Name: in situ hybridization for sipunculus nudus coelomic fluid
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid at JoVE.com

Эта работа была поддержана Фондом молодых ученых Национального фонда естественных наук Китая (Грант No 31801034), Фондом естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (2016J01161), Научно-исследовательскими фондами Университета Хуацяо (15BS306) и Инновационным фондом аспирантов в области научных исследований Университета Хуацяо.

Процедура животных была одобрена Комитетом по уходу за животными и благополучию Университета Хуацяо.
1. Препарат Рибозонда
<ol><li>Дизайн праймера<ol>
<li>Откройте программу Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Копируйте последовательность dmrt1 (GenBank: MK182259) в окне последовательн...

<ol>
	<li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li><li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization.">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li><li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes.">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo.">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos.">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li><li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract.">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li><li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences.">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).</li><li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics.">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li><li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721,+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice.">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li><li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract.">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li><li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta.">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li><li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrt1,+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators,+is+required+for+mammalian+testis+differentiation.">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes &amp; Development. 14, 2587-2595 (2000).</li><li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism.">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li><li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy.">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).</li><li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1.">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization.">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).</li></ol>

Предыдущие исследования показали, что ISH подходит для обнаружения нескольких целевых РНК16,,17,,18. В этом протоколе мы описали метод ISH высокого разрешения для обнаружения мРНК в коеломической жидкости и акцента на оптимизированные услов...

ISH, используя помеченные нуклеиновой кислоты зонд для обнаружения конкретной ДНК или РНК последовательность интересов, является полезным методом для описания пространственной экспрессии картины генов-мишеней в морфологически сохраненныхтканей 1,2,3. Как правило, целевая последовательность генерируется полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а затем используется в качестве шаблона для синтеза антисмыслового/чувстве РНК-зонда, помеченного дигоксигенином моридином-5'-трифосфатом. Образцы фиксируются и пронизаны перед инкубации с помощью рибозаза. После смыва избыточного зонда, гибридизация визуализируется иммуногистохимией с помощью антидигоксигенина антитела, которое щелочной фосфатазы-конъюгированных3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; заказ Sipunculida: Sipunculidae) является unsegmented, coelomate и двусторонним симметричным морским червем7,8. Sipunculus nudus является космополитическим видом, широко распространенным в тропических и умеренных прибрежных водах. Он также является важным морским промысловым ресурсом на юге Китая из-за его высокой питательной и целебной ценности9,,10. Тем не менее, Sipunculus nudus в молекулярной биологии все еще находится в зачаточном состоянии. Чтобы в полной мере понять биологическую роль генов, большой интерес представляет исследование моделей экспрессии генов в клеточном разрешении. В немодельном организме Sipunculus nudusметод ISH, который является идеальным методом обнаружения моделей экспрессии генов, до сих пор не установлен. Его кельомная жидкость содержит несколько типов клеток, в том числе гранулоциты, клетки урны, пузырькулярные клетки, зародышевые клетки, эритроциты и т.д.11. Двойной секс / mab-3 связанных транскрипции фактор-1(dmrt1), используется в качестве репрезентативного гена в этом методе, является весьма сохранены транскрипции регулятора определения пола и дифференциации в большинстве видов, начиная от беспозвоночных для млекопитающих12,13. В целом ряде видов (нат., черный порги и т.д.) 14, dmrt1 был выражен в клетках Sertoli, окружающих зародышевые клетки, функция которых похожа на трофобластные клетки Sipunculus nudus. Поэтому мы предположили, что dmrt1 из Sipunculus nudus выражается в трофобластных клетках сперматозiii,-и результат метода ISH четко подтвердил гипотезу.
Этот протокол впервые описывает ISH, с digoxigenin помечены антисмысл / смысл мРНК зондов, чтобы определить мРНК экспрессии моделей в его coelomic мазка жидкости. Обеспечиваются оптимальные условия реакции, которые позволяют очень чувствительновую визуализацию экспрессии мРНК в высоком разрешении. Разработанный метод ISH потенциально может быть применен в более sipunculida видов, кроме Sipunculus nudus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:704px;" width="703">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agarose</td>
			<td style="width:121px;">Biowest</td>
			<td style="width:161px;">111860</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-digoxigenin-AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>5949-29-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid trisodium</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>4/3/6132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCGF60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>12/7/1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethyl pyrocarbonate, DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277073910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I, RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>431788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrophoresis gel imaging</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Universal Hood III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kits</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel-electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory</td>
			<td>DYY-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8/1/9041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>203637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maleic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>110-16-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Biofount</td>
			<td>JT0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraffin film</td>
			<td>Bemis Company, Inc.</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde, PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Proflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pins</td>
			<td>Deli</td>
			<td>16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>plus G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine treated microscope slides</td>
			<td>Liusheng</td>
			<td>VER_A01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRE0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase free water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30538. 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3335399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S. nudus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep serum</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide staining jar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FG010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide storage box</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FBX011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small autoclaved scissors</td>
			<td>Shuanglu</td>
			<td>sku_8330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA polymerases</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10881767001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RES3098T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td>Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial</td>
			<td>HH-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization for sipunculus nudus coelomic fluid

На месте гибридизация (ISH) является очень информативным методом представления клеточных моделей распределения конкретных генов (например, мРНК и ncRNA) в тканях. Сипункулидный червь Sipunculus nudus является важнейшим рыбным ресурсом, поскольку он имеет высокие питательные и лекарственные значения. В настоящее время исследования молекулярной биологии Sipunculus nudus все еще находятся в зачаточном состоянии. Целью данной статьи является разработка чувствительного метода локализации специфической мРНК в сипункулусе нудуса-келомической жидкости. Протокол включает в себя подробные шаги ISH, в том числе digoxigenin помечены антисмысл и смысл riboprobe подготовки, coelomic сбора жидкости и подготовки секции, конкретные гибридизации рибозонда, инкубации антител, окраски и пост-окраски лечения. Доказаны репрезентативные результаты успешного эксперимента с использованием этого метода. Протокол должен быть применим и к другим видам Сипункулы.

Краткое изложение шагов, связанных с ISH, иллюстрируется на рисунке 1. Антисмысловые и соответствующие рибозонды для dmrt1 были синтезированы из продуктов ПЦР, усиленных из кДНС, кокломических жидкостей. Подлинность продуктов ПЦР была проверена путем прямого секвенир?...

Watch this Scientific Journal Video about In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid at JoVE.com

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Этот протокол описывает эффективный подход к гибридизации на месте для определения уровней экспрессии мРНК и пространственных моделей генов-мишеней в коеломной жидкости Sipunculus nudus.

На месте Гибридизация для Sipunculus nudus Coelomic жидкости

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

Гибридизация на месте является очень информативным методом представления моделей экспрессии мРНК и инкРНК конкретных генов в тканях. Наша цель в этой статье заключается в разработке чувствительного метода для обнаружения конкретной локализации мРНК в копомической жидкости Sipunculus nudus, который является важнейшим ресурсом рыболовства. Мы представили репрезентативные результаты, полученные в результате наших успешных экспериментов с использованием этого метода.Есть надежда, что наш метод будет применяться к другим видам сипункулы для выявления экспрессии моделей конкретной мРНК и инкРНК в копомической жидкости. Закрепить sipunculus nudus на столе для вскрытия. Откройте корпус Sipunculus nudus небольшими автоматическими ножницами.Затем соберите и перенесите келомную жидкость с пипеткой на поли-D-лизин обработанные микроскопом слайды, равномерно распределив их. Воздух-сухие горки в течение часа при 37 градусов по Цельсию. Вымойте горки с DEPC-PBS в течение трех раз, пять минут за стирку с нежным возбуждением.Слейте pbs, добавьте раствор протеиназы K на слайдах в течение пяти минут при комнатной температуре. Слейте раствор протеиназы K. Добавьте раствор PFA на слайдах в течение 20 минут при комнатной температуре.Слейте решение PFA. Вымойте горки с DEPC-PBS в течение трех раз, пять минут за стирку с нежным возбуждением. Слейте воду PBS.Добавьте 50 микролитров рибопробе. Добавьте обложку. Положите слайды во влажную коробку и хорошо запечатать парафиновой пленкой.Гибридизировать ночь при 60 градусах по Цельсию. Погрузите слайды в буфер стирки и дайте ему стоять до тех пор, пока крышки не соскальзывают автоматически. Вымойте горки с разогретым буфером мытья в течение двух раз при 65 градусов по Цельсию, 30 минут на стирку с нежным возбуждением.Вымойте горки с разогретым раствором SSC два раза при 65 градусах Цельсия, 30 минут на стирку с нежным возбуждением. Вымойте горки раствором MABT два раза при комнатной температуре. 30 минут за стирку с нежным возбуждением.Слейте MABT. Добавьте блокирующий буфер. Инкубировать горки при комнатной температуре в течение трех-четырех часов.Слейте блокирующий буфер. Добавить антитела, инкубировать слайды при четырех градусах по Цельсию в одночасье. Слейте раствор антител.Вымойте горки раствором MABT четыре раза, 25 минут на стирку с нежным возбуждением. Слейте MABT. Добавьте щелочный буфер фосфатазы в течение трех, пяти минут на инкубацию.Удалите щелочный буфер фосфатазы. Добавьте решение для окрашивания BCIP-NBT. Держите горки в темноте.Время окрашивания варьируется от нескольких минут до нескольких часов, даже в ночное время, что зависит от интенсивности сигнала. Состояние окрашивания следует чаще проверять в начале окрашивания. Например, с интервалом в несколько минут, и несколько часов не по крайней мере окрашивания.Время проверки должно быть как можно меньше, чтобы избежать введения высокой фоновой сигнализации из-за воздействия света. Показаны репрезентативные сигналы гибридизации на месте. На месте гибридизации Sipunculus nudus coelomic жидкости с анти-чувство рибопроб, что цели dmrt1 указывает фиолетовый окрашивания сосредоточены в трофибластных клеток сперматозоидов, рисунок 2A и B.Sense riboprobe для dmrt1 не обнаружили каких-либо гибридизации сигнала, цифра 2C.После просмотра этого видео, вы бы очень хорошее понимание того, как визуализировать выражения моделей целевой мРНК или IncRNA в целомической жидкости Sipunculus nudus.

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Флуоресценция На месте Гибридизации (FISH) протокола в человеческой сперме

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

В гибридизация для точной локализации стенограммы в растениях

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Радиоактивный На месте Гибридизации для обнаружения разнообразных шаблонов экспрессии генов в ткани

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Обнаружение вирусной РНК с помощью флуоресцентного<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Анализ одноклеточных транскрипции гена РНК-флуоресцентный<em&gt; В Situ</em&gt; Гибридизация (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Хромосома Репликация времени в сочетании с Флуоресцентные<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Всего горы РНК Флуоресцентные<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

РНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизации эмбрионов Всего в гору и сотовых гистологии адаптированный для морских хрящевых рыб

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...