein, um ein hohes Hintergrundsignal aufgrund der Lichteinwirkung zu vermeiden. Die repräsentativen Signale der In-situ-Hybridisierung werden gezeigt. In situ Hybridisierung von Sipunculus nudus coelomic Fluid mit Anti-Sense-Riboprobe, die auf dmrt1 abzielt, zeigt violette Färbung konzentriert in Trophoblast-Zellen der Spermatozeugmata, Abbildung 2A und B.Sense Riboprobe für dmrt1 kein Hybridisierungssignal, Abbildung 2C.Nach dem Anschauen dieses Videos haben Sie ein sehr gutes Verständnis dafür, wie Sie die Expressionsmuster von Ziel-mRNA oder IncRNA in der coelomischen Flüssigkeit von Sipunculus nudus visualisieren können.

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

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The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

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Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

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With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

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Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

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Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

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Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

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Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

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Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

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Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

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