Name: in situ hybridization for sipunculus nudus coelomic fluid
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 31801034), Fujian Eyaleti, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (2016J0161), Huaqiao Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonları (15BS306) ve Lisansüstü Ler Yenilikçi Fonu tarafından desteklenmiştir.

Hayvan prosedürü Huaqiao Üniversitesi Hayvan Bakım ve Refah Komitesi tarafından onaylandı.
1. Riboprobe hazırlık
<ol><li>Astar tasarımı<ol>
<li>Programı Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/) açın. Dmrt1 sırasını (GenBank: MK182259) sıra penceresine kopyalayın.</li>
		<li>Astar uzunluğu (23-25 bp), erime sıcaklığını (55-60 °C) ve G/C içeriğini (%40-60) ayarlayın. Astar Seç'itıklatın. NOT: RNA sondası için gereken m...

<ol>
	<li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li><li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization.">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li><li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes.">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo.">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos.">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li><li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract.">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li><li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences.">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).</li><li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics.">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li><li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721,+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice.">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li><li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract.">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li><li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta.">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li><li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrt1,+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators,+is+required+for+mammalian+testis+differentiation.">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes &amp; Development. 14, 2587-2595 (2000).</li><li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism.">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li><li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy.">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).</li><li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1.">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization.">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).</li></ol>

Önceki çalışmalar ISH birden fazla hedef RNA16,17,,18tespit için uygun olduğunu gösterdi . Bu protokolde, coelomik sıvıdaki mRNA'yı saptamak ve Sipunculus nudus'ta optimize edilmiş hibridizasyon koşullarını vurgulamak için yüksek çözünürlüklü ish yöntemi ni tanımladık. Gözlemlediğimiz dmrt1 sinyalleri gen ekspresyonunun saptanmasında bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanmas...

ISH, ilgi belirli DNA veya RNA dizisi tespit etmek için etiketli bir nükleik asit probu kullanarak, morfolojik olarak korunmuş dokularda hedef genlerin mekansal ifade deseni tanımlamak için yararlı bir yöntemdir1,2,3. Normalde, hedef sırası polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tarafından oluşturulur ve daha sonra antisense / sense RNA probu digoksigenin uridine-5'-trifosfat ile etiketlenmiş sentezlemek için şablon olarak kullanılır. Örnekler riboprob ile kuluçkadan önce sabitlenir ve permeabilize edilir. Aşırı sonda yıkadıktan sonra, hibridizasyon bir anti-digoksijenin antikor kullanılarak immünohistokimya ile görselleştirilmiş, hangi alkali fosfataz konjuge3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; sipariş Sipunculida: Sipunculidae) segmentsiz, coelomate ve çift taraflı simetrik deniz solucanı7,8. Sipunculus nudus, tropikal ve ılıman kıyı sularında yaygın olarak dağılmış kozmopolit bir türdür. Aynı zamanda yüksek besin ve tıbbi değerleri nedeniyle güney Çin'de önemli bir deniz balıkçılık kaynağı9,10. Ancak moleküler biyolojide Sipunculus nudus henüz emekleme aşamasındadır. Genlerin biyolojik rolünü tam olarak anlamak için, hücresel çözünürlükte genlerin ifade kalıplarının araştırılması büyük ilgi çekicidir. Model olmayan organizma Sipunculus nudus'tagenlerin ekspresyon kalıplarını tespit etmek için ideal bir yöntem olan ISH yöntemi henüz kurulmamıştır. Onun coelomic sıvı granülositler, vazo hücreleri, vesiküler hücreler, mikrop hücreleri, eritrositler, vb11dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri içerir. Çift cinsiyet / mab-3 ilgili transkripsiyon faktörü-1(dmrt1),bu yöntemde temsili bir gen olarak kullanılan, omurgasızlar memeliler arasında değişen çoğu türde cinsiyet tayini ve farklılaşma son derece korunmuş transkripsiyon düzenleyici12,13. Çeşitli türlerde (örn. siyah porgy, vb.) 14, dmrt1 Sertoli hücrelerinde ifade edildi, germinal hücreleri çevreleyen, olan fonksiyonu Sipunculus nudustrophoblast hücrelerine benzer . Bu nedenle Sipunculus nudus'un dmrt1'inin spermatozeugmatanın trofoblast hücrelerinde ifade edilm1ve ISH yönteminin sonucu hipotezi açıkça doğrulamıştır.
Bu protokol ilk kez ish açıklar, digoksigenin etiketli antisense / sense mRNA probları ile, onun coelomic sıvı yayma mRNA ifade desenleri belirlemek için. MRNA ifadesinin yüksek çözünürlükte çok hassas bir şekilde görüntülenmesiiçin en uygun tepki koşulları sağlanır. Geliştirilen ISH yöntemi sipunculus nudus dışında daha fazla Sipunculida türünde potansiyel olarak uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:704px;" width="703">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Agarose</td>
			<td style="width:121px;">Biowest</td>
			<td style="width:161px;">111860</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-digoxigenin-AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>5949-29-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid trisodium</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>4/3/6132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCGF60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>12/7/1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethyl pyrocarbonate, DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277073910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I, RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>431788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrophoresis gel imaging</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Universal Hood III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kits</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel-electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory</td>
			<td>DYY-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8/1/9041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>203637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maleic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>110-16-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Biofount</td>
			<td>JT0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraffin film</td>
			<td>Bemis Company, Inc.</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde, PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Noxious substance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Instrument</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Proflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pins</td>
			<td>Deli</td>
			<td>16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>plus G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine treated microscope slides</td>
			<td>Liusheng</td>
			<td>VER_A01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRE0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase free water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30538. 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3335399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S. nudus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep serum</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide staining jar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FG010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide storage box</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FBX011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small autoclaved scissors</td>
			<td>Shuanglu</td>
			<td>sku_8330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA polymerases</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10881767001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RES3098T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td>Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial</td>
			<td>HH-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization for sipunculus nudus coelomic fluid

In situ hibridizasyon (ISH), dokularda belirli genlerin (örneğin, mRNA ve ncRNA) hücresel dağılım modellerini sunmak için çok bilgilendirici bir tekniktir. Sipunculid solucanı Sipunculus nudus yüksek besin ve tıbbi değerlere sahip olduğu için önemli bir balıkçılık kaynağıdır. Şu anda Sipunculus nudus moleküler biyolojisi üzerine yapılan araştırmalar henüz emekleme aşamasındadır. Bu makalenin amacı Sipunculus nudus coelomik sıvıda spesifik mRNA lokalizasyonu için hassas bir yöntem geliştirmektir. Protokol, digoksigenin etiketli antisense ve sense riboprob hazırlanması, coelomik sıvı toplama ve kesit hazırlama, spesifik riboprob hibridizasyonu, antikor inkübasyonu, renklendirme ve renklendirme sonrası tedaviler de dahil olmak üzere ISH'in ayrıntılı adımlarını içerir. Bu yöntem kullanılarak başarılı bir deneyden elde edilen temsili sonuçlar gösterilmiştir. Protokol diğer Sipuncula türleri için de geçerli olmalıdır.

ISH'de yer alan adımların bir özeti Şekil 1'degösterilmiştir. Dmrt1 için antisense ve buna karşılık gelen duyu riboprobları, coelomik sıvı CD'lerinden güçlendirilmiş PCR ürünlerinden sentezlenmiştir. PCR ürünlerinin orijinalliği doğrudan sıralama ile doğrulandı. Riboprobes üreticinin protokollerine göre T7 RNA polimerazlar kullanılarak sentezlenmiş ve bazı küçük değişiklikler ile önceki bir rapor4. ISH'nin temsili sinyalle...

Watch this Scientific Journal Video about In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid at JoVE.com

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Bu protokol, Sipunculus nudus coelomic sıvısındaki mRNA ekspresyon düzeylerini ve hedef genlerin mekansal desenlerini saptamak için yerinde hibridizasyon yaklaşımını etkin bir şekilde tanımlar.

Sipunculus nudus Coelomic Sıvı için yerinde Hibridizasyon

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In situ hibridizasyon dokularda belirli genlerin mRNA ve IncRNA ifade desenleri sunmak için çok bilgilendirici bir tekniktir. Bu makaledeki amacımız, önemli bir balıkçılık kaynağı olan Sipunculus nudus'un coelomik sıvısında spesifik mRNA lokalizasyonunu saptamak için hassas bir yöntem geliştirmektir. Başarılı deneylerimizden elde ettiğimiz temsili sonuçları bu yöntemi kullanarak sunduk.Yöntemimizin coelomik sıvıda spesifik mRNA ve IncRNA'nın ekspresyon desenlerini belirlemek için diğer Sipuncula türleri için de geçerli olacağı umulmalıdır. Diseksiyonu masasındasip nülleri düzeltin. Küçük otoklavlı makas ile Sipunculus nudus gövdesini açın.Daha sonra pipetli coelomik sıvıyı toplayıp poli-D-lizin letedavi edilen mikroskop slaytlarına aktarın, hafifçe yayılır. 37 santigrat derece bir saat boyunca slaytlar hava kuru. Slaytları DEPC-PBS ile üç kez, yıkama başına beş dakika hafif ajitasyonla yıkayın.PBS drenaj, oda sıcaklığında beş dakika boyunca slaytlar üzerinde proteinaz K çözeltisi ekleyin. Proteinaz K çözeltisini boşaltın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca slaytlara PFA çözeltisi ekleyin.PFA çözeltisini boşaltın. Slaytları DEPC-PBS ile üç kez, yıkama başına beş dakika hafif ajitasyonla yıkayın. PBS'yi boşaltın.50 mikrolitre riboprob ekleyin. Bir kapak kaydırış ekleyin. Islak kutuya slaytlar koyun ve parafin film ile iyi mühür.Bir gecede 60 santigrat derece melezleştirin. Slaytları yıkama tamponuna batırın ve kapak kayması otomatik olarak kapanana kadar bekletin. 65 derece santigrat iki kez önceden ısıtılmış yıkama tampon ile slaytlar yıkayın, nazik ajitasyon ile yıkama başına 30 dakika.65 santigrat derece, yıkama başına 30 dakika nazik ajitasyon ile iki kez önceden ısıtılmış SSC çözeltisi ile slaytları yıkayın. Slaytları MABT çözeltisi ile oda sıcaklığında iki kez yıkayın. Nazik ajitasyon ile yıkama başına 30 dakika.MABT'yi boşaltın. Engelleme arabelleği ekleyin. Slaytları oda sıcaklığında 3-4 saat kuluçkaya yatırın.Engelleme arabelleği boşaltın. Antikor ekleyin, slaytları bir gecede dört derece santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Antikor çözeltisini boşaltın.Slaytları MABT çözeltisi ile dört kez, yıkama başına 25 dakika hafif ajitasyonla yıkayın. MABT'yi boşaltın. Üç kez alkali fosfataz tampon ekleyin, kuluçka başına beş dakika.Alkali fosfataz tampon kaldırın. BCIP-NBT boyama çözeltisini ekleyin. Slaytları karanlıkta tutun.Boyama süresi sinyal yoğunluğuna bağlı olarak gece boyunca bile dakika ile saat arasında değişir. Boyama nın başlangıcında boyama durumu daha sık kontrol edilmelidir. Örneğin, birkaç dakika aralığı ile ve boyama en geç birkaç saat.Kontrol süresi ışığa maruz kalma nedeniyle yüksek arka plan sinyali tanıtmak önlemek için olabilir kadar kısa olmalıdır. In situ hibridizasyonun temsili sinyalleri gösterilir. Sipunculus nudus coelomik sıvının dmrt1 hedefleyen anti-sense riboprobe ile yerinde hibridizasyonunda spermatozeugmata, şekil 2A ve B.Sense riboprobe for dmrt1'in trofoblast hücrelerinde yoğunlaşan mor boyama, şekil 2A ve B.Sense rinoprobu herhangi bir hibridizasyon sinyali, şekil 2C saptanmadı.Bu videoyu izledikten sonra, sipunculus nudus coelomic sıvı hedef mRNA veya IncRNA ifade kalıpları görselleştirmek için nasıl çok iyi bir anlayışa sahip olacaktır.

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radyoaktif In situ</emDoku Çeşitli Gen Patterns Saptayan> Hibridizasyon

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...