Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Stor tak til prof. Klaus-Armin Narve og Dr. Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Tyskland) for venligt at levere Nex-Cre mus. Også, vi takker vores video-team Yunus Dikici og Ruben Wiesner for optagelse og behandling af JoVE video til denne artikel. Desuden stor tak til Kristin Claussen for hendes voice-over og Kimberly Anne Go for korrekturlæsning af manuskriptet.
De præsenterede resultater blev opnået på Ruhr-universitetet i Bochum og videoen blev optaget på universitetet i Bremen.
Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 og DFG MA 4692/3-2.

Forfatterne har intet at afsløre.

Brug af lys til at manipulere neuronal signalering har været den foretrukne metode i næsten et årti nu. Siden 2005 er antallet af offentliggjorte artikler om udvikling af nye optogenetiske værktøjer4,6,8,14,49,,50,51 ogundersøgelser, hvor sådanne værktøjer anvendes til at undersøge hjernekredsløb21,23,40,43,52,steg kraftigt. På den ene side, med den enorme mangfoldighed af injicerbare optogenetiske værktøjer, implantation varianter, transgene muselinjer og adfærdsmæssige eksperimenter, muligheden for eksperimenter er mangfoldig og ubegrænset. På den anden side er muligheden for at lave fejl i valget af forsøgsbetingelser meget høj, og forsøgene er så specifikke, at sammenligneligheden med andre undersøgelser ofte er vanskelig.
Kritiske trin Et vigtigt kritisk skridt i denne protokol er korrekt planlægning. Valget af det optogenetiske værktøj bør svare til det videnskabelige spørgsmål. Er det kun nødvendigt at manipulere den samlede aktivitet af en neuron eller synapse? Så kommercielt forudsat værktøjer som ChR221,,25,,27 og Arch37 er et godt valg. Men bortset fra det, hvis en særlig neurotransmitter system eller endda en enkelt receptor bør manipuleres, en individuel receptor kimær er ofte det bedre valg3,6. Flere receptor kimærer med GPCRs, de såkaldte Opto-XRs, og retningslinjer for at producere dem er allerede tilgængelige4,50. Ud over valget af optogenetiske værktøjer er muselinjen i kombination med adfærdseksperimentet også kritisk. Forskellige baggrundsstammer, som for eksempel C57Bl/6 og BALB/cByJ, viser forskellige adfærdsmæssige fænotyper i noglehenseender 53,54. C57Bl/6 mus har en lav baseline angst og kan bruges til angstdæmpende manipulation, mens BALB/cByJ viser højere angst niveauer og er derfor mere følsomme over for angstdæmpende medicin. Derudover kan de transgene varianter af disse baggrundsstammer også variere i deres fænotype48. Med en ordentlig kombination af specifikke initiativtagere i forbindelse med en optogenetisk værktøj og transgene muselinje, kan næsten alle ønskede cellepopulation målrettes.
Et kritisk skridt under operationen er rettet mod den korrekte placering. Ved hjælp af musen hjernen atlas, passende koordinater for den forreste-posterior akse, og mediale-laterale akse, og dybden af strukturen kan etableres45. I virkeligheden har hvert kranium en lidt anden form og størrelse. Således F-faktor46 til at justere stereotaktiske koordinater er ganske vigtigt, som er den korrekte næse og øre fiksering under stereotaktisk kirurgi. Hvis hovedet af musen vippes, vil injektionsdylen ikke målrette den ønskede region af interesse.
Derudover er diameteren af injektionsdylen også kritisk. Hvis det er for lille, ingen virus kan frigives i vævet, hvis det er for bredt, kanylen vil lække virus løsning på vej til regionen af interesse. Hvis den implanterede optiske fiber ender direkte over målregionen, virusudtryk i cortex regioner ovenfor betyder ikke noget. Men hvis implantatet er placeret over andre regioner for at stimulere axon terminaler, axonerne i øvre cortex regioner vil også blive aktiveret af lys og forfalske indhentede data. Som et eksempel: IL-regionen og den prælimske (PrL) region både projekt til basal amygdala55,56, men har helt forskellige funktioner og roller i graduering af angst26,57., Hvis implantatet placeres over amygdala for at aktivere axonterminaler fra IL-regionen, og under injektionsvirusopløsningen også blev placeret i PrL på grund af den forkerte injektionsdyle, er risikoen for også at aktivere axonterminaler fra PrL meget høj.
Under udarbejdelsen af kraniet til fiksering af implantatet er den sparsomme brug af primer og binding afgørende for en pålidelig og holdbar fiksering. Hvis 2-komponent vedhæftning system ikke anvendes tyndt, kan dental cement løsne sig fra kraniet efter et par dage eller uger. Derudover skal kraniet også tørres helt, før implantatet fastgøres, da cementen ellers ikke vil fastgøre korrekt til kraniet.
Der findes også kritiske trin i den adfærdsmæssige del af denne protokol. For det første er opførelsen af labyrinten meget vigtig. I hver adfærdsmæssig opsætning findes der flere varianter i litteraturen vedrørende størrelse og form samt for selve proceduren58,59,60. Det er vigtigt at vælge en variant, der gør dataene sammenlignelige og reproducerbare. Der bør også tages hensyn til særlige krav til udnyttede muselinjer43,48. I de repræsentative data for EPM kan det ses, at flere Nex-Cre mus faldt ned fra labyrinten eller gled af flere gange (Figur 2b). For disse mus ville en labyrint med en lille væg omkring de åbne arme have været et bedre alternativ.
For det andet er det afgørende at holde alle eksterne rumforhold konstante61, ellers ville forskellige grupper af mus slet ikke være sammenlignelige. I den forbindelse er det meget vigtigt at vælge tidspunktet for eksperimentet som et tidspunkt, hvor den eksperimentelle opsætning er ledig, og eksperimentatoren altid er til stede. Endvidere bør hændelser i bygningen, såsom byggearbejde, afprøvning af systemer (brandalarm) eller rengøringsdagen for museanlægget, overvejes for at undgå interferens med de opnåede data.
Endelig er håndterings- og boligforhold afgørende for adfærdsmæssige eksperimenter. Når en implantation udføres, mus skal være enkelt ophus på grund af risikoen for skade fra andre mus. For at sikre god sammenlignelighed mellem grupper og en lav fejl inden for en gruppe skal hver mus have samme burstørrelse og berigelse. For angst-relaterede eksperimenter, enkelt boliger har nogle fordele som singe opsatte mandlige mus viser en lavere baseline angst niveau, mindre variation i deres angst niveau, og mindre depressive-lignende symptomer15,16. Gruppe husede hanmus kan være meget forskellige i deres angstniveau på grund af hierarkiet blandt musene. Udover huset er en konstant og lige håndtering af alle mus og grupper også vigtig. Sensationsprægede musen for at forbinde lyset fiber på implantatet er meget stressende. Derfor skal denne procedure være den samme for hver mus, hvilket betyder den samme teknik og den samme eksperimentator. Desuden skal tilvænningstiden i venteburet, som skal berolige musen fra den stressende forbindelsesprocedure, også have lige vilkår i varighed, strøelse og position til labyrinten. Håndteringen i musefaciliteten er også afgørende for senere adfærdsmæssige ydeevne. Forsøgs- og kontroldyr bør ikke rengøres på forskellige dage eller af forskellige mennesker, da dette også er stressende for mus. Derudover bør rengøringsdagen ikke være den eksperimentelle dag for at undgå forskelle i adfærd.
Fejlfinding Der kan opstå flere problemer under protokollen. For eksempel, boring en helhed i kraniet under stereotaktisk kirurgi kan skade blodkarrene. Normalt, stærk blødning opstår, især over bregma og lambda. Hvis dette sker, skal du ikke forsøge at stoppe blødningen med bomuldspinde, da de har tendens til at udvide endnu mere blødning ud af beholderen på grund af deres sugelighed, i stedet, direkte skyl med NaCl.
Det kan også ske, at trykinjektion af virusopløsningen ikke virker. I dette tilfælde kan det være, at parafilm, en skurv fra burr hul eller hjernevæv, er tilstopning spidsen af kanylen. I dette tilfælde skal du fjerne kanulaen langsomt ud af hjernen uden at ændre x- eller y-aksen og bruge en pincet til at fjerne 1-2 mm af den forreste del af kanylespidsen. Før du sænker kanylen igen, test for funktionalitet ved at anvende lille mængde pres for at se, om virus kommer ud af kanylen spidsen. For at undgå forstoppelse skal du sænke kaninen med en konstant hastighed og ikke stoppe bevægelsen, før injektionssidens dybeste dybde er nået. Hvis for meget af kanylen spidsen fjernes, og diameteren er for stor, kanylen vil skade væv og risikoen for at anvende virus på én gang vil blive øget. Sørg således for, at kun den tilstoppede del af spidsen fjernes omhyggeligt.
Under adfærdseksperimentet kan opsætningen af eksperimentet i videosporingssoftwaren (f.eks. Hvis for eksempel lysudgangen ikke fungerer korrekt, kan det skyldes flere årsager. Pulseren skal åbnes, programmeres og startes, før Ethovision XT åbnes. Hardwaren skal vælges korrekt i "Eksperimentel opsætning" (trin 3.2.2.4). Hvis den forkerte IO-Box, eller andet end "Costume Hardware" er valgt, pulser enheden kan ikke styres af Ethovision. Hvis testen af lysoutputtet lykkes, men den programmerede lysprotokol i "Indstillinger for prøvekontrol" ikke fungerer under anskaffelsen, kan underreglen eller underregelreferencen være placeret forkert, eller betingelserne og handlingerne er uklare. For eksempel: Hører referencen til den korrekte underregel? Er referencen programmeret korrekt (f.eks. hvor ofte udføres underreglen)?
Derudover kan det ske, at dyret under "detektionsindstillinger" spores tilstrækkeligt, men under erhvervelsen er der prøver, hvor emnet ikke findes. I dette tilfælde skal du kontrollere, om belysningen i det eksperimentelle rum blev ændret, eller om noget producerede uønskede skygger i labyrinten. Hele bunden af labyrinten skal have samme farve, da indstillingen kun vil fungere for en bestemt kombination. Hvis uanset af hvilken grund forskellige nederste farver eller skygger ikke kan undgås, definere detektion indstilling i den mørkeste del af labyrinten.
Hvis du vil ændre indstillinger efter erhvervelsen af de første dyr, skal du ikke anvende disse ændringer i de allerede anvendte indstillinger. Duplikere dem for at justere dem. Det betyder også, at det allerede registrerede forsøg ikke længere er gyldigt til dataanalyse. I et sådant tilfælde skal du registrere alle dyr for denne eksperimentelle gruppe med de oprindelige indstillinger og oprette et nyt eksperiment bagefter, hvor de optagede videoer analyseres i stedet for live sporing. I dette "fra video"-eksperiment kan flere indstillinger bruges til analyse uden at miste sammenlignelighed mellem dyr eller endda data.
Begrænsninger og fremtidige applikationer Denne metode til at manipulere adfærd med optogenetik i frit bevægelige dyr omfatter også begrænsninger. Under operationen er nærheden af de to implantater begrænset. Ved dobbelt implantation skal afstanden mellem de to implantater minimalt være bredden af apparatet for at holde implantatet. Apparatet skal sænke det andet implantat ind i grathullet, mens de første implantater allerede er fastgjort. En løsning til dette kan være en vinklet implantation, hvor spidsen af glasfiber kan være meget tæt, mens de keramiske ferler over kraniet har større afstand23,,55,,56,57,62,63. En ulempe ved en vinklet implantation er lysspredningen. Når fiberspidsen er skråt i stedet for fra lige over, er det stimulerede område anderledes. I tilfælde af to målregioner i umiddelbar nærhed skal der tages hensyn til den ændrede position for lysstimuleringen.
Under adfærdseksperimentet kan konstruktionen af labyrinten forstyrre det optiske kabel, der er forbundet til dyret. Nogle adfærdsmæssige tests, såsom lys-mørk boks, indeholder et indendørs område64,65, og andre labyrinter indeholder rum, som musen skal indtaste. Sådanne eksperimenter kan ikke udføres med denne opsætning. Alternativt kan et trådløst system være en mulighed22,26,66. Men heldigvis nogle labyrinter, såsom Barnes Maze, kan arrangeres på en sådan måde, at musene er i stand til at komme ind i de relevante rum67.
Ud over dem med lukkede zoner, labyrinter, der er for bred kan forårsage også problemer. Jo større området af labyrinten, jo længere kablet skal være at tillade dyret at gå til alle positioner i labyrinten. Man skal passe på, at dyret ikke er i stand til at træde på kablet eller få fat i det og bide det. En løsning for det kan være en konstruktion, der ruller op overflødige kabel. En ulempe er, at træk for at rulle kablet er svært for mus. Denne løsning ville bedre passer egnet til rotter. En anden mulig mulighed kunne være at gøre lyset stimulation på forhånd, i stedet for under forsøget, selvfølgelig er dette kun muligt, hvis en langsigtet effekt på grund af lysstimuleringopstår 23.
Sammenligning med eksisterende/alternative metoder Alternative metoder ville være kemisk eller elektrisk stimulation under adfærd8,18. Kemiske agonister eller antagonister er i stand til at aktivere eller tavshed neuroner via specifikke receptorer og kan også manipulere enkelt neurotransmittersystemer 38,68. På den ene side, receptor-specificitet er ganske høj for kemikalier, fordi specifikke agonist eller antagonist kun aktivere visse receptorer39. På den anden side, specificitet for receptor undertyper af samme neurotransmitter gruppe er ofte utilstrækkelig. De fleste kemikalier binder sig til mindst to undertyper med forskellige sandsynligheder69. Derudover, kemikalier kan ikke skelne mellem neuronal celletyper, så længe de besidder de samme receptor typer. Ud over dette, tidsmæssige og rumlige opløsning er dårlig for kemiske manipulationer i forhold til optogenetik. Agonister eller antagonister administreres ofte oralt35 eller via systemiskeinjektioner 57,70. Hvis infusion af kemikaliet sker direkte i hjernevævet, virkninger vises hurtigere end med mundtlige anvendelser, men stadig på en langsommere tidshorisont end med lys stimulation. Som de administrerede kemikalier diffuse i hjernen og er ikke specifikke for neuronale typer eller hjerne regioner, manipulation af specifikke hjernekredsløb det ikke muligt.
Elektrisk stimulering har en højere tidsopløsning end kemisk stimulation9,14. Spredningen i neuronal væv er mindre end med kemisk stimulation og den rumlige opløsning er bedre end med kemisk stimulation. Men elektrisk stimulation mangler mulighed for specifikt at behandle forskellige neuronal celletyper eller receptor typer, som hver neuron i nærheden af elektroden vil reagere på den elektriske stimulation.
Alternative metoder til adfærd i frit bevægende mus er for eksempel elektrofysiologiske optagelser i hjernen skiver, hvor enkelt neuroner eller axoner kan moduleres med optogenetik og fremkaldte effekter kan måles via optagelse elektroder6,71. In vitro-eksperimenter giver mulighed for at undersøge det molekylære og cellulære grundlag af optogenetiske stimulationer, men har den begrænsning, at der mangler iboende forbindelse og input fra andre hjerneregioner. En anden mulighed er at bruge optogenetic i forbindelse med multiphoton imaging1,72. I dette tilfælde har mus deres hoved fast og kan bedøves eller være vågen til at løse simple opgaver.
For at udføre en vellykket optogenetisk eksperiment, en bred vifte af værktøjer og applikationer er tilgængelige i dag. Udvælgelsen af optogenetiske værktøjer og den adfærdsmæssige set-up er afgørende for at besvare specifikke forskningsspørgsmål. Hvis den rigtige kombination af værktøjer og eksperimenter er valgt, optogenetics giver mulighed for en hidtil uset, dybdegående undersøgelse af neuronal kredsløb med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. Dette vil bidrage til at forstå og udvikle nye terapeutiske strategier for psykiatriske sygdomme og kognition.

Gradueringen af neuronal kredsløb i centralnervesystemet og deres adfærdsmæssige resultater er vigtige for at forstå, hvordan hjernen fungerer, især i psykiatriske sygdomme og kognitive opgaver såsom læring og hukommelse. Med optogenetik kan enkelte celler eller cellepopulationer op til hele kredsløb moduleres af lys. Fælles optogenetiske værktøjer som Channelrhodopsin2 (ChR2) eller Archaerhodopsin (Arch) er i stand til at aktivere eller lukke munden på neuroner, eller øge eller hæmme sender frigivelse på axon terminaler projicere til forskellige hjerne regioner1,2,3,4. Arch skal dog bruges omhyggeligt, da det blev påvist, at dens aktivering på præsynaptiske terminaler øger spontan sender frigivelse5. Arch er en ydre korrigerende protonpumpe, der ændrer pH-værdien inde i cellen. Denne alkaliske miljø inducerer calcium tilstrømning og forbedrer sender frigivelse5. For specifikt at modulere intracellulære signalveje kan receptorklokker, der består af et let aktivereligt optogenetisk værktøj, såsom rhodopsin eller kegle opsin, sammen med en passende G-proteinkoblet receptor, oprettes6,,7,,8. Mængden og variationen af de optogenetiske værktøjer , der er til rådighed , er steget betydeligt i løbet af det sidste årti9.
Formålet med optogenetics er at manipulere neuronal kredsløb under adfærd. Optogenetik gør det muligt for eksempel at måle akutte adfærdsændringer såsom ændringer i angstadfærd. Optogenetiske værktøjer leveres til målområder i hjernen via virale vektorer. Ved hjælp af særlige initiativtagere og smagsforstærkere eller Cre-loxP-systemet kan der sikres celletypespecificitet til udtryk for optogenetiske værktøjer (figur 1A). Der er flere genetisk modificerede muselinjer, der udtrykker enzymet Cre-Recombinase i specifikke celletyper. For eksempel, Nex-Cre mus udtrykke Cre-Recombinase i pyramideformede neuroner i cortex og hippocampus under kontrol af Nex-promotor10. Dette enzym er i stand til at invertere DNA-sekvenser, som er flankeret af loxP sider11. Derfor kan DNA-sekvensen af et dobbelt-floxet optogenetisk værktøj, som er omvendt og flankeret af loxP sider, kun transskriberes af neuroner, der besidder Cre-Recombinase, men ikke af andre neuronale typer12,13. I tilfælde af Nex-Cre mus, vil det optogenetiske værktøj udelukkende udtrykkes i pyramideale neuroner. Lysstimulation af visse hjerneregioner opnås derefter via kronisk implantation af optiske fibre direkte over regionen af interesse. Dyr kan derefter kobles til en passende lyskilde og frit opføre sig i næsten alle former for adfærdsmæssige tests.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> Figur 1: Injektion og implantation. A) Cre-loxP system til ChR2-YFP. Dobbelt floxed optogenetisk værktøj er pakket i en adeno associeret virus (AAV) til injektion i hjernevævet. B)Sagittal syn på virusinjektion og implantation af en optisk neuronal grænseflade til/over IL-regionen i mPFC. Injektion og implantation blev udført ovenfra. Alle interesseregioner, IL, BLA og DRN, vises. C)Detaljeret visning af den implanterede optiske fiber, ærme og lyskilde. D)Spredning af blåt og rødt laserlysstimulation i gråt stof hjernevæv fra en 200 μm lysfiber (Yizhar et al. 2011). Blåt lys spreder, ved maksimum, 0,5 mm ind i vævet, rødt lys omkring 1 mm. Farvekodning: rød 50%, gul 10%, grøn 5%, blå 1%, hvis lyset når dette område. E)Koronal opfattelse af den ensidige implantation direkte over venstre IL med en 200 μm optisk fiber. IL-området har en bredde på 0,25 mm på hver halvkugle og en dybde på 0,2 mm. Blå og røde pærer er boarder af 5% lys spredning og overføres fra Yizhar et al til den rigtige størrelse. LoxP: locus af X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: gult fluorescerende protein; dflox: dobbelt floxed; IL: infralimbe cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsal raphe kerner; PrL: prelimbic region. Dette tal er blevet ændret fra Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Optogenetiske tilgange udnyttes, da det muliggør både høj tidsmæssig og rumlig opløsning14 og celletype specifik graduering. Derudover er det muligt gentagne gange at bruge den implanterede enhed uden yderligere behandling. Efter en stereotaktisk operation, hvor injektion af en adeno-associeret virus bærer optogenetiske værktøj og implantation af den optiske fiber udføres, mus kan komme sig i to uger. Vi har valgt en restitutionstid på kun 2 uger, fordi det er tid nok til at komme sig efter operationen og for virus til at udtrykke. Da de adfærdsmæssige eksperimenter efterfølges af immunhisemi, er vi nødt til at sikre, at mus ikke bliver for gamle under eksperimentet; ellers er vævskvaliteten nedsat. De viser ingen åbenlyse adfærdsmæssige svækkelser fra implantatet og engagere sig i typiske bur adfærd. Selvfølgelig er implantationen ledsaget af en betydelig kirurgisk læsion; derfor overvåges musene intensivt. Efter operationen skal mus være enkelt anbragt, da gruppeop husede mus har tendens til at skade hinandens friske sår og implantater. Men, boligforhold har en stor indvirkning på angst niveau af mandlige mus, som enkelt huse mus viser lavere angst niveauer15 og generelt mindre depressive-lignende symptomer16.
Kemisk eller elektrisk manipulation af hjernekredsløb mangler den høje celletype specificitet af optogenetik og har en lavere tidsmæssig og rumligopløsning 14,17,18. Afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål, elektrisk eller kemisk stimulation kan have forskellige fordele. Når du passerer fiber terminaler i en bestemt region også skal stimuleres, elektrisk stimulation er den bedste metode. Kemisk stimulation er et godt valg, når senderspecifikke receptorer i en hel region skal aktiveres af agonister. En anden stor fordel ved optogenetik i forhold til kemisk eller elektrisk stimulation er, at endogent, neuroner ikke er følsomme over for lys, som undgår forekomsten af bivirkninger19. Faktisk kan høje lysintensiteter fremkalde varmeeffekter8,20, men på grund af ordentlig kontrolgrupper, kan de adfærdsmæssige virkninger på grund af optogenetisk manipulation elimineres.
Undersøgelse gnaver adfærd, især med hensyn til psykiatriske sygdomme, har i høj grad forbedret med optogenetik i frit bevægelige dyr, da det gør det muligt direkte graduering af enkelt receptorer op til specifikke cellepopulationer21 og kredsløb22. Muligheden for at måle de akutte virkninger af sådanne modulationer, samt de langsigtede adfærdsmæssige virkninger efter en defineret tid23 eller efter kronisk stimulation24, giver en bred fleksibilitet af eksperimentelle design og giver meget detaljeret indsigt i hjernen kredsløb. Lysstimulering kan bruges til at modulere neuroner placeret på injektionsstedet for det optogenetiske værktøj. Når både injektion og implantation adresse samme hjerne region, celle organer og ryg fremskrettede axoner af princip neuroner og interneuroner i denne region kan målrettes3,,6,8. Men, den lette fiber kan også implanteres i en region forskellig fra den injicerede en. I dette tilfælde kan lysstimulering modulere senderudløsning ved axonterminaler i projektionsområder i det injicerede område25,26,27.
I undersøgelsen her, optogenetik bruges i kombination med eksperimenter til at analysere angst-relaterede adfærd. Angstrelaterede psykiatriske sygdomme rammer mere end en tredjedel af verdensbefolkning 28,29,30 ogforårsager en stor økonomisk byrde31. De berørte lider af en følelse af ophidselse, spænding og bekymring efterfulgt af undgåelse adfærd32,33. Disse kronisk forekommende negative følelser, som primært er fokuseret på fremtidige begivenheder34, stærkt forstyrre dagligdagen for patienter. Almindelige behandlinger som benzodiazepiner eller selektive serotonin reuptake hæmmere (SSR-præparater) er kun en succes i nogle af patienterne. En stor mængde mennesker reagerer ikke på behandlingen på alle35, viser, at den mekanisme, der ligger til grund for sådanne sygdomme er endnu ikke fuldt forstået. Den mediale præfrontale cortex (mPFC) er kendt for at spille en vigtig rolle i udviklingen og manifestation af angst21,,25,,27,,36,37,38. Specifikt, overaktivering af den infralimbe cortex (IL) region i mPFC kan være en del af angst-relaterede lidelser39,40. Det eksempel eksperiment, der er beskrevet her kunne hjælpe med at forstå, hvordan modulationer i IL-regionen af mPFC påvirke angst adfærd. Derudover kan udviklingen af nye terapeutiske strategier for angstrelaterede psykiatriske sygdomme også potentielt støttes.
2-6 måneder gamle mandlige Nex-Cre mus bruges til at udtrykke ChR2 specifikt i pyramideformede neuroner i IL-regionen i mPFC41. Nex-Cre mus har en C57Bl/6 baggrund og udtrykke enzymet Cre-recombinase specifikt i pyramideformede neuroner. Under en stereotaktisk operation injiceres dobbelt floxed ChR2-DNA i IL-regionen via adeno-tilknyttede virusvektorer. Det optiske implantat placeres direkte over interesseområdet (Figur 1B), og implantatet fastgøres med tandcement. Kontroldyr får en injektion af dobbelt floxed tdTomato-DNA i samme region for at efterligne cellespecifikke udtryk.
Dyr er gruppe-opstærret indtil dagen for operationen og bagefter er enkelt opstærret for at undgå skader fra andre mus. Mus er anbragt i individuelle ventilerede bur (IVC) stativer i TypI-L bure til enkelt opsatte mus. Den lyse-mørke cyklus følger en 12:12 h rytme, lyset fase starter ved 10 AM. Alle adfærdsmæssige eksperimenter udføres i den mørke fase, som ligner den aktive fase af gnavere. Vand og standard mad pellets er tilgængelige ad libitum. Efter to ugers restitution, som sikrer et tilstrækkeligt udtryk for ChR2 i pyramideale neuroner, bruges mus til adfærdsmæssige eksperimenter.
Open Field (OF) er en 50 cm x 50 cm firkantet labyrint med sandblæste 40 cm høje vægge. Jorden er opdelt i 16 felter, hvor den indre 4 repræsenterer midten. Den målte funktionsmåde er: 1) tid brugt i midten, 2) antal centerposter og 3) samlet tilbagelagt distance. Under dette eksperiment er der 4 forsøg på i alt 20 minutter. I forsøg 1 og 3 sker der ingen lysstimulering, og i forsøg 2 og 4 udføres en 20 Hz stimulering med 5 ms lysimpuls og 1 mW lysintensitet på 473 nm (Figur 2A). I de senere forsøg blev der taget hensyn til tilvænning til testområdet, men brugen af sham-injicerede kontroldyr angiver, hvordan tilvænning udtrykkes.
Barnes Maze er et eksperiment for læring og hukommelse. Det er en cirkulær platform, der er 92 cm i diameter og indeholder 20 lige store huller omkring omkredsen. 19 af hullerne er lukket, og under et hul en flugtkasse præsenteres. I 4 på hinanden følgende dage har mus 4 træningsforsøg for at lære, hvor flugtboksen er. På den5. dag fjernes flugtboksen, og musene testes for, hvor meget tid de har brug for til at finde det rigtige hul. Den målte adfærd er: 1) Tid, indtil flugtboksen / det korrekte hul er fundet, 2) Antal målbesøg og fejl og 3) Afstand flyttet til i flugtboksen. Lysstimuleringen i forskellige grupper sker enten under erhvervelse eller konsolidering, som finder sted på træningsdagen 1-4, eller under hentning på testdagen, som er dag 5 (Figur 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> Figur 2: Adfærdsmæssige eksperimenter med optogenetiske protokoller. A)Skematisk tegning af Open Field eksperiment med den tilsvarende lys stimulation protokol. C)Skematisk tegning af Elevated-Plus Maze eksperiment med den tilsvarende lysstimuleringsprotokol. D)Skematisk tegning af Barnes Maze eksperiment med den tilsvarende lys stimulation protokol. EPM: Forhøjet Plus Labyrint; AF: Åbent felt; BM: Barnes labyrint test. Dette tal er blevet ændret fra Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For optogenetisk stimulation skal lysintensiteten og -hyppigheden tilpasses det optogenetiske værktøj og den neuronale type, der undersøges. Den lavest mulige lysintensitet bør anvendes for at undgå beskadigelse af vævet, da flere undersøgelser har vist, at der er mulige varmeeffekter på grund af stærklysintensitet 8,20. For ChR2 anvendes en 20 Hz stimulation med en lyspuls på 5 ms almindeligt2. Da ChR2 er ret lysfølsom, er 1 mW lysintensitet tilstrækkelig. Lysstimuleringsprotokollen veksler mellem lys fra og på forsøg for direkte at måle adfærdsændringer. De eksterne rumbetingelser for adfærdsmæssige eksperimenter bør forblive stabile for hele gruppen af dyr. Vigtige betingelser at overveje er støj (husk på, at enhederne selv kan gøre støj), lugten (altid rense adfærdsmæssige opsætninger med ethanol), lysintensiteten, og eksperimentatoren. Eksperimentatoren skal altid være den samme person. Desuden bør tidspunktet på dagen for forsøgene være det samme for alle dyr i en gruppe, et par timer efter starten på den mørke fase i anlægget foretrækkes.
Målet med dette eksperiment er at øge excitation / hæmning (E / I) forholdet i IL-regionen gennem stærk aktivering af excitatoriske pyramideformede neuroner. En forbedret E / I forholdet i denne særlige cortex region er kendt for at øge angst niveauer i mus40,,42,,43,,44.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

Optogenetisk modulering af neuronale kredsløb i frit bevægende mus påvirker akut og langvarig adfærd. Denne metode er i stand til at udføre manipulationer af enkelte neuroner og region-specifikke sender frigivelse, op til hele neuronal kredsløb i centralnervesystemet, og giver mulighed for direkte måling af adfærdsmæssige resultater. Neuroner udtrykke optogenetiske værktøjer via en injektion af virale vektorer bærer DNA valg, såsom Channelrhodopsin2 (ChR2). Lys bringes ind i specifikke hjerneregioner via kroniske optiske implantater, der ender direkte over målregionen. Efter to ugers restitution og korrekt værktøjsudtryk, mus kan gentagne gange anvendes til adfærdsmæssige tests med optogenetisk stimulation af neuroner af interesse.
Optogenetisk graduering har en høj tidsmæssig og rumlig opløsning, der kan opnås med høj cellespecificitet, sammenlignet med de almindeligt anvendte metoder såsom kemisk eller elektrisk stimulation. Lyset skader ikke neuronalt væv og kan derfor bruges til langsigtede eksperimenter samt til flere adfærdsmæssige eksperimenter i en mus. Mulighederne for optogenetiske værktøjer er næsten ubegrænset og gør det muligt aktivering eller lyddæmning af hele neuroner, eller endda manipulation af en bestemt receptor type ved lys.
Resultaterne af sådanne adfærdsmæssige eksperimenter med integreret optogenetisk stimulation visualiserer direkte ændringer i adfærd forårsaget af manipulation. Adfærden af det samme dyr uden lys stimulation som en baseline er en god kontrol for inducerede ændringer. Dette giver en detaljeret oversigt over neuronal typer eller neurotransmitter systemer involveret i specifikke adfærd, såsom angst. Plasticiteten af neuronale netværk kan også undersøges i detaljer gennem langsigtet stimulation eller adfærdsmæssige observationer efter optisk stimulation. Optogenetics vil bidrage til at oplyse neuronal signalering i flere former for neurologiske sygdomme.

Formålet med denne protokol er at måle ændringer i adfærden af genetisk modificerede mus under en optogenetisk eksperiment. Optogenetisk manipulation sker ved injektion af en adeno associeret viral vektor. Lysstimulation i frit bevægende mus er muligt via implantation af en lys fiber direkte over området af interesse.
I figur 4præsenteres resultaterne af et optogenetisk eksperiment. En stærk aktivering af excitatoriske pyramideformede neuroner i IL-regionen via ChR2 øget angst-relateret adfærd i Open Field. ChR2 blev injiceret i IL-regionen i mPFC i Nex-Cre mus for udtryk i pyramideale neuroner (Figur 4A). Under to angsttest stimuleres Open Field (Figur 4B,C) og den nyhed undertrykte fodringstest (Figur 4F,G), ChR2 med blåt lys og aktiveres pyramideformede neuroner. Som kontrol fik en anden gruppe mus en injektion af fluorophore tdTomato i stedet for ChR2 (Figur 4D,G). I et sådant eksperiment, er angst defineret som undgåelse af lysere centrale område. Mus viser en iboende undgåelse af åbne områder, fordi de er bekymrede for rovdyr.
I Open Field eksperiment, vist i figur 4B, mus udført 4 forsøg på 5 minutter hver. I forsøg 1 og 3 opstod der ingen lysstimulering (Off1,2) og i forsøg 2 og 4 blev der udført blåt lysstimulering med 20 Hz (5 ms lysimpuls) og 1 mW-intensitet (On1,2). Heatmaps viser, at i den eksperimentelle gruppe, centret varighed varierede mellem Off og On forsøg. Under lysstimulering bliver mus fortrinsret i grænseområdet. Kontrol dyr foretrækker også grænsen, men ændrer ikke deres adfærd ved lysstimulering. I figur 4Cvises de vigtigste adfærdsmæssige målinger under open field-eksperimentet for forsøgsgruppen. Hvis dataene bestod Shapiro-Wilk-testen for normalitet, blev statistikkerne udført med en uafhængig tosidet t-test. Hvis normalitetstesten mislykkedes, blev Mann-Whitney-Rank Sum testen brugt som ikke-parametrisk alternativ. For disse former for eksperimenter, en inden for gruppen sammenligning blev valgt til at undersøge, om lys stimulation direkte kan ændre angst adfærd over tid, uafhængigt af baseline angst af eksperimentelle og kontrol dyr. Centrets varighed faldt betydeligt under begge lysstimuleringsforsøg, hvilket indikerer øget angstniveau. Den samlede afstand flyttet blev ikke ændret, viser, at locomotor adfærd ikke blev påvirket. Antallet af centerindgange blev øget, men ikke væsentligt. I figur 4Dvises data for kontrolgruppen. Kontroldyr viste ingen adfærdsændringer mellem Off og On-forsøg i nogen af de analyserede parametre, hvilket viste, at lysstimulering eller implantation ikke forårsagede de observerede virkninger. Alt i alt viser denne test øget angst under lysstimulering af IL pyramideale neuroner via ChR2.
I figur 5vises dataene for et mislykket optogenetisk eksperiment for Den Forhøjede Plus-labyrint. Under Elevated-Plus Maze eksperiment, som præsenteres i figur 5A, mus afsluttet 6 forsøg på 3 minutter hver. I forsøg 1, 3 og 5 blev der ikke udført lysstimulation (Off1, Off2, Off3) og i forsøg 2, 4 og 6, blåt lysstimulering med 20 Hz (5 ms lysimpuls) og 1 mW intensitet blev udført (On1, On2, On3). I disse eksemplariske resultater var længden af den optogenetiske protokol og selve labyrintens konstruktion ikke egnet til den transgene muselinje. I figur 5Bkan det ses, at flere mus gled ud af labyrinten med deres rygpoter eller endda faldt ned. Da dette skete, mus fik en ny chance for at udføre EPM en dag senere. Hvis de faldt ned igen, blev de udelukket fra analysen. Når mus gled ud flere gange, men formåede at blive på labyrinten, data blev analyseret normalt. Ikke desto mindre skal dataene fortolkes meget omhyggeligt, og kontroldyrene får større betydning. Nex-Cre mus havde motoriske vanskeligheder med at blive på de smalle åbne arme. For at undgå dette, små vægge, med en højde på 1 cm, ville have hjulpet til et sikkert greb om ryggen poter på armene af labyrinten. Både heatmaps og graferne viser, at eksperimentelle, samt kontrol mus, begyndte at undgå de åbne arme fra forsøg 2 (On1) på (Figur 5C-E). Tiden på de åbne arme er betydeligt reduceret for begge grupper, som er de åbne arm poster. Analyse af den eksperimentelle gruppe opnåede kun data, der implicerer en stor angstbaseret effekt af lysstimuleringen, da tiden på den åbne arm og åbne armindgange reduceres betydeligt under On1-forsøget. Men når man sammenligner disse data med kontrolgruppen, som viser den samme adfærd, bliver det klart, at den observerede adfærd ikke er medieret af den optogenetiske stimulation, men ved at undgå de åbne arme i almindelighed på grund af tilvænning til labyrinten. Disse data understreger vigtigheden af en korrekt kontrolgruppe for at skelne mellem adfærdsmæssige effekter medieret af optogenetisk stimulation og mulig adfærdsmæssig tilpasning. Også, denne data kaster lys over betydningen af korrekt tilpasning af en eksperimentel opsætning, der passer til den specifikke mousse linje og eksperimentelle spørgsmål.
For at validere og styrke indsamlede adfærdsdata fjernes hjerner af mus efter det sidste eksperiment for at kontrollere for den korrekte injektion og implantation (Figur 6). Hjerner er fastsat i 4% paraformaldehyd og fjernet fra kraniet. Hjerner er dehydreret i 30% saccharose i 1-2 dage og kryosliced bagefter. De 40 μm tykke koronale hjerneskiver vaskes og monteres på superfrostmålsdias med et monteringsmedium, der indeholder DAPI, som pletter cellekerner. Dette gør det muligt at identificere målområder i koronale skiver. Fluorescens af YFP-tag eller tdTomato selv angiver placeringen af virus injektion. I figur 6B præsenteres de eksemplariske injektionssteder for ChR2-YFP til venstre (gul) og tdTomato til højre (rød). Ved hjælp af en skabelon, tilpasset fra Paxinos og Franklin45 mus hjernen atlas, kan IL-regionen identificeres. I begge dias udtrykkes det optogenetiske værktøj i IL-regionen, men også i tilstødende hjerneregioner. For en korrekt fortolkning konsulteres spredningen af blåt lys i hjernevæv8 (Figur 1D,E). Det kan ses, at det blå lys vil nå DP-regionen under IL med kun mindre end 5% af den oprindelige 1 mW lysintensitet ved fiberspidsen (Blå linje i figur 1D)8. Derudover kan en lille mængde lys gå opad til PrL-regionen på grund af back-scattering47. Derfor kan man sige, at IL-regionen er belyst mest, men tilstødende regioner som DP og PrL-regionen kan også være lidt stimuleret. Derfor er IL-celle specifik stimulering ikke garanteret, og immunhiskemisk analyse af de tilstødende regioner bør udføres for at se, om aktiviteten af PrL- og DP-celler moduleres via lys. I figur 6Cvises en anden vigtig kontrolkontrol: specificiteten af Nex-Cre-muselinjen. Via antistof farvning mod de to celletyper i IL-regionen, glutamatergic princip neuroner og GABAergic interneurons, Det kan ses, at ChR2-YFP udtryk kun forekommer i glutamatergic neuroner og ikke med GABAergic dem.
Alt i alt viser vores eksperimenter, at med optogenetisk manipulation under adfærdstest, kan ændringer i angst-relateret adfærd observeres. Ved at bruge mere end én test for den samme adfærd, kan en pålidelig konklusion drages. Desuden bekræfter immunhisistokemisk analyse de opnåede data. Vores eksperimenter tyder på, at den specifikke aktivering af pyramideale neuroner i den infralimbic cortex øget angst-relaterede adfærd i visse analyser.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> Figur 4: Optogenetisk aktivering af IL pyramideformede neuroner øger angst adfærd. Lysstimulering under forsøg: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A)Skematisk tegning af injektions- og implantationsstedet for ChR2-YFP eller tdTomato til IL. Under eksperimentet aktiveres pyramideuroner i IL-regionen i mPFC af ChR2. Saggital hjerne skiver tilpasset fra Paxinos og Franklin mus hjerne atlas, saggital: lateral o,6. B)Open Field labyrint med lys stimulation protokol (20 min med 4x5 min skiftevis Off og On forsøg; venstre) og varme kort over eksemplarisk ChR2-injiceret (EXP) og tdTomato-injiceret (CT) mus i alle 4 forsøg af forsøget (højre). EXP dyr bruger mindre tid i midten af OF, når stimuleret med blåt laserlys. For CT-dyr varierer den tid, der bruges i midten, ikke mellem let off og on-forsøg. C) Gruppedata for EXP-dyr i OF, n=11. Mus bruger betydeligt mindre tid i midten af OF, når stimuleret med blåt lys (Off1 39,49±6,9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0.033, *; Off1:On2, MWRS, p=0,049, *). Afstand flyttes ikke påvirkes (Off1 2703.09±292.65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). # af center poster falde med tiden, men viser ingen væsentlige forskelle (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D)Gruppedata for CT-dyr i OF, n=15. Tid mus tilbringer i midten af OF, den afstand flyttet, # af center poster ændrer ikke mellem lys Til og Fra forsøg (Tid i midten Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Afstand Fra 1 3399,69±296,77 cm, On1 3210,6±446,9 cm, Off2 3030,28±513,83 cm, On2 2955±617,7 cm; # af center poster Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). CT-mus viser signifikant højere baseline angst (Off1 EXP: CT, MWRS, p = 0,005, **). Værdier er middelværdi±S.E.M. * angiver signifikante forskelle (p≤0,05), ** angiver signifikante forskelle (p≤0,01). t-test altid to-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL: infralimbe cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsal raphe kerner; AF: Åbent felt; CT: kontroldyr EXP: forsøgsdyr L: lys. Dette tal er ændret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> Figur 5: EPM-eksperimentet viste ikke adfærdsmæssige effekter i Nex-Cre-mus. Lysstimulering under forsøg: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A)Forhøjet-Plus Maze med lys stimulation protokol (18 min, 6x3 min, skiftevis Off og On forsøg). B)Gruppedata for mus, der "glider af" er inkluderet i dataene, i alt n=23. Nex-Cre mus havde en tendens til at glide ud af den åbne arm med deres ryg poter, uafhængig af den eksperimentelle gruppe (venstre). Kun mus, der blev på labyrinten i alle 6 forsøg, blev overvejet i senere analyser. Slip off's i den første Off1 fase er grund til senere undgåelse af de åbne arme (Off1 EXP 1,63±0,6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Cirkeldiagram (til højre) viser mus, der falder ned fra labyrinten i løbet af 18 min med 42,42%. Kun 57,57% afsluttede eksperimentet. C)Heat kort over eksemplariske EXP og CT mus i alle 6 forsøg med forsøget. Begge grupper viser et fald i åben arm varighed efter Off1 retssagen. D)Gruppedata for EXP-dyr i EPM, n=12. Tid brugt i de åbne arme faldt betydeligt i løbet af de første to forsøg og konstant bagefter (Off1 73,91±12,22 s, On1 36,15±14,65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). Den tilbagelagte afstand påvirkes ikke (Off1 679.96±71.63 cm, On1 712.24±112.82 cm. Off2 717.49±97.39 cm, On2 782.51±81.11 cm, Off3 722.11±68.60 cm, On3 663.90±106.57 cm). Mængden af åbne armindgange falder betydeligt fra 1 til On1 og forbliver derefter konstant (Fra1 8,08± 1,08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Fra1:On1, t-test, p=0,002, **). Den tid, der bruges i midten af EPM falder langs forsøg, men viser ingen væsentlig forskel fra Off til On retssag (Off1 41,71±5,34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E)Gruppedata for CT-dyr i EPM, n=11. CT-data viser de samme betydelige fald som EXP-data, hvilket indikerer, at eksperimentet ikke har fungeret korrekt (Tid i åbne arme Off1 86.92±12.74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; Afstand 1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm; Off2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±111.99 cm, Off3 716.99±132.47 cm, On3 663.03±132.46 cm; Åbne armposter Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p=0,01, *; Tid bruger i centrum Off1 35,89 s, On1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Værdier er gennemsnitlige ± S.E.M. * angiver signifikante forskelle (p≤0,05), ** angiver signifikante forskelle (p≤0,01). t-test er altid to-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Forhøjet Plus Labyrint; CT: kontroldyr EXP: forsøgsdyr OA: åbne arme. Dette tal er ændret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> Figur 6: Injektionsside af ChR2 og tdTomato i IL- og Nex-Cre-specificiteten. A)Skematisk tegning af implantationsstedet på koronale hjerneskiver ved AP + 1,66 mm, ml 0,3 mm, DV -1,8 mm, med ensidig injektion og implantation (tilpasset fra mus hjerne atlas, Paxinos og Franklin, Bregma +1.54 mm). B)Eksemplariske injektionssteder af ChR2-YFP (venstre, gul) og tdTomato (højre, rød) fusioneret med DAPI farvede cellekerner (blå) i Nex-Cre mus. Skalabar 1 mm. Indlæg viser høj forstørrelse af IL-regionen. Skalabar 150 μm. Hvide bokse angiver placeringen af indlæg. C)Øverste række: konfokale billeder af den venstre IL-region af en Nex-Cre-mus, der er plettet med CamKII som markør for glutamatergic neuroner (blå) og ChR2-YFP (gul) eller Gad67 som markør for GABAergic neuroner (grøn), af en Nex-Cre-mus. Nederste række: colocalization af ChR2-YFP (gul) med CamKII (venstre, blå), men ikke med Gad67 (højre, grøn), viser specificitet af Nex-Cre mus for glutamatergic neuroner. Skalabar 50 μm. PrL: prelimbic cortex; IL: infralimbe cortex; DP: dorsal peduncular cortex. Dette tal er ændret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Med optogenetisk manipulation af specifikke neuronale populationer eller hjerneregioner, adfærd kan ændres med høj tidsmæssig og rumlig opløsning i frit bevægelige dyr. Ved at bruge forskellige optogenetiske værktøjer i kombination med kronisk implanterede optiske fibre, en række neuronale modulationer og adfærdsmæssige test kan udføres.

Optogenetic Manipulation af Neuronal aktivitet for at modulere adfærd i frit bevægende mus

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Med optogenetisk manipulation af specifikke neuronale populationer eller hjerneregioner, adfærd kan ændres med høj tidsmæssig og rumlig opløsning i frit bevægelige dyr. Ved at bruge forskellige optogenetiske værktøjer i kombination med kronisk implanterede optiske fibre, en række neuronale modulationer og adfærdsmæssige test kan udføres. Det ultimative mål for optogenetik er graduering af neuronal kredsløb med høj tidsmæssig og rumlig opløsning i opfører dyret.I modsætning til farmakologiske eller elektriske manipulationer giver optogenetics mulighed for præcis kontrol af specifikke celletyper på neuronale kredsløb. Optogenetik er den perfekte måde at målrette specifikke celletyper i specielt defineret region under adfærd, og at undersøge den direkte virkning af ændringer i sådanne mikrokredse. Vi vil nu præsentere et skridt til trin guide, hvordan man forbereder og plante og gennemføre optogenetik i en frit bevægende mus.Til fremstilling af det optiske implantat skal en keramisk ferrule flad side op i en bænk skruestik. Strip koden for en 200 mikrometer diameter glasfiber, med en fiber stripping værktøj og skæres to til tre centimeter ikke stykker med en keramisk fiber skriver. Placer stykke glasfiber i den keramiske ferrule derefter placere en dråbe en superlim på den flade side med en injektion kannul.På den runde side af den keramiske ferrule skæres glasfiberen så kort som muligt og placeres præimplantatet ved en ferrulepolerings puck for at polere den runde side på fire forskellige udgivelsespapirer. Derefter skæres glasfiberen på den flade side af den keramiske ferrule til den længde, der er nødvendig for implantation. Brug en mus hjerne atlas til at beregne længden af implantatet.Implantatet skal ende direkte over området af interesse. Før implantationen påføres anæstesi. Den præcise og æstetiske teknik er beskrevet i manuskriptet.Når musen når en dyb tilstand af anæstesi, placere den på en varmeplade og fastgør hovedet i en stereotaktisk ramme. Fix næse og tænder i front og ører på begge sider. Påfør en algesia med en cuprofen subkuntaneously ind i bagsiden af musen og anvende uigennemsigtig øjensal på begge øjne for at beskytte dem mod tørring.Fugt håret på hovedbunden med en våd køkkenrulle og skær det derefter af ved hjælp af en saks. Sørg for at fjerne alle de løse hår med en våd køkkenrulle. Brug en bomuldspind til at desinficere hovedbunden med en tinktur indeholdende jod.Hæv hovedbunden om regionen af interesse med en pincet og skære en centimeter langs midterlinjen. At ru kraniet for implantation, anvende en lille mængde fosforsyre på arret og lad det træde i kraft i 15 sekunder. Fjern al syre med en bomuldspind og skyl arret med natriumchlorid to gange.For korrekt injektion beregnes F-faktoren for individuelle koordinater. Placer et glas kanylære i stereoctatic rammen og finde det direkte over bregma. Nu nul koordinatsystemet og flytte glaskanylen til Lambda.Beregn F-faktoren med følgende formel. Bregma minus Lambda divideret med 4,2 er lig med F-faktoren. Nøjagtige koordinater er meget vigtige for injektion og implantation, fordi ellers, hvis den forkerte struktur stimuleres så de adfærdsmæssige virkninger er uspecifik.Alle mus har mindst mulig afvigelser i størrelsen af deres kranium, derfor er koefficienten absolut obligatorisk. Brug de justerede koordinater til at finde placeringen på arret direkte over interessestrukturen. Brug en injektionsdyle til at bore et hul i kraniet ved at dreje kanylen på stedet.For at tage en virusopløsning ind i glaskanylen, der er forbundet med sprøjten, skal du placere en dråbe natriumchlorid på kraniet og et stykke pirophen på toppen. Anlække en dråbe to mikrolitervirusopløsning på pirophen, og sænk spidsen af glasdålen ned i virussen. Påfør undertryk og vent, indtil virusopløsningen er taget op af kanylen.Nul til denne koordinat, når spidsen af virus med kanyle er på niveau med kraniet og langsomt sænke det ind i borehullet til den laveste position af injektion side. Påfør en lille mængde positivt tryk med sprøjten, indtil menisken er sænket. Lad virussen sprede sig i to til tre minutter, før glasdylen flyttes opad til næste position.Fjern glasdylen meget langsomt og kassér det efter den sidste injektion. Gør kraniet klar til implantation. Tør kraniet med trykluft, anvende primer med denne tilsvarende pind og lad det tørre i 15 sekunder.Påfør bindingen med samme pind og hærde det i 20 sekunder med UV-lys. Anstænk implantatet i den tilsvarende holder, og placer spidsen af glasfiberen direkte over borehullet og sænk det forsigtigt. Stop sænke implantatet, når den resterende ventil af superlim rører kraniet.Implantation af optiske fibre kan også gøres for bilaterale strukturer som hippocampus. Dette muliggør let stimulering på begge halvkugler på samme tid eller tillader stimulering af to forskellige strukturer. Det er også muligt at injicere virus på et andet sted end det optiske fiberimplantat.Hvis injektionen og implantationen udføres i forskellige områder, skal alle de nødvendige huller bores efter påføring af fosforsyre, men før den to komponentvedhæftning. Check igen, hvis kraniet stadig er helt tørt, derefter anvende flydende dental cement omkring implantatet og i det omkringliggende område derefter helbrede i 20 sekunder med UV-lys Påfør to mere mindre cement i helt pels fri og tørret kraniet område. Hærd hvert lag med UV-lys.For at afslutte operationen anvende jod salvelse på hele såret. Slip næse- og ørefikseringen, bring musen ind i et nyt bur og læg den under en varmelampe for at undgå tab af kropsvarme. Kontroller det helbredstilstand mindst en gang om dagen, og det vil postoperative og algesi efter tre dage, hvis det er nødvendigt.Efter to ugers restitution, mus kan bruges til adfærdsmæssige eksperimenter. Åbn Pulser-softwaren, og vælg den USB-com-port, som lyskilden er tilsluttet. Vælg betjeningstilstand tre for at tillade en ekstern software at styre lyskilden.Vælg den korrekte justering for 20 Hertz stimulation med fem millisekund lys puls. Tryk på startsekvens for at finde division, der skal kommunikeres med pulseren. Denne status forbliver, indtil forsøgene er færdige.Opret nu et nyt eksperiment i EthoVision XT, gå til fil, vælg ny fra skabelon og vælg anvend en foruddefineret skabelon. Vælg live tracking og vælg kameraet med kilde og bekræfte den tilsluttede Puslar Gen-Eye cam. Vælg musen som det dyr, der skal registreres.Vælg arenaskabelonen, det åbne feltfelt og zoneskabeloncentret, kanten, hjørnerne. Bekræft et emne, som skal spores og vælge midtpunkt, næsepunkt og hale base. Bekræft, at dyrefarven sammenlignet med baggrunden er mørkere, og at den anbefalede prøvehastighed afsluttes.Navnd eksperimentet passende og vælg en placering for at gemme. Indtil du finder arenaindstillingerne, åbner kameraet automatisk et baggrundsbillede. Tilpas de foruddefinerede zoner til den virkelige arena ved hjælp af pilen, og de to symboler på den er rigtig.Hvis nogle zoner er unødvendige, skal du slette dem. Tryk trække skala for at kalibrere og sætte en linje fra det ene hjørne af labyrinten til den anden. Indtast længden af den reelle afstand i centimeter.Gentag det for den anden akse. Hvis du vil definere indstillingerne for prøvekontrol, skal du forberede hovedreglen ved at justere tilstandstiden til 20 minutter. Betingelsen for Star Trek bør være, når motivet er i arena i to sekunder, for en automatisk status af sporing, når musen er i arenaen.Hvis du vil oprette en underregel for lysstimuleringen, skal du gå til strukturer, mere og vælge underregel. Placer den under hovedreglen og spred de to kasser. Gå til betingelser, tid og give det et navn som lys på en, justere betingelse er opfyldt med efter fem minutter.Placer boksen direkte bag reglens startboks i underreglen. Gå til handling brugerdefineret hardware og navngive det med lys på én. Vælg handling til at udføre som: Jeg vil sætte en høj.Placer boksen direkte bag tilstandsboksen. Gentag de trin, der skal programmeres lys ud til i lys på. Gå nu til strukturer, underregelreference og kontroller, at referencen tilhører den korrekte underregel.Vælg startbetingelser som uden forsinkelse, og start betingelser som eksekvering én gang pr. start-betingelse. Placer referenceboksen mellem de ekstra bøger en og betingelse bøger to af hovedreglen. Definer nu registreringsindstillingerne for at vise systemet, hvad det skal spore.Placer en test miles i arenaen og vælg automatiseret opsætning. Vælg gnaver som dyr type og bruge musemarkøren til at tegne en boks omkring musene i arenaen. Bekræft resultaterne af pleje spørgsmål med ja.For det åbne felt eksperiment, bringe den eksperimentelle mus til adfærdsrummet lige før eksperimentet for at sikre en ordentlig grad af angst. Par musen være en slids af lyskilden ved at trykke den forsigtigt til nettet af buret. Placer den i et ventende bur med frisk strøelse i 10 minutter for at få akklimatiseret til lyskablet.Start erhvervelse ved at trykke på stop-knappen, og du til vision XT. Overfør musen fra venteburet ind i øverste venstre hjørne af det åbne felt. Lad det visuelle felt af musen under eksperimentet og bevare roen. Efter 20 minutter, når eksperimentet er færdigt, skal du fjerne musen fra labyrinten, afbryde lyskablet og sætte det tilbage i sit eget bur.Ved en kontrol visualisering, kan forskellene i midten tid mellem lys slukket og lys på ansigter ses direkte. Musen bruger mindre tid i midten, når lyset er tændt. For Barnes labyrint eksperiment, bringe alle eksperimentelle mus ind i adfærdsrummet omkring en time før eksperimentet.Forbered Barnes labyrint ved at lukke alle huller undtagen én, og nu som en flugtkasse er placeret. Tilslut en mus i lyskilden ved begge implantater, og placer den direkte ind i midten af Barnes-labyrinten. Tryk på start og skal besøge næste T og fjerne kartonboksen.Vær forberedt på at stoppe retssagen manuelt just in case softwaren ikke genkender hele overgangen. Tag musen ud af labyrinten og fjern forbindelsen til lyskablet. Når du udfører, læring og hukommelse opgave, ikke kun den umiddelbare virkning af manipulation undersøges, men også den langsigtede effekt af manipulation under erhvervelse, konsolidering eller hentning.Til dataanalyse finder du behandlingstilstanden behandlet eller kontrolleret, går til indlejring og vælger prøvekontroltilstand. Vælg tilstandsintervallet fra elementhandlingen Star Trek til elementhandlingslyset tændes på en. Placer indlejringsboksen mellem filterboksbehandlingen og den tilsvarende resultatboks.Dette definerede interval er af en. Gentag trinnene for intervaller på en af to og på to som også for kontrolgruppen. Definer også de parametre, der skal analyseres i analyseprofilen.Vælg den afhængige variabel i zonen, og vælg zonecentret, kropspunktet, midtpunktet, og gå i forsøgsstatistik. Vælg frekvens, akkumuleret varighed, og lad der for at se den første. Tilføj også afstandstræk som variabel.Med denne profil er dataene for den tid, der bruges i midten, centerposter og bedt om at flytte afstand tilgængelige. Hvis du vil udtrække data fra hver division, skal du gå til resultater og vælge statistik og diagrammer ved at trykke på Beregn for at se de analyserede data. Tryk på eksportdata, og vælg de prøvestatistikker og den placering, der skal gemmes.De eksporterede data gemmes som en Excel-fil og med individuelle værdier for hver mus. Derudover skal du gå til varme kort visualisering og tryk plot varme kort, skal du vælge forsøg til højre for at se individuelle varme kort for hver mus og retssag. Gør et højreklik på musen og eksportere varmen kort som billeder.Senere skal du åbne Excel-filen computeren og beregne den gennemsnitlige og standard euro SCM for alle fire forsøg og hver målt konditionering gruppe. For at generere grafer og Sigma plot, kopiere midler og SCM i den korrekte rækkefølge fra den ekstra fil til Sigma plot. Rækkerne skal indeholde data for off en, på én, og kolonnerne indeholder trial, mean og SCM hertz.Marker alle tre kolonner, og gå til at oprette grafer. Markér bjælkeboksen, og vælg ikke-grupperet boks med pil. Mærér hele grafen, gå til hjemmet, markér diagramboksen, og tryk på eksport.Vælg destinationsmappen, og vælg metafil som format. For at beregne statistikker for indhentede data skal du kopiere rigtige data fra Xcel fra én på én, et cetera, og til enkelte kolonner af Sigma plot. Markér de kolonner, du vil sammenligne, og gå til analyse, vælg T-test, og tryk på kør.Endelig kan adfærdsmæssige data vises opdelt i let off og på prøve med yderligere varme kort specialisering. I det åbne felt eksperiment, under lys stimulation af Channelrhodopsin2 og pyramideformede neuroner, centrets varighed er faldet, hvilket indikerer øget angst niveauer. Via immunhisemi kan injektionsstedet og virustilfoldelse bestemmes, også ved specificiteten ved den særlige Cre-afhængige muselinje kan valideres.Man kan tydeligt se, at lyset stimulation af Channelrhodopsin2 forbedre sind neuroner i denne specifikke cortex region øger angst niveauer, sammenlignet med baseline angst før denne stimulation. Denne umiddelbare virkning af manipulation på adfærd er grunden til, at optogenetic bruges i dag for så meget forskning spørgsmål om adfærd. Denne procedure kan bruges til Optogenetisk modulering af enhver ønsket celletype eller neuronal kredsløb i musehjernen.Ved at kombinere denne procedure med passende adfærdsmæssige tests for din forskning, en dybere indsigt i neuronal kredsløb involveret i adfærd og sygdomme af interesse kan opnås.

Research

JoVE Journal

Behavior

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Langsigtet Potentiering af perforante Pathway-dentatgyrus Synapse i frit Opfører Mus

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Afsløring beat Døvhed: Afsløring rytmeforstyrrelser med synkroniseret Finger Tapping og Sanselig Timing Opgaver

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Fladskærms-etagers Air-løftet Platform: en ny metode til at kombinere Behavior med Microscopy eller Elektrofysiologi på Awake Frit Moving Gnavere

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

A Novel Eksperimentel og analytisk tilgang til multimodal Neural dekodning hensigtserklæring Under Social Interaktion i frit-opfører Menneskelige Spædbørn

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Visualizing Motion Patterns in Acupuncture Manipulation

Visualisere Mønstre Motion i Akupunktur Manipulation

Acupuncture manipulation varies widely among practitioners in clinical settings, and it is difficult to teach novice students how to perform acupuncture ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test rPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

Den gnaver Psykomotorisk Årvågenhed Test (rPVT): en metode til vurdering neurobehavioral Performance i rotter og mus

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation af epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) og Sleep i rotter og mus ved akupunktur

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Flerlags Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Billeddannelse i frit bevægende mus med prismeprober og miniaturiseret fluorescensmikroskopi

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

En trådløs, tovejs grænseflade for In Vivo optagelse og Stimulation af neurale aktivitet i frit opfører rotter

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Assessing Activity-based Anorexia in Mice

Vurdering af aktivitetsbaseret anoreksi i mus

Rodents develop activity-based anorexia (ABA) when exposed to a restricted feeding schedule and allowed free access to a running wheel. These conditions ...