Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

非常感谢克劳斯-阿明·纳夫教授和桑德拉·戈培尔博士（德国戈廷根实验医学研究所）为Nex-Cre小鼠提供友好服务。此外，我们感谢我们的视频团队尤努斯·迪基奇和鲁本·维斯纳为这篇文章录制和处理JoVE视频。此外，非常感谢克里斯汀·克劳森的画外音和金伯利·安妮去校对手稿。
研究结果在波鸿鲁尔大学获得，录像在不来梅大学录制。
这项工作由德国福特公司（DFG，德国研究基金会）资助 - Projektnummer 122679504 - SFB 874 和 DFG MA 4692/3-2。

作者没有什么可透露的。

近十年来，使用光来操纵神经元信号一直是人们的首选方法。自2005年以来，关于开发新光遗传学工具的文章数量有,,,,,,4、6、8、14、49、50、51，以及利用这些工具研究脑回路49,50,518,14的研究21、23、40、43、52，数量急剧增加。43,5262340一方面，随着注射光遗传学工具、植入变异、转基因小鼠线和行为实验的多样性，实验的可能性是多方面的和无限的。另一方面，在选择实验条件时出现缺陷的可能性非常大，实验非常具体，往往难以与其他研究比较。
关键步骤 此协议的一个重要关键步骤是适当的规划。光遗传学工具的选择应与科学问题相匹配。是否只需要操作神经元或突触的整体活动？然后商业提供的工具，如ChR2 21，25，27和21,25,27拱门37是一个不错的选择。但除此之外，如果一个特殊的神经递质系统，甚至一个单一的受体纵，一个单独的受体幻想往往是更好的选择,3 ， 6 。几个受体与GPCRs的嵌合，所谓的Opo-XRs，和生产他们的指南已经可用4,4，50。除了选择光遗传学工具外，鼠标线与行为实验相结合也至关重要。不同的背景菌株，例如C57Bl/6和BALB/cByJ，在某些方面显示不同的行为表型53，54。53,54C57Bl/6小鼠的基线焦虑程度较低，可用于致焦虑性操作，而BALB/cByJ则表现出较高的焦虑水平，因此对抗焦虑药物更敏感。此外，这些背景菌株的转基因变异也可能在他们的表型48中有所不同。随着特定启动子与光遗传学工具和转基因小鼠线的适当组合，几乎每一个所需的细胞群体都可以成为目标。
手术过程中的关键步骤是瞄准正确的位置。在小鼠大脑图集的帮助下，可以建立前后轴和中侧轴的适当坐标，并可建立结构深度45。在现实中，每个头骨的形态和大小略有不同。因此，F因子46 调整立体定向坐标是非常重要的，在立体定向手术过程中正确的鼻子和耳朵固定也非常重要。如果鼠标头倾斜，注射管将不能瞄准所需的感兴趣区域。
此外，注射管的直径也至关重要。如果它太小，没有病毒可以释放到组织，如果它太宽，卡努拉将泄漏病毒溶液的方式到感兴趣的区域。如果植入的光纤直接在目标区域上方终止，则上述皮层区域中的病毒表达并不重要。但是，如果植入物被放置在其他区域之上以刺激轴孔端子，上皮层区域的轴子也会被光激活并伪造获得的数据。例如：IL区域和前利（PrL）区域都项目到基底杏仁核55，56，但有完全不同的功能55,和作用，在调制焦虑26，57。,57如果植入物被放置在杏仁核上方，以激活来自IL区域的轴孔端子，并在注射过程中病毒溶液也被放置在PrL由于注射管的错误，也激活轴孔终端从PrL的风险非常高。
在准备头骨固定植入物时，底的是底盖和粘结的稀疏使用对于可靠和持久的固定至关重要。如果 2 组分粘附系统没有薄应用，牙科水泥可能会在几天或几周后从头骨中分离出来。此外，在固定植入物之前，头骨必须完全干燥，否则水泥无法正确附着在头骨上。
此协议的行为部分也存在关键步骤。首先，迷宫的建设是非常重要的。在每个行为设置中，关于大小和形式的文献中都存在几个变种，以及程序本身58、59、60。,59,60选择使数据具有可比性和可重复性的变体非常重要。此外，使用鼠标线的特殊要求应考虑到43，48。43,在EPM的代表性数据中，可以看到几只Nex-Cre小鼠从迷宫中摔下来或滑落数次（图2b）。对于这些老鼠来说，一个在张开双臂周围有小墙的迷宫是更好的选择。
其次，保持所有外部房间条件不变至关重要，否则不同群体的小鼠将一点也不可比。在这方面，选择实验时间作为实验设置空置且实验者始终存在的时间非常重要。此外，还应考虑建筑物内的事件，如建筑工程、测试任何系统（火警）或鼠标设施的清洁日，以避免对获得的数据造成干扰。
最后，处理和住房条件对于行为实验至关重要。进行植入时，由于其他小鼠有受伤的风险，需要单一安置小鼠。为了确保组之间的良好可比性和一组内的错误率较低，每只鼠标都需要具有相同的保持架大小和富集。对于焦虑相关的实验，单壳有一些优点，因为单体安置的雄性小鼠表现出较低的基线焦虑水平，较少的变异，他们的焦虑水平，和较少抑郁症状的症状15，16。,16由于小鼠之间的等级关系，雄性小鼠的焦虑程度可能大相径庭。除了外壳，持续和平等处理所有小鼠和组也很重要。抓住鼠标连接植入物上的光纤维是非常紧张的。因此，此过程对于每只鼠标必须相同，这意味着相同的技术和相同的实验者。此外，在等候的笼子里，这是为了平息鼠标从紧张的连接程序，也需要有同等的条件，在持续时间，垃圾和位置迷宫。鼠标设施内的处理对于以后的行为性能也至关重要。实验和控制动物不应该在不同的日子或由不同的人清洗，因为这也对老鼠有压力。此外，清洁日不应是实验日，以避免行为差异。
故障 排除 在协议期间可能会出现几个问题。例如，在立体定向手术期间在头骨中钻一个整体可能会损害血管。通常，发生强出血，特别是在布雷格玛和羔羊之间。如果发生这种情况，不要试图用棉棒止血，因为它们往往延长更多的出血出容器，因为他们的吸收性，而是直接冲洗与NaCl。
病毒溶液的压力注入也可能发生。在这种情况下，可能是从毛刺孔或脑组织的疤痕，准膜堵塞了管尖。在这种情况下，在不改变 x 轴或 y 轴的情况下慢慢取出管黄，并使用钳子取出刀尖前部的 1-2 mm。在再次降低管头之前，通过施加少量压力来测试功能，看看病毒是否从管尖中出来。为避免便秘，请以恒定的速度降低卡努拉，直到达到注射侧最深的深度时，不要停止运动。如果去除太多的管尖，直径太大，管杆将损坏组织，同时应用病毒的风险将增加。因此，请确保仅小心地拆下尖端堵塞的部分。
在行为实验中，在视频跟踪软件（例如，Ethovision XT）中设置实验可能会导致问题。例如，如果光输出不能正常工作，这可能是由于几个原因。在打开 Ethovision XT 之前，脉冲器必须打开、编程和启动。需要在"实验设置"（步骤 3.2.2.4）中正确选择硬件。如果选择了错误的 IO-Box 或"服装硬件"以外的任何内容，则由 Ethovision 无法控制 Pulser 设备。如果光输出测试成功，但"试用控制设置"中的编程光协议在采集期间不起作用，则子规则或子规则引用可能定位不正确或条件和操作不清楚。例如：引用是否属于正确的子规则？引用是否编程正确（例如，执行子规则有多频繁）？
此外，在"检测设置"期间，动物可能会受到充分跟踪，但在采集过程中，可能会发现未发现动物的样本。在这种情况下，请检查实验室的照明是否已更改，或者是否出现迷宫中不需要的阴影。迷宫的整个底部必须具有相同的颜色，因为设置将仅适用于一个特定的组合。如果出于任何原因无法避免不同的底部颜色或阴影，请定义迷宫最黑暗部分的检测设置。
要在获取第一批动物后更改任何设置，请勿在已使用设置中应用这些更改。复制它们以调整它们。这也意味着已记录的审判不再对数据分析有效。在这种情况下，使用原始设置记录此实验组的所有动物，然后创建一个新的实验，其中录制的视频进行分析，而不是实时跟踪。在这个"从视频"实验中，几个设置可用于分析，而不会丢失动物之间的可比性，甚至数据。
限制和未来应用 这种在自由移动的动物中用光遗传学操纵行为的方法还包括局限性。在手术过程中，两个植入物的接近受到限制。对于双植入，两个植入物之间的距离必须最小为装置的宽度才能容纳植入物。该装置需要将第二个植入物降低到毛刺孔中，而第一个植入物已经固定。解决这个解决方案可能是一个角度植入，其中玻璃纤维的尖端可以非常接近，而头骨上方的陶瓷铁杉有更大的距离23，55，56，57，62，63。23,55,56,57,62,63角度植入的缺点是光线扩散。当纤维尖端倾斜而不是从直上方时，刺激区域是不同的。在两个目标区域接近的情况下，需要考虑光刺激的改变位置。
在行为实验中，迷宫的构造可能会干扰与动物相连的光缆。一些行为测试，如浅暗框，包含一个室内区域64，65，和其他迷宫包含隔间，鼠标需要进入。64,65无法使用此设置执行此类实验。或者，无线系统可能是一个选项22，26，66。22,26,66但幸运的是，一些迷宫，如巴恩斯迷宫，可以安排这样的方式，老鼠能够进入相关的隔间67。
除了那些有封闭区域，迷宫太宽也会引起问题。迷宫区域越大，电缆越长，才能让动物进入迷宫中的每一个位置。必须注意，动物不能踩到电缆或抓住它，咬它。其解决方案可能是将冗余电缆卷起来的构造。缺点是展开电缆的阻力对于鼠标来说很难。这种解决方案更适合老鼠。另一种可能的选择是提前进行光刺激，而不是在实验期间，当然，这只有在因光刺激而产生长期影响的情况下才可行。
与现有/替代方法的比较 替代方法是在行为8、18期间进行化学或电刺激。化学激动剂或拮抗剂能够通过特定的受体激活或沉默神经元，也可以操纵单神经递质系统38，68。38,一方面，受体特异性是相当高的化学品，因为特定的激动剂或拮抗剂只激活某些受体39。另一方面，同一神经递质组受体亚型的特异性往往不足。大多数化学物质结合到至少两个子类型，具有不同的概率69。此外，只要具有相同的受体类型，化学物质就不能区分神经元细胞类型。除此之外，与光遗传学相比，时间和空间分辨率对于化学操作来说很差。激动剂或拮抗剂通常口头施用35或通过全身注射57，70。57,70如果这种化学物质的输液直接在脑组织中进行，效果看起来比口服应用快，但时间尺度仍然比光刺激慢。由于施用的化学物质在大脑中扩散，并不特定于神经元类型或大脑区域，因此不可能操纵特定的脑回路。
电刺激比化学刺激9，14具有更高的时间分辨率。神经元组织内的扩散小于化学刺激，空间分辨率优于化学刺激。然而，电刺激缺乏具体解决不同神经元细胞类型或受体类型的可能性，因为靠近电极的每个神经元都会对电刺激作出反应。
自由移动小鼠行为的替代方法是例如脑切片中的电生理记录，其中单个神经元或轴突可以用光遗传学进行调节，通过记录电极6，71,来测量引出的效果。体外实验提供了研究光遗传学刺激的分子和细胞基础的可能性，但有其局限性，即缺乏来自其他大脑区域的内在连接和输入。另一种选择是将光遗传学与多光子成像1，72,结合使用。在这种情况下，小鼠的头部固定，可以麻醉或清醒，以解决简单的任务。
为了进行成功的光遗传学实验，现在有各种各样的工具和应用。光遗传学工具的选择和行为设置对于回答特定的研究问题至关重要。如果选择工具和实验的是正确的组合，光遗传学允许对具有高时空分辨率的神经元回路进行前所未有的深入研究。这将有助于了解和发展新的精神疾病和认知治疗策略。

中枢神经系统神经元回路的调节及其行为结果对于理解大脑如何工作非常重要，特别是在精神疾病和认知任务（如学习和记忆）中。使用光遗传学，单细胞或细胞群到整个电路可以通过光进行调节。常见的光遗传学工具，如 Channelrhodopsin2 （ChR2） 或 Archaerhodopsin （Arch） 能够激活或沉默神经元，或增加或抑制发射机释放在轴突终端投射到不同的大脑区域1，,2，,3，,4.然而，Arch需要谨慎使用，因为它表明，它在预突触终端的激活增加自发的发射机释放5。Arch 是一种向外校正质子泵，可更改细胞内的 pH 值。这种碱性环境诱导钙流入，并增强发射机释放5。为了专门调节细胞内信号通路，受体嵌合体由光可作用的光遗传学工具组成，如罗多普辛或锥蛋白酶，结合一个适当的G蛋白耦合受体，可以产生6，7，8。,7,8在过去十年中，可用的光遗传学工具的数量和变异显著增加。
光遗传学的目的是在行为过程中操纵神经元回路。例如，光遗传学能够测量急性行为变化，如焦虑行为的变化。光遗传学工具通过病毒载体传递到大脑的目标区域。在特殊启动剂和增强剂（或Cre-loxP系统）的帮助下，可以确保光遗传学工具表达的细胞类型特异性（图1A）。有几个转基因小鼠线只表达特定细胞类型的Cre-重组酶酶。例如，Nex-Cre小鼠在Nex-promotor10的控制之下，在皮层和海马的金字塔神经元中表达Cre-重组酶。10这种酶能够反转DNA序列，这些序列由loxP边11的侧翼。因此，双层光遗传学工具的DNA序列，这是倒置和侧翼的loxP边，只能由拥有Cre-重组酶的神经元，而不是由其他神经元类型12，13,转录。在Nex-Cre小鼠的情况下，光遗传学工具将只在金字塔神经元中表达。然后，通过直接在感兴趣区域上方的光纤进行长期植入，实现某些大脑区域的光刺激。然后，动物可以耦合到合适的光源，并在几乎各种行为测试中自由行为。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> 图1：注射和植入。A） 用于 ChR2-YFP 的 Cre-loxP 系统。双絮光遗传学工具被包装在腺相关病毒（AAV）中，注射到脑组织。 B） 病毒注射的下垂视图，将光神经元接口植入/植入mPFC的IL区域。注射和植入都是从上面完成的。将显示所有感兴趣的区域，IL、BLA 和 DRN。 C） 植入光纤、套筒和光源的详细视图。 D） 从200μm光纤维在灰质脑组织中传播蓝色和红色激光刺激（Yizhar等人，2011年）。蓝光在最大时扩散到组织内0.5毫米，红灯约1毫米。颜色编码：红色 50%，黄色 10%，绿色 5%，蓝色 1%，如果光线到达此区域。 E） 用200μm光纤在左IL正上方的单方植入的冠状视图。IL 区域每个半球的宽度为 0.25 mm，深度为 0.2 mm。蓝色和红色的灯泡是5%的光扩散的板子，从Yyzhar等人转移到正确的大小。LoxP： X-over P1 的位点;ChR2： 通道霍多普辛;YFP：黄色荧光蛋白;dflox： 双絮;IL：红外线皮层;BLA：巴索拉特拉尔杏仁核;DRN：后拉皮核;PrL： 前视区。这个数字已被修改从伯格201948。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
利用光遗传学方法，实现高时空分辨率14和细胞类型特异性调制。此外，无需进一步治疗即可重复使用植入设备。立体定向手术后，在注射携带光遗传学工具的腺相关病毒和植入光纤后，小鼠可以恢复两周。我们选择了只有2周的恢复时间，因为这是足够的时间从手术中恢复和病毒表达。由于行为实验是免疫理论，我们必须确保小鼠在实验过程中不会变老;否则组织质量会降低。它们没有明显的植入物行为障碍，并参与典型的笼行为。当然，植入伴有显著的手术病变;因此，对小鼠进行强化监测。手术后，小鼠需要被单一安置，因为组住的小鼠往往会伤害对方的新鲜伤口和植入物。然而，住房条件对雄性小鼠的焦虑水平影响很大，因为单只家老鼠的焦虑水平较低，而一般抑郁症样症状较低。
大脑回路的化学或电气操作缺乏光遗传学的高细胞类型特异性，具有较低的时间和空间分辨率14，17，18。14,17,18根据实验问题，电或化学刺激可以有不同的优势。当通过特定区域的光纤端子时也需要刺激，电刺激是最好的方法。当整个区域的发射机特异性受体被激动剂激活时，化学刺激是一个不错的选择。与化学或电刺激相比，光遗传学的另一大优点是内源性神经元对光不敏感，从而避免了副作用的发生。事实上，高光强度可能诱发加热效应8,8，20，但由于适当的对照组，光遗传学操作的行为效应可以消除。
研究啮齿动物的行为，特别是在精神疾病方面，在自由移动的动物中，光遗传学有了很大的改善，因为它能够直接调节单个受体，高达特定的细胞群21和电路22。测量这种调制的急性影响的可能性，以及定义时间23后或慢性刺激24后的长期行为效应，使实验设计具有广泛的灵活性，并提供对大脑回路非常详细的见解。光刺激可用于调节位于光遗传学工具注射部位的神经元。当注射和植入都解决相同的大脑区域时，细胞体和背部投射的轴突的原理神经元和内膜在这个区域可以针对3，6，8。,83,然而，光纤维也可以植入一个不同于注射区域。在这种情况下，光刺激可以调节发射机在注射区域25、26、27,的投影区域的轴孔端子释放。
在这项研究中，光遗传学与实验相结合，分析焦虑相关行为。焦虑引起的精神疾病影响超过三分之一的世界人口28，29，30，并造成沉重的经济28,29,30负担31。那些受影响的人有一种觉醒、紧张和担心的感觉，其次是回避行为32，33。32,这些长期发生的负面情绪，主要集中在未来事件34，强烈地干扰着患者的日常生活。常见的治疗，如苯并二氮杂卓或选择性血清素再摄取抑制剂（SSRIs）只在一些患者中是成功的。大量的人对治疗没有反应，表明这种疾病的机理尚未完全了解。众所周知，前额皮质（mPFC）在焦虑21、25、27、36、37、38,25,27,36,37,的发育和表现中起着重要作用。具体来说，在mPFC中，皮层皮层（IL）区域过度激活可能是焦虑相关疾病39，40的一部分。此处描述的示例实验有助于了解 mPFC IL 区域中的调制如何影响焦虑行为。此外，为焦虑相关的精神疾病制定新的治疗策略也可能会得到支持。
2-6个月大的雄性Nex-Cre小鼠用于表达ChR2，特别是在mPFC41的IL区域内的金字塔神经元中。Nex-Cre 小鼠具有 C57Bl/6 背景，并特别在金字塔神经元中表达酶 Cre-重组酶。在立体定向手术中，双絮的ChR2-DNA通过腺相关病毒载体注射到IL区域。光学植入物直接放置在感兴趣区域（图1B）的正上方，植入物用牙科水泥固定。控制动物在同一区域接受双絮状tdTomato-DNA的注射，以模拟细胞特异性表达。
动物被集体安置，直到手术当天，之后是单一安置，以避免其他小鼠受伤。小鼠被安置在单只存放的小鼠的TypI-L笼中，安装在单独的通风笼（IVC）机架中。光暗循环遵循12：12小时的节奏，从上午10点开始的光相。所有行为实验都是在黑暗阶段进行的，类似于啮齿动物的活跃阶段。水和标准食品颗粒可用。经过两周的恢复，这确保了在金字塔神经元中充分表达ChR2，小鼠用于行为实验。
开放场 （OF） 是一个 50 厘米 x 50 厘米方形迷宫与喷砂 40 厘米高的墙壁。地面分为 16 个正方形，其中内部 4 表示中心。测量行为为：1） 在中心花费的时间，2） 中心条目数，以及 3） 移动的总距离。在这个实验中，有4个试验共20分钟。在试验1和试验3中，不发生光刺激，在试验2和4中，执行20 Hz刺激，光脉冲为5ms，光强度为473nm的1 mW（图2A）。在后来的试验中，考虑到了对测试区域的习性，但使用假注射控制动物表明习惯是如何表达的。
巴恩斯迷宫是一个学习和记忆的实验。这是一个直径为92厘米的圆形平台，周长周围有20个等距孔。其中19个孔是闭着的，在一个孔下，一个逃逸箱被呈现。连续4天，小鼠有4次训练试验，以了解逃生盒的位置。第5天， 逃生箱被移除，并测试老鼠需要多少时间才能找到正确的孔。测量行为为：1） 找到转义框/正确孔之前的时间，2） 目标访问和错误数，3） 距离移动至转义框。不同组中的光刺激在采集或巩固期间进行，这些时间发生在训练日 1-4 期间，或在测试日（即第 5 天）的检索期间（图 2D） 进行。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> 图2：光遗传学协议的行为实验。A） 具有相应光刺激协议的开场实验的示意图。 C） 使用相应的光刺激方案进行高架加迷宫实验的示意图绘制。 D） 巴恩斯迷宫实验的示意图与相应的光刺激协议。EPM：高架加迷宫;（国际）关于：BM：巴恩斯迷宫测试。这个数字已被修改从伯格201948。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
对于光遗传学刺激，光强度和频率必须适应正在调查的光遗传学工具和神经元类型。应使用尽可能低的光强度，以避免对组织造成损害，因为一些研究表明，由于强光强度8，20，有可能的加热效果。对于 ChR2，20 Hz 的刺激与 5 ms 光脉冲通常用于2。由于 ChR2 非常敏感，因此 1 mW 的光强度就足够了。光刺激协议在光关闭和试验之间交替，直接测量行为变化。行为实验的外部空间条件应保持稳定，为整个动物群体。需要考虑的重要条件包括噪音（请记住设备本身可能会发出噪音）、气味（始终用乙醇清洁行为设置）、光强和实验者。实验者应该永远是同一个人。此外，一天中实验的时间对于一组动物来说应该相同，在设施中黑暗阶段开始几个小时后是首选。
本实验的目标是通过强烈激活兴奋的金字塔神经元来增加IL区域的激发/抑制（E/I）比。在这个特殊的皮层区域，E/I比率的增强已知会增加小鼠40，42，43，4440,42,43,的焦虑水平。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

自由移动小鼠神经元回路的光遗传学调制影响急性和长期行为。此方法能够对单个神经元和特定区域的发射机释放进行操作，高达中枢神经系统的整个神经元回路，并允许直接测量行为结果。神经元通过注射携带首选DNA的病毒载体（如通道霍多普辛2（ChR2），表达光遗传学工具。光通过直接在目标区域上方的慢性光学植入物进入特定大脑区域。经过两个星期的恢复和适当的工具表达，小鼠可以反复用于行为测试与感兴趣的神经元的光遗传学刺激。
与化学或电刺激等常用方法相比，光遗传学调制具有高时空分辨率，具有高细胞特异性。光不会伤害神经元组织，因此可用于长期实验以及一只小鼠的多个行为实验。光遗传学工具的可能性几乎是无限的，使整个神经元的激活或沉默，甚至通过光操纵特定的受体类型。
这种综合光遗传学刺激行为实验的结果直接形象化了操作引起的行为变化。同一动物的行为没有光刺激作为基线是诱导变化的一个很好的控制。这允许详细概述涉及特定行为的神经元类型或神经递质系统，如焦虑。也可以通过光学刺激后的长期刺激或行为观察，对神经元网络的可塑性进行详细研究。光遗传学将有助于启发神经信号在几种神经系统疾病。

该协议的目的是测量转基因小鼠在光遗传学实验中的行为变化。光遗传学操作是通过注射腺相关病毒载体完成的。在自由移动的小鼠中，通过直接在感兴趣区域上方植入光纤维，可以进行光刺激。
在图4中，介绍了光遗传学实验的结果。通过 ChR2 在 IL 区域强烈激活兴奋的金字塔神经元，增加了开放领域中与焦虑相关的行为。ChR2被注射到Nex-Cre小鼠的mPFC的IL区域，用于在金字塔神经元中表达（图4A）。在两次焦虑测试中，开放场（图4B，C）和新奇抑制喂养测试（图4F，G），ChR2受到蓝光的刺激，并激活金字塔神经元。作为对照组，另一组小鼠接受了荧光团tdTomato的注射，而不是ChR2（图4D，G）。在这样的实验中，焦虑被定义为避免更明亮的中心区域。老鼠表现出对开放区域的内在回避，因为它们对掠食者感到焦虑。
在开放场实验中，如图 4B所示，小鼠进行了4次试验，每次5分钟。在试验1和3中，没有进行光刺激（Off1，2），在试验2和4中，对20赫兹（5ms光脉冲）和1 mW强度（On1，2）进行蓝光刺激。热图显示，在实验组中，中心持续时间在"关闭"和"开"试验之间有所不同。在光线刺激期间，小鼠优先留在边境地区。控制动物也喜欢边界，但不会改变他们的行为在光刺激下。在 图4C中，实验组显示了开放场实验中的主要行为测量结果。如果数据通过夏皮罗-威尔克法比测试，则使用独立的双尾 t 检验进行统计。如果正态性测试失败，则曼-惠特尼-兰克总和测试用作非参数替代。对于这些类型的实验，选择小组内部比较来研究光刺激是否能够随着时间的推移直接改变焦虑行为，而与实验和控制动物的基线焦虑无关。在两次光刺激试验中，中心持续时间显著缩短，表明焦虑水平增加。移动的总距离未更改，表明运动行为未受影响。中心条目的数量有所增加，尽管没有显著增加。在 图 4D中，显示了控制组的数据。在任何分析的参数中，对照动物在"关闭"和"开"试验之间没有表现出任何行为变化，表明光刺激或植入没有引起观察到的效果。总之，这个测试显示，在通过ChR2对IL金字塔神经元进行光刺激时，焦虑增加。
在 图5中，未成功的光遗传学实验的数据显示了提升加迷宫。在图5A所示的"提升加 迷宫"实验中，小鼠完成了6次试验，每次3分钟。在试验1、3和5中，没有进行光刺激（Off1、Off2、Off3），在试验2、4和6中，对20赫兹（5ms光脉冲）和1 mW强度的蓝光刺激（On1，On2，On3）。在这些示范性结果中，光遗传学协议的长度和迷宫本身的构造并不适合转基因小鼠线。在 图5B中，可以看到，几只老鼠用后爪从迷宫中滑落，甚至摔倒。当这一切发生时，老鼠有第二次机会在一天后执行EPM。如果他们再次倒下，他们被排除在分析之外。当老鼠几次滑落，但设法留在迷宫，数据被正常分析。然而，数据必须非常仔细地解释，控制动物会越来越重要。Nex-Cre小鼠在狭窄的张开手臂上有运动困难。为了避免这种情况，高1厘米的小墙会帮助在迷宫的手臂上安全地抓住后爪。热图和图表都显示，实验鼠，以及对照小鼠，开始避免张开手臂从试验2（On1）上（图5C-E）。两组张开臂上的时间显著缩短，张臂条目也显著减少。分析实验组只获得的数据，涉及光刺激的较大公致效应，因为开放臂和开放臂入口的时间在 On1 试验中显著减少。然而，当比较这些数据与显示相同行为的控制组时，很明显，观察到的行为不是由光遗传学刺激所调解的，而是由于习惯迷宫而避免张开双臂。这些数据强调了适当的对照组的重要性，以区分通过光遗传学刺激调解的行为效应和可能的行为适应。此外，这些数据还揭示了正确调整实验设置以适应特定的慕斯线和实验问题的重要性。
为了验证和加强收集的行为数据，老鼠的大脑在上一个实验后被移除，以控制正确的注射和植入（图6）。大脑固定在4%的半甲醛中，从头骨上取出。大脑在30%蔗糖中脱水1-2天，然后冷冻切片。40 μm 厚的日冕脑片被洗涤，并安装在超roro 目标幻灯片上，其安装介质中含有 DAPI，会弄脏细胞核。这样可以识别日冕切片中的目标区域。YFP标签或tdTomato本身的荧光表示病毒注射的位置。在图 6B 中，介绍了左侧 ChR2-YFP 的示范注射点（黄色）和右侧的 tdTomato（红色）。借助一个模板，改编自Paxinos和富兰克林45小鼠大脑图集，IL区域可以识别。在两张幻灯片中，光遗传学工具在 IL 区域中表示，但也在相邻的大脑区域中表示。为了进行适当的解释，请咨询蓝光在脑组织中的传播8（图1D，E）。可以看到，蓝光将到达IL下方的DP区域，在光纤尖端（图1D中的蓝线）8时，其初始1 mW光强度的5%以下。此外，由于反散射47，少量光线可以向上进入 PrL 区域。因此，可以说，IL区域照明最强烈，但相邻区域，如DP和PrL区域也可能受到轻微刺激。因此，不保证IL细胞特异性刺激，应对邻近区域进行免疫组织化学分析，以检查PrL和DP细胞的活性是否通过光调制。在图6C中，另一个重要的控件显示：Nex-Cre鼠标线的特异性。通过抗体染色对两种细胞类型在IL区域，谷胱甘肽原理神经元和GABAergic内，可以看到，ChR2-YFP表达只发生在谷胱甘肽神经元，而不是与GABAergic的。
总之，我们的实验表明，在行为测试期间，光遗传学操作可以观察到焦虑相关行为的变化。通过对同一行为使用多个测试，可以得出一个可靠的结论。此外，免疫石化学分析证实了获得的数据。我们的实验表明，在半皮质中金字塔神经元的特定激活增加了某些测定中与焦虑相关的行为。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> 图4：IL金字塔神经元的光遗传学激活增加焦虑行为。实验期间的光刺激：473纳米、1 mW、20 Hz刺激。A） ChR2-YFP 或 tdTomato 的注射和植入部位的示意图绘制到 IL 中。在实验中，mPFC的IL区域的金字塔神经元被ChR2激活。 从Paxinos和富兰克林小鼠大脑图集改编的Saggital脑片，下垂：横向o，6.B）开放场迷宫与光刺激协议（20分钟与4x5分钟交替关闭和打开试验;左）和热图的示范ChR2注射（EXP）和tdTomato注射（CT）小鼠在实验的所有4个试验（右）。 B当受到蓝色激光的刺激时，EXP动物在 OF 的中心花费的时间更少。对于CT动物，在中心花费的时间在光关闭和开试之间没有区别。C） EXP 动物的分组数据，在 OF，n=11。当受到蓝光的刺激时，老鼠在 OF 中心花费的时间明显减少 （Off1 39.49±6.9 s， On1 19.87±4.47 s， Off2 28.13±8.55 s， On2 23.42±9.32 s， Off1： On1， t 检验， p = 0.033， *;关闭1：On2，MWRS，p=0，049，*）。移动的距离不受影响（Off1 2703.09±292.65 厘米，On1 3113.4.415 厘米±，关闭 2 3331.86 ±482.62 厘米，On2 3082.17±658，61 厘米）。中心条目的 # 会随着时间而减少，但无显著差异（关闭 1 22.36±3.78，On1 18.45±3.95，关闭 2 17.36±1.99，On2 13.27±2.64）。D） 在 OF、n=15 中对 CT 动物的分组数据。时间老鼠花在 OF 的中心， 移动的距离， 中心条目的 # 在光开和关闭试验之间不会改变 （中心关闭时间 116.73±2.65 s， On1 16.02±1.89 s， Off2 12.02±1.76 s， On2 13.04±2.58 s;距离关闭 1 3399.69±296.77 厘米，On1 3210.6±446.9 厘米，关闭 2 3030.28±513.83 厘米，On2 2955±617.7 厘米;中心条目的 # 关闭 114.2±1.98， On1 13.6±2.02， 关闭 2 10.8±1.88， On2 11.67±2.5）。CT小鼠的基线焦虑显著增加（Off1 EXP：CT，MWRS，p=0.005，**）。值为均值± S.E.M. * 表示显著差异 （p≤0.05），** 表示显著差异 （p≤0.01）。t 测试总是双尾， MWRS： 曼 - 惠特尼排名总和测试;IL：红外线皮层;BLA：巴索拉特拉尔杏仁核;DRN：后拉皮核;（国际）关于：CT：控制动物;EXP：实验动物;L：轻。这个数字已经修改了从Berg等人2019年，PLoS一号43和从伯格2019年48。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> 图5：EPM实验未能显示Nex-Cre小鼠的行为效应。实验期间的光刺激：473纳米、1 mW、20 Hz刺激。 A） 带光刺激协议的升高加迷宫（18分钟，6x3分钟，交替关闭和开试验）。 B） 将"滑走"的小鼠的组数据包含在数据中，总计 n=23。Nex-Cre小鼠有用后爪从张开的手臂上滑落的倾向，与实验组无关（左）。在后来的分析中，只考虑了在迷宫中停留所有6项试验的小鼠。滑出在第一个 Off1 阶段是以后避免张臂的原因 （Off1 EXP 1.63±0.6， CT 2.2±0.79，Off2+3 EXP 0.125±0.125，CT 0±0，On1+2+3 EXP 0.625±0.26，CT 0.1±0.1）。饼图（右）显示老鼠在 18 分钟内从迷宫中坠落，为 42.42%。只有57.57%的人完成了实验。 C） 在实验的所有6个试验中，示范性EXP和CT小鼠的热图。两组在 Off1 试验后都显示开放臂持续时间的缩短。 D） EPM 中 EXP 动物的分组数据，n=12。前两次试验期间，在张开双臂上花费的时间显著减少，之后（Off1 73.91±12.22 s， On1 36.15±14.65 s， Off2 15.61±6.23 s， On2 19.49±7.51 s， Off3 9.36±4.44 s， On3 7.96±3.47 s. Off1， t 测试， p=0，041， *）.移动的距离不受影响（Off1 679.96±71.63 厘米，On1 712.24±112.82 厘米， Off2 717.49±97.39 厘米， On2 782.51±81.11 厘米， Off3 722.11±68.60 厘米， On3 663.90±106.57 厘米）。打开臂条目的数量从 Off1 显著减小到 On1，然后保持不变 （Off1 8.08±1.08， On 1 3.33±0.76， Off2 2.16±0.69， On2 2.91±1.09， Off3 1.73±0.75， On3 1.73±0.66.Off1：On1，t 检验，p=0.002，**）。在 EPM 中心花费的时间沿试验减少，但从"关"到"在试验"（Off1 41.71±5.34 s） 没有显著差异， On 1 31.2±4.59 s， Off2 19.8±3.44 s， On2 24.49±3.38 s， Off3 20.37±4.77 s， On3 18.85±4.07 s）. E） EPM 中 CT 动物的组数据，n=11。CT 数据显示与 EXP 数据相同的显著减少，表明实验无法正常工作（张臂关闭时间 1 86.92± 12.74 s，On1 33.78±14.38 s， 关闭 2 18.01±11.61 s， On2 16.41±9.61 s， 关闭 3 11.36±4.01 s， On3 5.43±2.07 s. Off1： On1， MWRS， p=0.009， **;距离关闭 1 705.11±88.36 厘米，On1 789.45±77.53 厘米， 关闭 2 724.74±80.49 厘米， On2 676.57±111.99 厘米， Off3 716.99±132.47 厘米， On3 663.03±132.46 厘米;打开臂条目关闭 1 7.09±1， On1 3.72±1.17， Off2 1.45±0.47， On2 1.36±0.58， Off3 0.91±0.43， Off3 1.64±0.59.关闭1：On1，MWRS，p=0.01，*;时间花费在中心关闭1 35.89 s， On1 29.25±3.96 s， Off2 22.17±3.58 s， On2 15.9±2.57 s， Off3 13.86±4.2 s， On3 16.89±5.75 s）.值为平均值± S.E.M. * 表示显著差异 （p≤0.05），** 表示显著差异 （p≤0.01）。t 测试总是双尾的，MWRS：曼-惠特尼排名总和测试;EPM：高架加迷宫;CT：控制动物;EXP：实验动物;OA：张开双臂。这个数字已经修改了从Berg等人2019年，PLoS一号43 和从伯格2019年48。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> 图6：在IL和Nex-Cre特异性中 CHR2 和 tdTomato 的喷射侧。A） AP = 1.66 mm，mL 0.3 mm，DV-1.8 mm，单方注射和植入（改编自小鼠脑图集、Paxinos 和富兰克林、布雷格玛 =1.54 mm）的日冕脑片上的植入部位的示意图绘制。 B） ChR2-YFP（左，黄色）和tdTomato（右，红色）的模范注射部位与Nex-Cre小鼠的DAPI染色细胞核（蓝色）合并。比例杆 1 毫米。内集显示 IL 区域的高放大率。比例杆 150 μm。白框表示内集的位置。C） 上行：与 CamKII 染色的 Nex-Cre 小鼠的左 IL 区域的共和图像，作为谷胱甘肽神经元（蓝色）的标记，以及 ChR2-YFP（黄色）或 Gad67 作为 Nex-Cre 小鼠的 GABAergic 神经元（绿色）的标记。下排：ChR2-YFP（黄色）与CamKII（左，蓝色）的结肠化，但不是与Gad67（右，绿色），显示Nex-Cre小鼠的谷胱甘肽神经元的特异性。比例杆 50 μm。PrL：前额皮层;IL：红外线皮层;DP： 后皮皮层。这个数字已经修改了从Berg等人2019年，PLoS一号43 和从伯格2019年48。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

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Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

通过特定神经元群体或大脑区域的光遗传学操作，可以在自由移动的动物中以高时空分辨率改变行为。通过使用不同的光遗传学工具与慢性植入光纤相结合，可以执行各种神经元调制和行为测试。

神经活性的光遗传学操作，调节自由移动小鼠的行为

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

通过特定神经元群体或大脑区域的光遗传学操作，可以在自由移动的动物中以高时空分辨率改变行为。通过使用不同的光遗传学工具与慢性植入光纤相结合，可以执行各种神经元调制和行为测试。光遗传学的最终目标是在行为动物中对具有高时空分辨率的神经元回路进行调制。与药理或电气操作相比，光遗传学允许精确控制神经元电路上的特定细胞类型。光遗传学是在行为过程中瞄准特殊定义区域中特定细胞类型，并仔细观察此类微电路变化的直接影响的完美方法。现在，我们将介绍一个步骤，以步骤指导如何准备和种植和进行光遗传学在自由移动的小鼠。为了准备光学植入物，将陶瓷铁杉平放在长凳上。用纤维剥离工具剥离直径为 200 微米的玻璃纤维的代码，用陶瓷纤维划片切割 2 到 3 厘米的非碎片。将玻璃纤维片放入陶瓷铁杉中，然后用注射罐将一滴超级胶水放在平坦的一侧。在陶瓷铁杉的圆形一侧，尽可能缩短玻璃纤维，将预植入放在铁杉抛光球中，以抛光四份不同出版论文的圆形侧。之后，将陶瓷铁杉平侧的玻璃纤维切割到植入所需的长度。使用鼠标大脑图集计算植入物的长度。植入物必须直接在感兴趣区域上方结束。在植入之前，应用麻醉。手稿中描述了精确和美观的技术。当鼠标达到麻醉的深层状态时，将鼠标放在加热板上，将头部固定到立体定向框架中。固定鼻子和牙齿在前面和耳朵的两侧。将一种带杯芬的阿尔奇亚在小鼠的背面涂抹，并在两只眼睛上涂抹不透明的眼膏，以保护它们免受干燥。用湿纸巾润湿头皮上的头发，然后用剪刀剪掉。确保用湿纸巾去除所有松动的头发。使用棉棒用含碘的药剂对头皮进行消毒。用钳子抬起有关感兴趣区域的头皮，沿着中线切割一厘米。要粗加工头骨进行植入，在疤痕上涂抹少量磷酸，让它生效15秒。用棉棒去除所有酸，用氯化钠冲洗疤痕两次。要正确注入，计算单个坐标的 F 因子。将玻璃罐放在立体框架中，并直接位于啤酒的正上方。现在归零坐标系，将玻璃罐移动到兰姆达。使用以下公式计算 F 因子。布雷格玛减去兰姆达除以4.2等于F因子。精确的坐标对于注射和植入非常重要，否则，如果刺激了错误的结构，则行为效应是不特定的。所有小鼠的头骨大小都有最小的偏差，因此，系数是绝对强制性的。使用调整后的坐标查找直接位于利益结构上方的疤痕上的位置。使用注射管钻孔到头骨，通过旋转管当场。要将病毒溶液放入连接到注射器的玻璃管中，请将一滴氯化钠放在头骨上，并在顶部放置一片皮罗芬。将两滴微升病毒溶液滴到皮罗芬上，将玻璃管的尖端放入病毒中。施加负压，等待病毒溶液被病毒溶液采用。零到该坐标时，病毒的尖端与管，在头骨的水平，并慢慢降低到井眼注射侧的最低位置。用注射器施加少量正压，直到半月板降低。让病毒传播两到三分钟，然后将玻璃管向上移动到下一个位置。非常缓慢地取出玻璃管，并在最后一次注射后将其丢弃。现在准备植入的头骨。用压缩空气干燥头骨，用相应的斗杆涂抹底像，让它干燥15秒。用同一根棍子涂抹粘结，用紫外线固化 20 秒。将植入物放在相应的支架中，将玻璃纤维的尖端直接放在钻孔上方，然后小心地降低。当超胶的剩余阀接触头骨时，停止降低植入物。光纤的植入也可以用于双边结构，如海马。这两个半球同时提供轻微刺激，或允许两种不同结构的刺激。也可以在不同于光纤植入物的位置注射病毒。如果注射和植入是在不同区域进行，在应用磷酸后，但在两个成分粘附之前钻所有必要的孔。再次检查头骨是否仍然完全干燥，然后在植入物周围和周围区域涂抹液体牙科水泥，然后用紫外线固化 20 秒，在完全无毛皮和干燥的头骨区域再涂抹两个较小的水泥。用紫外线固化每一层。完成手术，对整个伤口涂抹碘膏。松开鼻子和耳朵固定，将鼠标放入一个新鲜的笼子，并放在加热灯下，以避免身体热量损失。每天至少检查一次它的健康状况，如果需要的话，它会在三天后发布手术和阿尔盖西亚。经过两周的恢复，小鼠可用于行为实验。打开脉冲器软件并选择插入光源的 USB com 端口。选择操作模式 3 以允许外部软件控制光源。选择使用 5 毫秒光脉冲进行 20 赫兹刺激的正确调整。要定位要与脉冲器通信的除法，请按启动顺序。此状态将一直持续到实验完成。现在，在 EthoVision XT 中创建新实验，转到文件，从模板中选择新模板并选择应用预定义的模板。选择实时跟踪并选择带源的摄像机，并确认连接的 Puslar Gen-Eye 凸轮。选择鼠标作为应该记录的动物。选择竞技场模板、开放字段方块和区域模板中心、边框、角。确认一个应跟踪的主题，并选择中心点、鼻尖和尾部底座。确认动物的颜色与背景比较较深，并建议采样率完成该步骤。适当命名实验并选择要保存的位置。在找到竞技场设置之前，摄像机将自动打开背景图像。使用箭头和右侧的两个符号，将预定义区域调整到真实竞技场。如果某些区域是不必要的，请将其删除。按绘制刻度进行校准，然后将一条线从迷宫的一个角落放在另一个角落。输入实际距离的长度（以厘米为单位）。对其他轴重复。要定义试用控制设置，请通过将条件时间调整为 20 分钟来准备主规则。当主题在竞技场上两秒钟时，星际迷航的条件应该是在鼠标在竞技场上时自动跟踪状态。若要为光刺激创建子规则，请转到结构，更多并选择子规则。将它放在主规则下方，然后摊开两个框。去条件，时间，并给它一个名字像光上一个，调整条件满足后五分钟。将框直接放在子规则的规则开始框后面。转到操作自定义硬件，并在一个硬件上用光命名它。选择要执行的操作：我将高放一个。将盒子直接放在条件框后面。重复这些步骤，将灯对灯进行编程到光上。现在转到结构、子规则引用并检查引用是否属于正确的子规则。选择启动条件，如无延迟，选择启动条件，按启动条件执行一次。将参考框放在额外书籍一和条件书两条主要规则之间。现在定义检测设置，以显示系统应跟踪什么。将测试里程放入竞技场并选择自动设置。选择啮齿动物作为动物类型，并使用鼠标光标在竞技场的老鼠周围画一个盒子。确认护理问题的结果，用"是"。对于开放场实验，在实验前将实验鼠带到行为室，以确保适当的焦虑水平。将鼠标轻轻按到笼子的网格上，将鼠标与光源的缝隙连接在一起。将它放入一个等待的笼子里，里面散落着新鲜的垃圾10分钟，以适应光缆。通过按下停止按钮开始采集，然后您实现视觉 XT。将鼠标从等待的笼子转移到开放字段的左上角。在实验过程中离开鼠标的视场，保持冷静。20分钟后，实验完成后，将鼠标从迷宫中取下，断开光缆，并将其放回自己的笼子中。通过检查可视化，可以直接看到光关闭和面上的光之间的中心时间差异。当光线打开时，鼠标在中心的时间更少。对于巴恩斯迷宫实验，在实验前一小时左右将所有实验鼠带进行为室。通过关闭除一个洞以外的所有孔来准备巴恩斯迷宫，现在放置了哪个逃生箱。在两个植入物的光源中连接一只鼠标，然后直接将其放入巴恩斯迷宫的中间。按"开始"，需要访问下一个 T 并取出纸箱。准备好手动停止试用，以防软件无法识别整个过渡。将鼠标从迷宫中取出，并移除与光电缆的连接。在执行、学习和记忆任务时，不仅调查了操作的立竿见影的效果，还调查了获取、合并或检索过程中操作的长期效果。对于数据分析，您可以找到治疗条件处理或控制，转到嵌套并选择试验控制状态。选择从元素动作星际迷航到元素动作灯在其中运行的状态间隔。将嵌套框放在滤箱处理和相应结果框之间。此定义的间隔为 1。在两个间隔之一和两个上重复间隔步骤，以及对控制组重复间隔的步骤。还要定义要在分析配置文件中分析的参数。选择区域中的因变量，然后选择区域中心、正文点、中心点，然后进行试用统计。选择频率、累积持续时间，并在那里查看第一个。还要添加距离移动作为变量。使用此配置文件，可在中心、中心条目和告诉距离移动中花费的时间数据。要从每个部门中提取数据，请转到结果并选择统计信息和图表，按计算以查看分析的数据。按导出数据并选择试用统计和要保存的位置。导出的数据保存为 Excel 文件，并保存为每只鼠标的单个值。此外，转到热图可视化和按图热图，选择右侧的试用版以查看每个鼠标和试用的单个热图。右键单击鼠标，将热图导出为图像。稍后，打开计算机的 Excel 文件并计算所有四个试验和每个测量调节组的均值和标准欧元 SCM。要生成图形和西格玛图，请将手段和 SCM 复制到从额外文件的正确顺序到西格玛图。行必须包含关闭一个的数据，列包含试验、平均和 SCM 赫兹。选择所有三列，然后转到创建图形。选择条形框，然后选择带箭头的未分组框。标记整个图形，回家，选择图形框，然后按导出。选择目标文件夹并选择元文件作为格式。要计算获取数据的统计信息，请将 Xcel 中的右数据一对一地复制，并复制到西格玛图的单列。标记要比较的列并转到分析，选择 T 测试并按"运行"。最后，行为数据可以分为放让和试用，并提供额外的热图专业化。在开放场实验中，在通道霍多平2和金字塔神经元的光刺激中，中心持续时间缩短，表明焦虑水平增加。通过免疫功能化学，可以确定病毒的注射部位和表达，也可以在特殊Cre依赖性小鼠系的特异性进行验证。可以清楚地看到，与刺激前的基线焦虑相比，Channelrhodopsin2的光刺激改善了这个特定皮层区域的心灵神经元，增加了焦虑水平。这种操作对行为的直接影响是光遗传学今天用于这么多有关行为的研究问题的原因。此过程可用于小鼠大脑中任何所需细胞类型或神经元电路的光遗传学调制。通过将此过程与适合您研究的行为测试相结合，可以更深入地了解与行为和疾病有关的神经元回路。

Research

JoVE Journal

Behavior

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

穿通通路 - 齿状回突触在自由活动的小鼠长时程增强

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

科研

行为学

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癫痫Electrocorticograms（ECoGs）的操作，并睡在针刺大鼠和小鼠

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

多层皮质Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;使用棱镜探针和小型荧光显微镜成像自由移动的小鼠

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

用于体内的无线双向接口记录和刺激自由行为大鼠的神经活动

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Assessing Activity-based Anorexia in Mice

小鼠活动性厌食症的评估

Rodents develop activity-based anorexia (ABA) when exposed to a restricted feeding schedule and allowed free access to a running wheel. These conditions ...