Name: in situ hybridization for sipunculus nudus coelomic fluid
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid at JoVE.com

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단의 젊은 과학자 기금에 의해 지원되었다 (그랜트 번호 31801034), 푸젠 성의 자연 과학 재단, 중국 (2016J01161), 화차오 대학의 과학 연구 기금 (15BS306) 및 Huaqiao 대학의 과학 연구에 대학원생의 혁신적인 기금.

동물 절차는 화차오 대학의 동물 관리 및 복지위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 리보프로브 준비
<ol><li>프라이머 디자인<ol>
<li>프로그램 프라이머 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)를 엽니 다. dmrt1 시퀀스(GenBank: MK182259)를 시퀀스 창에 복사합니다.</li>
		<li>설정 프라이머 길이 (23-25 bp), 용융 온도 (55-60 ° C), 및 G / C 함량 (40-60%). 프라이머 선택을클릭합니?...

<ol>
	<li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li><li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization.">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li><li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes.">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo.">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos.">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li><li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract.">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li><li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences.">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).</li><li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics.">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li><li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721,+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice.">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li><li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract.">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li><li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta.">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li><li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrt1,+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators,+is+required+for+mammalian+testis+differentiation.">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes &amp; Development. 14, 2587-2595 (2000).</li><li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism.">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li><li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy.">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).</li><li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1.">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization.">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).</li></ol>

이전 연구는 ISH가 다중 표적 RNA16,,17,,18을검출하기에 적합하다는 것을 보여주었다. 이 프로토콜에서, 우리는 coelomic 액체에 있는 mRNA를 검출하고 Sipunculus nudus에 있는 최적화된 혼성화 조건을 강조하는 고분해능 ISH 방법을 기술했습니다. 우리가 관찰한 dmrt1의 명백한 신호는 유전자 발현의 검출에서 이 프로토콜의 ?...

ISH는, 표지된 핵산 프로브를 이용하여 관심 있는 특정 DNA 또는 RNA 서열을 검출하고, 형태학적으로 보존된 조직1,,2,,3에서표적 유전자의 공간 발현 패턴을 설명하는 유용한 방법이다. 일반적으로, 표적 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성되고, 디곡시겐린 뇨딘-5'-삼인산염으로 표지된 안티센스/센스 RNA 프로브를 합성하기 위한 템플릿으로 사용된다. 샘플은 리보프로브로 배양하기 전에 고정되고 투과됩니다. 과잉 프로브를 세척 한 후, 혼성화는 알칼리 성 인산염 - 공액3,,4,,5,,6인항 디그산소인 항체를 사용하여 면역 조직 화학에 의해 시각화됩니다.
시분큘러스 누두스(Phylum Sipuncula; 주문 시분쿨리다: 시분큘리대)는 세분화되지 않은, coelomate 및 양측 대칭해양 벌레7,,8. 시분큘러스 누두스는 열대와 온대 연안 해역에 널리 분포하는 국제적인 종입니다. 또한 영양및 약효가 높은 중국 남부의 중요한 해양 어업 자원인9,,10. 그러나, 분자 생물학에 있는 Sipunculus nudus는 아직 초기 단계에 있습니다. 유전자의 생물학적 역할을 완전히 이해하기 위해 세포 해상도에서 유전자 발현 패턴을 조사하는 것이 매우 흥미로합니다. 비모델 유기체인 시분큘러스 누드두스에서는유전자 발현 패턴을 검출하는 이상적인 방법인 ISH 방법이 아직 확립되지 않았다. 그것의 coelomic 액체는 과립구, 항아리 세포, 심포지부 세포, 세균 세포, 적혈구 등11를포함하여 몇몇 세포 모형을 포함합니다. 이중 성/mab-3 관련 전사 인자-1(dmrt1)은 이 방법에서 대표적인 유전자로서 사용되며, 무척추동물에서 포유류에 이르는 대부분의 종에서 성 결정 및 분화의 고도로 보존된 전사 조절기이다dmrt112,,13. 다양한 종(예: 검은 돼지 등) 도 14, dmrt1은 세르톨리 세포에서 발현되었고, 그의 기능은 시분큘러스 누두스의트로포블라스트 세포와 유사하게 발아세포를 둘러싸고 있다. 따라서, 우리는 Sipunculus nudus의 dmrt1이 정자의 trophoblast 세포에서 발현된다는 가설을 세우고, ISH 방법의 결과는 명확하게 가설을 확인하였다.
이 프로토콜은 처음으로 DIgoxigenin 표지된 안티센스/센스 mRNA 프로브를 사용하여 COELOMIC 유체 얼룩에서 mRNA 발현 패턴을 결정하는 ISH를 설명합니다. 최적의 반응 조건이 제공되어 고해상도에서 mRNA 발현의 매우 민감한 시각화가 가능합니다. 개발된 ISH 방법은 잠재적으로 시분큘러스 누두스 이외의 더 많은 시분쿨리다 종에 적용될 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:704px;" width="703">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agarose</td>
			<td style="width:121px;">Biowest</td>
			<td style="width:161px;">111860</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-digoxigenin-AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>5949-29-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid trisodium</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>4/3/6132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCGF60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>12/7/1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethyl pyrocarbonate, DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277073910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I, RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>431788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrophoresis gel imaging</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Universal Hood III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kits</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel-electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory</td>
			<td>DYY-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8/1/9041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>203637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maleic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>110-16-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Biofount</td>
			<td>JT0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraffin film</td>
			<td>Bemis Company, Inc.</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde, PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Proflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pins</td>
			<td>Deli</td>
			<td>16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>plus G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine treated microscope slides</td>
			<td>Liusheng</td>
			<td>VER_A01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRE0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase free water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30538. 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3335399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S. nudus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep serum</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide staining jar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FG010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide storage box</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FBX011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small autoclaved scissors</td>
			<td>Shuanglu</td>
			<td>sku_8330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA polymerases</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10881767001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RES3098T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td>Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial</td>
			<td>HH-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization for sipunculus nudus coelomic fluid

기업에서 혼성화(ISH)는 조직에서 특정 유전자(예를 들어, mRNA 및 ncRNA)의 세포 분포 패턴을 제시하는 매우 유익한 기술이다. 시펀큘리드 웜 시분큘러스 누두스는 영양및 약용 가치가 높기 때문에 중요한 어업 자원입니다. 현재, Sipunculus nudus의 분자 생물학에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다. 이 문서의 목적은 시분큘러스 누두스 coelomic 유체에서 특정 mRNA를 국소화하기 위한 민감한 방법을 개발하는 것이다. 이 프로토콜에는 디곡시제닌 표지된 안티센스 및 센스 리보프로브 제제, coelomic 유체 수집 및 섹션 준비, 특정 리보프로퍼 혼성화, 항체 배양, 착색 및 착색 후 처리를 포함한 ISH의 상세한 단계가 포함됩니다. 이 방법을 사용하여 성공적인 실험에서 얻은 대표적인 결과가 입증됩니다. 프로토콜뿐만 아니라 다른 시분큘라 종에 적용 할 수 있어야합니다.

ISH와 관련된 단계에 대한 요약은 그림 1에나와 있습니다. dmrt1에 대한 안티센스 및 상응하는 감각 리보프로브는 COELOMIC 유체 cDNAs로부터 증폭된 PCR 제품으로부터 합성되었다. PCR 제품의 진위는 직접 시퀀싱을 통해 확인되었습니다. 리보프로브는 제조사의 프로토콜및 이전 보고서4에 따라 T7 RNA 폴리머라제와 약간의 수정을 사용하여 합성되었다. ISH의 ?...

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In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

이 프로토콜은 시분큘러스 누두스 coelomic 유체에서 표적 유전자의 mRNA 발현 수준 및 공간 패턴을 검출하는 situ 혼성화 접근법에 효과적인 설명한다.

시분큘러스 누두스 Coelomic 유체에 대한 시투 혼성화

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

시상 혼성화는 조직에 있는 특정 유전자의 mRNA 및 IncRNA 발현 패턴을 제시하는 아주 유익한 기술입니다. 이 문서에서 우리의 목적은 중요한 어업 자원인 시펀큘러스 나체의 동체 유체에서 특정 mRNA 국소화를 검출하는 민감한 방법을 개발하는 것입니다. 우리는이 방법을 사용하여 성공적인 실험에서 얻은 대표적인 결과를 제시했습니다.그것은 우리의 방법은 coelomic 액체에 있는 특정 mRNA 및 IncRNA의 발현 패턴을 확인하기 위한 그밖 Sipuncula 종에 적용될 것이라는 점을 희망합니다. 해부 테이블에 시펀큘러스 나체를 수정합니다. 작은 오토클레이브 가위로 시펀큘러스 나체의 몸을 엽니다.그런 다음 파이펫으로 코로믹 유체를 폴리-D-리신 처리 현미경 슬라이드로 수집하고 전달하여 약간 퍼집니다. 37도에서 슬라이드를 1시간 동안 공기 건조시합니다. 부드러운 동요로 세척당 3회, 5분간 DEPC-PBS로 슬라이드를 씻으십시오.PBS를 배출하고, 실온에서 5분 동안 슬라이드에 단백질제 K 용액을 추가합니다. 단백질Ae K 용액을 배출합니다. 실온에서 20분 동안 슬라이드에 PFA 솔루션을 추가합니다.PFA 솔루션을 배출합니다. 부드러운 동요로 세척당 3회, 5분간 DEPC-PBS로 슬라이드를 씻으십시오. PBS를 빼내십시오.50 마이크로리터 리보프로브를 추가합니다. 커버슬립을 추가합니다. 젖은 상자에 슬라이드를 넣고 파라핀 필름으로 잘 밀봉하십시오.섭씨 60도에서 하룻밤을 혼성화하십시오. 슬라이드를 세척 버퍼에 담그고 커버슬립이 자동으로 미끄러질 때까지 놓습니다. 예열된 세척 버퍼로 슬라이드를 섭씨 65도에서 2회, 부드러운 교반으로 세척당 30분 간 세척합니다.예열된 SSC 용액으로 슬라이드를 섭씨 65도에서 2회, 부드러운 교반으로 세척당 30분 간 세척합니다. 실온에서 두 번 MABT 솔루션으로 슬라이드를 세척하십시오. 부드러운 동요로 세척당 30 분.MABT를 빼내십시오. 차단 버퍼를 추가합니다. 실온에서 슬라이드를 3~4시간 동안 배양합니다.차단 버퍼를 빼내십시오. 항체를 추가하고 밤새 섭씨 4도에서 슬라이드를 배양합니다. 항체 용액을 배출합니다.부드러운 동요로 세척당 4회, 25분 간 MABT 용액으로 슬라이드를 씻으십시오. MABT를 빼내십시오. 알칼리성 인산염 버퍼를 인큐베이션당 5분 동안 3회 추가합니다.알칼리성 인산염 버퍼를 제거합니다. BCIP-NBT 염색 솔루션을 추가합니다. 슬라이드를 어둠 속에서 유지합니다.염색 시간은 신호 강도에 따라 달라지는 야간에도 분에서 몇 시간으로 다양합니다. 염색 상태는 염색의 시작 부분에서 더 자주 확인해야 합니다. 예를 들어, 몇 분 간격으로, 그리고 스테인링의 최신 시간.검사 시간은 빛에 노출되어 높은 배경 신호를 도입하지 않도록 하는 것만큼 짧아야 합니다. 시투 혼성화의 대표적인 신호가 표시됩니다. dmrt1을 표적으로 하는 안티센스 리보프로브를 가진 시툰큘러스 나체 동체 유체의 시투 혼성화에서 정자의 트로포블라스트 세포에 농축된 보라색 염색을 나타내고, 도 2A 및 B.센스 리보프로브는 혼성화 신호, 도2C를 검출하지 못했다.이 비디오를 시청한 후에는 시펀큘러스 나체의 동체 액에서 표적 mRNA 또는 IncRNA의 발현 패턴을 시각화하는 방법에 대해 매우 잘 이해할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

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형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

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식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...