Name: optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Grote dank aan Prof Klaus-Armin Narve en Dr Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Duitsland) voor het vriendelijk leveren van Nex-Cre muizen. Ook danken we ons videoteam Yunus Dikici en Ruben Wiesner voor het opnemen en verwerken van de JoVE video voor dit artikel. Bovendien, grote dank aan Kristin Claussen voor haar voice-over en Kimberly Anne Go voor proeflezen van het manuscript.
De gepresenteerde resultaten werden verkregen aan de Ruhr-Universiteit in Bochum en de video werd opgenomen aan de Universiteit van Bremen.
Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 en DFG MA 4692/3-2.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met behulp van licht te manipuleren neuronale signalering is de methode van keuze voor bijna een decennium nu. Sinds 2005, het aantal gepubliceerde artikelen over de ontwikkeling van nieuwe optogenetische instrumenten4,6,8,14,49,50,51 en studies waar dergelijke instrumenten worden gebruikt om hersencircuits21,23,,40,43,,52te onderzoeken , sterk toegenomen. Aan de ene kant, met de enorme diversiteit aan injecteerbare optogenetische instrumenten, implantatie varianten, transgene muislijnen en gedragsexperimenten, de mogelijkheid voor experimenten is spruitstuk en onbeperkt. Aan de andere kant is de mogelijkheid om fouten te maken bij het kiezen van experimentele omstandigheden zeer hoog en de experimenten zijn zo specifiek, dat vaak de vergelijkbaarheid met andere studies moeilijk is.
Kritieke stappen Een belangrijke belangrijke stap van dit protocol is een goede planning. De keuze van het optogenetische instrument moet overeenkomen met de wetenschappelijke vraag. Is het alleen nodig om de algehele activiteit van een neuron of synaps te manipuleren? Dan commercieel geleverde tools zoals ChR221,25,27 en Arch37 zijn een goede keuze. Maar afgezien van dat, als een speciale neurotransmitter systeem of zelfs een enkele receptor moet worden gemanipuleerd, een individuele receptor chimaera is vaak de betere keuze3,6. Verschillende receptor chimaera's met GPCRs, de zogenaamde Opto-XRs, en richtlijnen om ze te produceren zijn al beschikbaar4,50. Naast de keuze van optogenetische gereedschappen is de muislijn in combinatie met het gedragsexperiment ook van cruciaal belang. Verschillende achtergrondstammen, zoals bijvoorbeeld C57Bl/6 en BALB/cByJ, vertonen in sommige opzichten verschillende gedragsfenotypes53,54. C57Bl/6 muizen hebben een lage baseline angst en kunnen worden gebruikt voor anxiogene manipulatie, terwijl BALB/cByJ hogere angstniveaus vertoont en daarom gevoeliger is voor anxiolytische geneesmiddelen. Bovendien kunnen de transgene varianten van deze achtergrondstammen ook variëren in hun fenotype48. Met een goede combinatie van specifieke promotors in combinatie met een optogenetisch gereedschap en transgene muislijn, kan bijna elke gewenste celpopulatie worden gericht.
Een kritieke stap tijdens de operatie is gericht op de juiste locatie. Met behulp van de muis hersenatlas, de juiste coördinaten voor de voorste-achterste as, en mediale-laterale as, en diepte van de structuur kan worden vastgesteld45. In werkelijkheid heeft elke schedel een iets andere vorm en grootte. Zo is de F-factor46 om de stereotactische coördinaten aan te passen heel belangrijk, net als de juiste neus- en oorfixatie tijdens stereotactische chirurgie. Als het hoofd van de muis wordt gekanteld, zal de injectiekanula niet het gewenste gebied van belang richten.
Bovendien is de diameter van de injectie canula ook van cruciaal belang. Als het te klein is, kan er geen virus in het weefsel worden vrijgegeven, als het te breed is, zal de canula virusoplossing lekken op weg naar het gebied van belang. Als de geïmplanteerde optische vezel eindigt direct boven het doelgebied, de virusexpressie in de cortex regio's hierboven maakt niet uit. Maar als het implantaat boven andere regio's wordt geplaatst om axonterminals te stimuleren, zullen de axonen van de bovenste cortexgebieden ook worden geactiveerd door licht en verkregen gegevens vervalsen. Als voorbeeld: De IL-regio en de prelimbic (PrL) regio beide project aan de basale amygdala55,56, maar hebben volledig verschillende functies en rollen in de modulatie van angst26,57., Als het implantaat boven de amygdala wordt geplaatst om axonterminals uit het IL-gebied te activeren en tijdens de injectievirusoplossing ook in de PrL is geplaatst vanwege de verkeerde injectieconula, is het risico op het activeren van axonterminals vanuit de PrL zeer hoog.
Tijdens de voorbereiding van de schedel voor de fixatie van het implantaat is het schaarse gebruik van primer en binding cruciaal voor een betrouwbare en duurzame fixatie. Als het 2-component adhesiesysteem niet dun wordt aangebracht, kan het tandcement na een paar dagen of weken loskomen van de schedel. Bovendien moet de schedel ook volledig worden gedroogd voordat het implantaat wordt bevestigd, omdat het cement anders niet goed aan de schedel wordt bevestigd.
Er bestaan ook kritieke stappen in het gedragsgedeelte van dit protocol. Ten eerste is de bouw van het doolhof erg belangrijk. In elke gedragsopstelling, bestaan verscheidene varianten in de literatuur betreffende grootte en vorm, evenals voor de procedure zelf58,59,60. Het is belangrijk om een variant te kiezen die de gegevens vergelijkbaar en reproduceerbaar maakt. Ook moeten speciale eisen voor gebruikte muislijnen in aanmerking worden genomen43,48. In de representatieve gegevens voor de EPM is te zien dat verschillende Nex-Cre muizen uit het doolhof vielen of meerdere keren weggleden(figuur 2b). Voor deze muizen zou een doolhof met een kleine muur rond de open armen een beter alternatief zijn geweest.
Ten tweede is het van cruciaal belang om alle externe kameromstandigheden constant te houden61, anders zouden verschillende groepen muizen helemaal niet vergelijkbaar zijn. In dit verband is het erg belangrijk om de tijd van het experiment te kiezen als een waar de experimentele setup vacant is en de experimentator altijd aanwezig is. Bovendien moeten gebeurtenissen in het gebouw, zoals bouwwerkzaamheden, het testen van systemen (brandalarm) of de reinigingsdag van de muizeninstallatie, worden overwogen om interferentie met de verkregen gegevens te voorkomen.
Tot slot zijn behandelings- en huisvestingscondities cruciaal voor gedragsexperimenten. Wanneer een implantatie wordt uitgevoerd, moeten muizen alleen worden gehuisvest vanwege het risico op letsel van andere muizen. Om een goede vergelijkbaarheid tussen groepen en een lage fout binnen één groep te garanderen, moet elke muis dezelfde kooigrootte en verrijking hebben. Voor angst-gerelateerde experimenten, enkele huisvesting heeft een aantal voordelen als singe gehuisvest mannelijke muizen tonen een lagere baseline angst niveau, minder variatie in hun angst niveau, en minder depressieve-achtige symptomen15,16. Groepshuis mannelijke muizen kunnen sterk verschillen in hun angstniveau vanwege hiërarchie tussen de muizen. Naast de behuizing is ook een constante en gelijke behandeling van alle muizen en groepen belangrijk. Het grijpen van de muis om de lichtvezel op het implantaat aan te sluiten is zeer stressvol. Daarom moet deze procedure voor elke muis hetzelfde zijn, wat dezelfde techniek en dezelfde experimentator betekent. Bovendien moet de gewenningstijd in de wachtkooi, die bedoeld is om de muis te kalmeren van de stressvolle verbindingsprocedure, ook gelijke omstandigheden hebben in duur, strooisel en positie aan het doolhof. De behandeling binnen de muisfaciliteit is ook van cruciaal belang voor latere gedragsprestaties. Experimentele en controledieren mogen niet op verschillende dagen of door verschillende mensen worden gereinigd, omdat dit ook stressvol is voor muizen. Bovendien mag de reinigingsdag niet de experimentele dag zijn om verschillen in gedrag te voorkomen.
Probleemoplossing Er kunnen verschillende problemen optreden tijdens het protocol. Bijvoorbeeld, het boren van een geheel in de schedel tijdens de stereotactische operatie kan schade aan bloedvaten. Meestal treedt sterke bloedingen op, vooral boven bregma en lambda. Als dit gebeurt, probeer niet om het bloeden te stoppen met katoenen stokken als ze de neiging om nog meer bloeden uit het vat uit te breiden vanwege hun absorptievermogen, in plaats daarvan, direct spoelen met NaCl.
Het kan ook gebeuren dat de druk injectie van het virus oplossing niet werkt. In dit geval kan het zijn dat parafilm, een korst van het braamgat of hersenweefsel, het puntje van de canula verstopt. Verwijder in dit geval de canula langzaam uit de hersenen zonder de x- of y-as te veranderen en gebruik een pincet om 1-2 mm van het voorste deel van de canulapunt te verwijderen. Voordat u de canula opnieuw verlaagt, test u op functionaliteit door een kleine hoeveelheid druk toe te passen om te zien of het virus uit de canulatip komt. Om constipatie te voorkomen, verlaagt u de canula met een constante snelheid en stopt u de beweging niet totdat de diepste diepte van de injectiezijde is bereikt. Als te veel van de canulapunt wordt verwijderd en de diameter te groot is, zal de canula weefsel beschadigen en wordt het risico om het virus in één keer toe te passen verhoogd. Zorg er dus voor dat alleen het verstopte deel van de tip zorgvuldig wordt verwijderd.
Tijdens het gedragsexperiment kan de opzet van het experiment in de videotrackingsoftware (bijvoorbeeld Ethovision XT) problemen veroorzaken. Als de lichtopbrengst bijvoorbeeld niet goed werkt, kan dit om verschillende redenen zijn. De Pulser moet worden geopend, geprogrammeerd en gestart voordat Ethovision XT wordt geopend. De hardware moet correct worden geselecteerd in de "Experimentele setup" (stap 3.2.2.4). Als de verkeerde IO-Box, of iets anders dan "Kostuum Hardware" is geselecteerd, kan het Pulser-apparaat niet worden bediend door Ethovision. Als de test van de lichtopbrengst succesvol is, maar het geprogrammeerde lichtprotocol in 'Proefbesturingsinstellingen' niet werkt tijdens de acquisitie, kan de subregel- of subregelverwijzing onjuist worden gelokaliseerd of zijn de voorwaarden en acties onduidelijk. Bijvoorbeeld: behoort de verwijzing tot de juiste subregel? Is de verwijzing correct geprogrammeerd (bijvoorbeeld hoe vaak wordt de subregel uitgevoerd)?
Bovendien kan het voorkomen dat het dier tijdens "detectie-instellingen" adequaat wordt gevolgd, maar tijdens de overname zijn er monsters waarbij het onderwerp niet wordt gevonden. Controleer in dit geval of de verlichting in de experimentele ruimte is gewijzigd of dat er iets ongewenste schaduwen in het doolhof heeft opgeleverd. De hele onderkant van het doolhof moet dezelfde kleur hebben, omdat de instelling slechts voor één specifieke combinatie werkt. Als om welke reden dan ook verschillende bodemkleuren of schaduwen niet kunnen worden vermeden, definieert u de detectie-instelling in het donkerste deel van het doolhof.
Als u instellingen wilt wijzigen na de verwerving van de eerste dieren, past u deze wijzigingen niet toe in de reeds gebruikte instellingen. Dupliceer ze om ze aan te passen. Dit betekent ook dat de reeds geregistreerde proef niet meer geldig is voor data-analyse. In een dergelijk geval, neem alle dieren voor deze experimentele groep met de oorspronkelijke instellingen, en maak een nieuw experiment daarna waar de opgenomen video's worden geanalyseerd in plaats van live tracking. In dit "van video" experiment kunnen verschillende instellingen worden gebruikt voor analyse zonder verlies van vergelijkbaarheid tussen dieren of zelfs gegevens.
Beperkingen en toekomstige toepassingen Deze methode van het manipuleren van gedrag met optogenetica in vrij bewegende dieren bevat ook beperkingen. Tijdens de operatie is de nabijheid van de twee implantaten beperkt. Voor dubbele implantatie moet de afstand tussen de twee implantaten minimaal de breedte van het apparaat zijn om het implantaat vast te houden. Het apparaat moet het tweede implantaat in het braamgat laten zakken, terwijl de eerste implantaten al zijn gefixeerd. Een oplossing hiervoor zou een schuine implantatie kunnen zijn, waarbij de uiteinden van de glasvezel zeer dichtbij kunnen zijn, terwijl de keramische ferules boven de schedel grotere afstand23,55,56,,,57,,62,,63hebben . Een nadeel van een schuine implantatie is het licht dat zich verspreidt. Wanneer de vezeltip schuin is in plaats van van recht boven, is het gestimuleerde gebied anders. In het geval van twee doelgebieden in de nabijheid moet de veranderde positie van de lichtstimulatie in overweging worden genomen.
Tijdens het gedragsexperiment kan de constructie van het doolhof de optische kabel die op het dier is aangesloten, verstoren. Sommige gedragstests, zoals de licht-donkere doos, bevatten een binnengebied64,,65, en andere doolhoven bevatten compartimenten die de muis moet invoeren. Dergelijke experimenten kunnen niet worden uitgevoerd met deze setup. Als alternatief kan een draadloos systeem een optie22,,26,66zijn. Maar gelukkig kunnen sommige doolhoven, zoals het Barnes Maze, zo worden ingericht dat de muizen in staat zijn om de relevante compartimenten67binnen te komen.
Naast die met gesloten zones, doolhoven die te breed zijn kan ook problemen veroorzaken. Hoe groter het gebied van het doolhof, hoe langer de kabel moet zijn om het dier naar elke positie in het doolhof te laten gaan. Er moet voor worden gezorgd dat het dier niet op de kabel kan stappen of het kan grijpen en bijten. Een oplossing daarvoor zou een constructie kunnen zijn die de redundante kabel oprolt. Een nadeel is dat de sleep om de kabel uit te rollen moeilijk is voor muizen. Deze oplossing zou beter geschikt zijn voor ratten. Een andere mogelijke optie zou kunnen zijn om de lichtstimulatie van tevoren te doen, in plaats van tijdens het experiment, is dit natuurlijk alleen haalbaar als een langetermijneffect als gevolg van de lichtstimulatie optreedt23.
Vergelijking met bestaande/alternatieve methoden Alternatieve methoden zouden chemische of elektrische stimulatie zijn tijdens gedrag8,18. Chemische agonisten of antagonisten zijn in staat om neuronen te activeren of te zwijgen via specifieke receptoren en kunnen ook enkele neurotransmittersystemen38,68manipuleren. Aan de ene kant is de receptor-specificiteit vrij hoog voor chemische stoffen, omdat specifieke agonist of antagonist alleen bepaalde receptorenactiveren 39. Aan de andere kant is de specificiteit voor receptorsubtypes van dezelfde neurotransmittergroep vaak onvoldoende. De meeste chemische stoffen binden zich aan ten minste twee subtypen met verschillende waarschijnlijkheden69. Bovendien kunnen chemische stoffen geen onderscheid maken tussen neuronale celtypen zolang ze dezelfde receptortypen bezitten. Buiten dit, is de tijdelijke en ruimteresolutie slecht voor chemische manipulaties in vergelijking met optogenetica. Agonisten of antagonisten worden vaak mondelingtoegediend 35 of via systemische injecties57,70. Als de infusie van de chemische stof direct in het hersenweefsel wordt gedaan, verschijnen de effecten sneller dan bij orale toepassingen, maar nog steeds op een langzamere tijdschaal dan met lichte stimulatie. Als de toegediende chemische stoffen diffuus in de hersenen en zijn niet specifiek voor neuronale types of hersengebieden, manipulatie van specifieke hersencircuits is het niet mogelijk.
Elektrische stimulatie heeft een hogere temporele resolutie dan chemische stimulatie9,14. De verspreiding binnen in neuronale weefsel is minder dan met chemische stimulatie en de ruimtelijke resolutie is beter dan met chemische stimulatie. Elektrische stimulatie mist echter de mogelijkheid om specifiek verschillende neuronale celtypen of receptortypen aan te pakken, omdat elk neuron in de nabijheid van de elektrode zal reageren op de elektrische stimulatie.
Alternatieve methoden voor het gedrag in vrij bewegende muizen zijn bijvoorbeeld elektrofysiologische opnames in hersensegmenten, waarbij enkele neuronen of axonen kunnen worden gemoduleerd met optogenetica en ontlokte effecten kunnen worden gemeten via het opnemen van elektroden6,71. In vitro experimenten bieden de mogelijkheid om de moleculaire en cellulaire basis van optogenetische stimulaties te onderzoeken, maar hebben de beperking dat intrinsieke connectiviteit en input uit andere hersengebieden ontbreekt. Een andere optie is het gebruik van optogenetica in combinatie met multiphoton imaging1,72. In dit geval hebben muizen hun hoofd gefixeerd en kunnen ze verdoofd worden of wakker zijn om eenvoudige taken op te lossen.
Om een succesvol optogenetisch experiment uit te voeren, zijn er tegenwoordig een breed scala aan tools en toepassingen beschikbaar. De selectie van optogenetische tools en de gedragsopbouw is cruciaal om specifieke onderzoeksvragen te beantwoorden. Als de juiste combinatie van gereedschappen en experimenten wordt gekozen, maakt optogenetica een ongekend, diepgaand onderzoek mogelijk van neuronale schakelingen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Dit zal helpen om nieuwe therapeutische strategieën voor psychiatrische ziekten en cognitie te begrijpen en te ontwikkelen.

De modulatie van neuronale circuits in het centrale zenuwstelsel en hun gedragsresultaten zijn belangrijk om te begrijpen hoe de hersenen werken, vooral in psychiatrische ziekten en cognitieve taken zoals leren en geheugen. Met optogenetica kunnen de enige cellen of de celbevolking tot gehele kringen door licht worden gemoduleerd. Gemeenschappelijke optogenetische instrumenten zoals Channelrhodopsin2 (ChR2) of Archaerhodopsine (Arch) zijn in staat om neuronen te activeren of te dempen, of het vrijkomen van zenders te verhogen of te remmen bij axonterminals die projecteren op verschillende hersengebieden1,,2,,3,4. Arch moet echter zorgvuldig worden gebruikt, omdat werd aangetoond dat de activering ervan bij presynaptische terminals de spontane zenderreleaseverhoogt 5. Arch is een naar buiten corrigerende protonpomp die de pH-waarde in de cel verandert. Dit alkalische milieu induceert calciuminstroom en verbetert de zender release5. Om specifiek intracellulaire signaleringstrajecten te moduleren, kunnen receptorchimera's die bestaan uit een lichtactiverend optogenetisch gereedschap, zoals rhodopsine of kegelopsine, in combinatie met een adequate G-eiwit gekoppelde receptor, worden gemaakt6,7,8. De hoeveelheid en variatie van beschikbare optogenetische gereedschappen is de afgelopen tien jaar aanzienlijk toegenomen.
Het doel van optogenetica is om neuronale circuits te manipuleren tijdens gedrag. Optogenetica maakt bijvoorbeeld het meten van acute gedragsveranderingen mogelijk, zoals veranderingen in angstgedrag. Optogenetische hulpmiddelen worden geleverd in doelgebieden van de hersenen via virale vectoren. Met behulp van speciale promotors en versterkers, of het Cre-loxP-systeem, kan celtype specificiteit worden gewaarborgd voor de expressie van optogenetische instrumenten(figuur 1A). Er zijn verschillende genetisch gemodificeerde muislijnen die het enzym Cre-Recombinase alleen in specifieke celtypen uitdrukken. Bijvoorbeeld, Nex-Cre muizen uitdrukken de Cre-Recombinase in piramidale neuronen in de cortex en de hippocampus onder de controle van de Nex-promotor10. Dit enzym is in staat om DNA-sequenties om te keren, die worden geflankeerd door loxP kanten11. Bijgevolg kan de DNA-sequentie van een dubbel floxed optogenetic tool, die wordt omgekeerd en geflankeerd door loxP kanten, alleen worden getranscribeerd door neuronen die de Cre-Recombinasebezitten, maar niet door andere neuronale types12,13. In het geval van Nex-Cre muizen zal het optogenetische gereedschap uitsluitend worden uitgedrukt in piramidale neuronen. Lichtstimulatie van bepaalde hersengebieden wordt dan bereikt via chronische implantatie van optische vezels direct boven het gebied van belang. Dieren kunnen dan worden gekoppeld aan een geschikte lichtbron en zich vrij gedragen in bijna allerlei gedragstesten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg"> Figuur 1: Injectie en implantatie. A) Cre-loxP systeem voor ChR2-YFP. Dubbele floxed optogenetic tool is verpakt in een adeno geassocieerd virus (AAV) voor injectie in het hersenweefsel. B) Sagitttal view of the virus injection and implantation of an optical neuronal interface into/above the IL region of the mPFC. Injectie en implantatie werden gedaan van bovenaf. Alle regio's van belang, IL, BLA en DRN, worden getoond. C) Gedetailleerde weergave van de geïmplanteerde glasvezel, mouw en lichtbron. D) Verspreiding van blauwe en rode laserlichtstimulatie in grijsstof hersenweefsel van een lichtvezel van 200 μm (Yizhar et al. 2011). Blauw licht verspreidt zich maximaal 0,5 mm in het weefsel, rood licht ongeveer 1 mm. Kleurcodering: rood 50%, geel 10%, groen 5%, blauw 1% als het licht dit gebied bereikt. E) Coronale weergave van de eenzijdige implantatie direct boven de linker IL met een 200 μm optische vezel. Het IL-gebied heeft een breedte van 0,25 mm per halfrond en een diepte van 0,2 mm. Blauwe en rode lampen zijn de boarder van 5% licht verspreiden en worden overgebracht van Yizhar et al. naar de juiste grootte. LoxP: locus van X-over P1; ChR2: Channelrhodopsine; YFP: geel fluorescerend eiwit; dflox: dubbel gevlobbel; IL: infralimbic cortex; BLA: basolaterale amygdala; DRN: dorsale raphe kernen; PrL: prelimbic regio. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Optogenetische benaderingen worden gebruikt omdat het zowel hoge temporele als ruimtelijke resolutie14 en celtypespecifieke modulatie mogelijk maakt. Bovendien is het mogelijk om het geïmplanteerde apparaat herhaaldelijk te gebruiken zonder verdere behandeling. Na een stereotactische operatie, waarbij de injectie van een adeno-geassocieerd virus met het optogenetische gereedschap en de implantatie van de optische vezel wordt uitgevoerd, kunnen muizen twee weken herstellen. We hebben gekozen voor een hersteltijd van slechts 2 weken, omdat dit genoeg tijd is om te herstellen van de operatie en voor het virus om uit te drukken. Aangezien de gedragsexperimenten worden gevolgd door immunohistochemie, moeten we ervoor zorgen dat muizen niet te oud worden tijdens het experiment; anders wordt de weefselkwaliteit verlaagd. Ze tonen geen duidelijke gedragsstoornissen van het implantaat en nemen deel aan typisch kooigedrag. Natuurlijk gaat de implantatie gepaard met een aanzienlijke chirurgische laesie; daarom worden de muizen intensief gemonitord. Na de operatie moeten muizen alleenstaand zijn, omdat groepsmuizen elkaars verse wonden en implantaten hebben verwond. Echter, huisvestingsomstandigheden hebben een grote invloed op het angstniveau van mannelijke muizen, als single gehuisvest muizen tonen lagere angstniveaus15 en in het algemeen minder depressieve-achtige symptomen16.
Chemische of elektrische manipulatie van hersencircuits ontbreekt de hoge cel type specificiteit van optogenetica en hebben een lagere temporele en ruimtelijke resolutie14,17,18. Afhankelijk van de experimentele vraag kan elektrische of chemische stimulatie verschillende voordelen hebben. Bij het passeren van glasvezelterminals in een specifieke regio moet ook worden gestimuleerd, elektrische stimulatie is de beste methode. Chemische stimulatie is een goede keuze voor wanneer zenderspecifieke receptoren in een hele regio door agonisten moeten worden geactiveerd. Een ander groot voordeel van optogenetica in vergelijking met chemische of elektrische stimulatie is dat endogene, neuronen zijn niet gevoelig voor licht, die het optreden van bijwerkingenvermijdt 19. Inderdaad, hoge lichtintensiteiten kunnen leiden tot verwarmingseffecten8,20, maar als gevolg van de juiste controlegroepen kunnen de gedragseffecten als gevolg van optogenetische manipulatie worden geëlimineerd.
Het onderzoeken van knaagdiergedrag, vooral met betrekking tot psychiatrische ziekten, is sterk verbeterd met optogenetica bij vrij bewegende dieren, omdat het de directe modulatie van enkele receptoren tot specifieke celpopulaties21 en circuits22mogelijk maakt. De mogelijkheid om de acute effecten van dergelijke modulaties te meten, evenals de gedragseffecten op lange termijn na een bepaalde tijd23 of na chronische stimulatie24,maakt een brede flexibiliteit van experimentele ontwerpen mogelijk en biedt zeer gedetailleerde inzichten in hersencircuits. Lichtstimulatie kan worden gebruikt om neuronen op de injectieplaats van het optogenetische gereedschap te moduleren. Wanneer zowel de injectie als de implantatie hetzelfde hersengebied aanpakken, kunnen cellichamen en rugprojecterende axonen van principiële neuronen en interneuronen in deze regio worden gericht op3,6,8. Echter, de lichtvezel kan ook worden geïmplanteerd in een andere regio dan de geïnjecteerde. In dit geval kan lichtstimulatie het vrijkomen van zenders moduleren bij axonterminals in projectiegebieden van het geïnjecteerde gebied25,26,27.
In de studie hier wordt optogenetica gebruikt in combinatie met experimenten om angstgerelateerd gedrag te analyseren. Angstgerelateerde psychiatrische ziekten treffen meer dan een derde van de wereldbevolking28,29,30 en veroorzaken een hoge economische last31. De getroffenen hebben last van een gevoel van opwinding, spanning en zorgen, gevolgd door vermijdingsgedrag32,33. Deze chronisch voorkomende negatieve emoties, die vooral gericht zijn op toekomstige gebeurtenissen34, sterk interfereren met het dagelijks leven van patiënten. Gemeenschappelijke behandelingen zoals benzodiazepines of selectieve serotonine heropname remmers (SSRIs) zijn alleen succesvol bij sommige van de patiënten. Een groot aantal mensen reageert helemaal niet op de behandeling35, waaruit blijkt dat het mechanisme dat aan dergelijke ziekten ten grondslag ligt nog niet volledig is begrepen. Het is bekend dat de mediale prefrontale cortex (mPFC) een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling en manifestatie van angst21,25,27,36,37,38. Met name de overactivering van het infralimbic cortex (IL) gebied in het mPFC kan deel uitmaken van angstgerelateerde aandoeningen39,40. Het hier beschreven voorbeeldexperiment kan helpen om te begrijpen hoe modulaties in het IL-gebied van het mPFC angstgedrag beïnvloeden. Bovendien kan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor angstgerelateerde psychiatrische ziekten mogelijk ook worden ondersteund.
2-6 maanden oude mannelijke Nex-Cre muizen worden gebruikt om ChR2 specifiek uit te drukken in piramidale neuronen binnen de IL regio van de mPFC41. Nex-Cre muizen hebben een C57Bl/6 achtergrond en drukken het enzym Cre-recombinase specifiek uit in piramidale neuronen. Tijdens een stereotactische operatie wordt dubbel floxed ChR2-DNA via adeno-geassocieerde virale vectoren in het IL-gebied geïnjecteerd. Het optische implantaat wordt direct boven het interessegebied(figuur 1B)geplaatst en het implantaat wordt gefixeerd met tandcement. Controledieren krijgen een injectie met dubbel floxed tdTomato-DNA in dezelfde regio om celspecifieke expressie na te bootsen.
Dieren zijn groepshuis tot de dag van de operatie en daarna zijn single gehuisvest om verwondingen van andere muizen te voorkomen. Muizen zijn ondergebracht in individuele geventileerde kooi (IVC) rekken in TypI-L kooien voor eenpersoonsmuizen. De licht-donkere cyclus volgt een 12:12 uur ritme, de lichtfase vanaf 10 uur. Alle gedragsexperimenten worden uitgevoerd in de donkere fase, die lijkt op de actieve fase van knaagdieren. Water en standaard voedsel pellets zijn beschikbaar ad libitum. Na twee weken herstel, wat zorgt voor een voldoende expressie van ChR2 in piramidale neuronen, worden muizen gebruikt voor gedragsexperimenten.
Het Open Field (OF) is een 50 cm x 50 cm kwadraat doolhof met gezandstraalde 40 cm hoge muren. De grond is verdeeld in 16 vierkanten waar de binnenste 4 het centrum vertegenwoordigen. Het gemeten gedrag is: 1) tijd doorgebracht in het centrum, 2) aantal middelste inzendingen, en 3) totale afstand verplaatst. Tijdens dit experiment zijn er 4 proeven in totaal 20 minuten. In proeven 1 en 3 treedt geen lichtstimulatie op en in proeven 2 en 4 wordt een 20 Hz-stimulatie met 5 ms lichtpuls en 1 mW lichtintensiteit van 473 nm uitgevoerd(figuur 2A). In de latere proeven werd rekening gehouden met gewenning aan het testgebied, maar het gebruik van met schijn geïnjecteerde bestrijdingsdieren geeft aan hoe gewenning wordt uitgedrukt.
De Barnes Maze is een experiment voor leren en geheugen. Het is een cirkelvormig platform met een diameter van 92 cm en bevat 20 gelijke gaten rond de omtrek. 19 van de gaten zijn gesloten en onder één gat wordt een vluchtdoos voorgesteld. Gedurende 4 opeenvolgende dagen hebben muizen 4 trainingsproeven om de locatie van de escape box te leren. Op de5e dag wordt de escape box verwijderd en worden muizen getest op hoeveel tijd ze nodig hebben om het juiste gat te vinden. Het gemeten gedrag is: 1) Tijd tot de vluchtdoos/correct gat wordt gevonden, 2) Aantal doelbezoeken en fouten, en 3) De afstand bewogen tot in het vluchtvak. De lichtstimulatie in verschillende groepen gebeurt tijdens de verwerving of consolidatie, die plaatsvinden op de trainingsdagen 1-4, of tijdens het ophalen op de testdag, die dag 5 is (Figuur 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg"> Figuur 2: Gedragsexperimenten met optogenetische protocollen. A) Schematische tekening van het Open Veld-experiment met het bijbehorende lichtstimulatieprotocol. C) Schematische tekening van het Elevated-Plus Doolhof experiment met het bijbehorende lichtstimulatieprotocol. D) Schematische tekening van de Barnes Maze experimenteren met de bijbehorende lichtstimulatie protocol. EPM: Elevated-Plus Doolhof; VAN: Open veld; BM: Barnes Maze Test. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Voor optogenetische stimulatie moeten de lichtintensiteit en frequentie worden aangepast aan het optogenetische gereedschap en het neuronale type dat wordt onderzocht. De laagst mogelijke lichtintensiteit moet worden gebruikt om schade aan het weefsel te voorkomen, aangezien verschillende studies hebben aangetoond dat er mogelijke verwarmingseffecten zijn als gevolg van een sterke lichtintensiteit8,20. Voor ChR2 wordt een 20 Hz stimulatie met een 5 ms lichtpuls vaak gebruikt2. Omdat ChR2 vrij lichtgevoelig is, is 1 mW lichtintensiteit voldoende. Het lichtstimulatieprotocol wisselt af tussen licht uit en op proeven om gedragsveranderingen direct te meten. De externe ruimtevoorwaarden voor gedragsexperimenten moeten stabiel blijven voor de hele groep dieren. Belangrijke omstandigheden om te overwegen zijn het lawaai (houd er rekening mee dat apparaten zelf geluid kunnen maken), de geur (reinig altijd de gedragsopstellingen met ethanol), de lichtintensiteit en de onderzoeker. De experimentator moet altijd dezelfde persoon zijn. Bovendien moet het tijdstip van de experimenten hetzelfde zijn voor alle dieren in één groep, een paar uur na het begin van de donkere fase in de faciliteit heeft de voorkeur.
Het doel van dit experiment is het verhogen van de excitatie/remming (E/I) verhouding in het IL-gebied door sterke activering van excitatory piramidale neuronen. Een verbeterde E/I-verhouding in dit speciale cortexgebied is bekend dat het de angstniveaus bij muizenverhoogt 40,42,43,44.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753-64</td>
			<td>Anestasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 % Glucose</td>
			<td>AlleMan Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Injection s.c. for fast recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavioral mazes</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td>Measure anxiety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Ophthalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Sterilant containing iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Monodipharma</td>
			<td></td>
			<td>Iodine oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic ferrules</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFLC230-10</td>
			<td>Implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Fiber Scribe</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSW12.5</td>
			<td>Cutting of the glass fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channelrhodopsin2-YFP virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 20298</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air</td>
			<td>Kontakt Chemie</td>
			<td>Druckluft 67</td>
			<td>Drying of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coordinate system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Stereotactic coordinates for the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Correl Draw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graphical software version 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM500OM</td>
			<td>Production of brain slices for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision XT 14</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>Software for behavioral tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule Polishing Puck</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>D50-F</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord dual</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Patch Cord single</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td>
			<td>Cable, which is connected with the implant via a sleeve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Stripping Tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T06S13</td>
			<td>Stripping glass fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR European</td>
			<td>516-0300</td>
			<td>Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>M&#252;hle Levers</td>
			<td>H&#246;veler Nagerfutter</td>
			<td>Nutrition for the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td>Injection pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradia direct-Flo</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>103322</td>
			<td>Fluid dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>efbe-Schott/Phillips</td>
			<td>R95E</td>
			<td>Prevent the mice from cooling after the surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Integrated into coordinate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection canula</td>
			<td>Braun</td>
			<td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td>
			<td>All injections and to bore hole into the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litter</td>
			<td></td>
			<td>T 1350</td>
			<td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cages</td>
			<td>Zoonlab</td>
			<td>405 cm^2</td>
			<td>Single housing for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optibond FL</td>
			<td>Kerr</td>
			<td>26684E</td>
			<td>Preparation of the skull for implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical glass fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Light fiber for implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetics-LED.STSI</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td>Perfusion of mice to remove the brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 0.02 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LFCF</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 1 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF1D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 30 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF30D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polishing sheet 6 &#181;m grit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LF6D</td>
			<td>Polishing implants round side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser Software</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td></td>
			<td>Software for light device control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl-Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>Connection of implant and light cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumCloride (NaCl)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Rinsing of the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pattex Henkel</td>
			<td></td>
			<td>To Fix the glass fiber in the ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato virus</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Addgene 51503</td>
			<td>Optogenetic tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light</td>
			<td>KoQGHJ</td>
			<td>wireless, 1200 mW/cm^2</td>
			<td>Polymeration lamp for dental cementum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylavet-Xylazin</td>
			<td>cp pharma</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice

Optogenetische modulatie van neuronale circuits in vrij bewegende muizen beïnvloedt acuut en langdurig gedrag. Deze methode is in staat om manipulaties van enkele neuronen en regio-specifieke zender release uit te voeren, tot hele neuronale circuits in het centrale zenuwstelsel, en maakt de directe meting van gedragsresultaten. Neuronen drukken optogenetische instrumenten uit via een injectie van virale vectoren die het DNA van keuze dragen, zoals Channelrhodopsin2 (ChR2). Licht wordt gebracht in specifieke hersengebieden via chronische optische implantaten die eindigen direct boven het doelgebied. Na twee weken herstel en de juiste tool-expressie, muizen kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor gedragstests met optogenetische stimulatie van de neuronen van belang.
Optogenetische modulatie heeft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie die kan worden bereikt met een hoge celspecificiteit, in vergelijking met de veelgebruikte methoden zoals chemische of elektrische stimulatie. Het licht is niet schadelijk voor neuronale weefsel en kan daarom worden gebruikt voor langdurige experimenten en voor meerdere gedragsexperimenten in een muis. De mogelijkheden van optogenetische instrumenten zijn bijna onbeperkt en maken de activering of uitschakeling van hele neuronen mogelijk, of zelfs de manipulatie van een specifiek receptortype door licht.
De resultaten van dergelijke gedragsexperimenten met geïntegreerde optogenetische stimulatie visualiseert direct veranderingen in gedrag veroorzaakt door de manipulatie. Het gedrag van hetzelfde dier zonder lichtstimulatie als basislijn is een goede controle voor geïnduceerde veranderingen. Dit maakt een gedetailleerd overzicht van neuronale types of neurotransmitter systemen die betrokken zijn bij specifieke gedrag, zoals angst. De plasticiteit van neuronale netwerken kan ook tot in detail worden onderzocht door middel van langdurige stimulatie of gedragswaarnemingen na optische stimulatie. Optogenetica zal helpen om neuronale signalering te verlichten in verschillende soorten neurologische ziekten.

Het doel van dit protocol is om veranderingen in het gedrag van genetisch gemodificeerde muizen te meten tijdens een optogenetisch experiment. Optogenetische manipulatie wordt gedaan door injectie van een adeno geassocieerde virale vector. Lichtstimulatie bij vrij bewegende muizen is mogelijk via implantatie van een lichtvezel direct boven het bezienswaardighedengebied.
In figuur 4worden de resultaten van een optogenetisch experiment gepresenteerd. Een sterke activering van excitatory piramidale neuronen in de IL regio via ChR2 verhoogde angst-gerelateerd gedrag in het Open Veld. ChR2 werd geïnjecteerd in het IL-gebied van het mPFC in Nex-Cre muizen voor expressie in piramidale neuronen(figuur 4A). Tijdens twee angsttests, het Open Field (Figuur 4B,C) en de Novelty-Suppressed Feeding test (Figuur 4F,G), wordt ChR2 gestimuleerd met blauw licht en activeert piramidale neuronen. Als controle kreeg een andere groep muizen een injectie van de fluorofofoever tdTomato in plaats van ChR2 (figuur 4D,G). In een dergelijk experiment wordt angst gedefinieerd als het vermijden van het helderdere centrale gebied. Muizen vertonen een intrinsieke vermijding van open gebieden omdat ze bang zijn voor roofdieren.
In het experiment Open Veld, weergegeven in figuur 4B,voerden muizen 4 proeven van elk 5 minuten uit. In de proeven 1 en 3 trad geen lichtstimulatie op (Off1,2) en in de proeven 2 en 4 werd blauwe lichtstimulatie met 20 Hz (5 ms lichtpuls) en 1 mW-intensiteit uitgevoerd (On1,2). De heatmaps laten zien dat in de experimentele groep de centrumduur verschilde tussen Uit en Op proeven. Tijdens lichtstimulatie blijven muizen bij voorkeur in het grensgebied. Controledieren geven ook de voorkeur aan de grens, maar veranderen hun gedrag niet bij lichtstimulatie. In figuur 4Cworden de belangrijkste gedragsmetingen tijdens het Experiment Open Veld getoond voor de experimentele groep. Als de gegevens geslaagd voor de Shapiro-Wilk test voor normaliteit, statistieken werden gedaan met een onafhankelijke twee-tailed t-test. Als de normaliteitstest mislukte, werd de Mann-Whitney-Rank Sum-test gebruikt als niet-parametrisch alternatief. Voor dit soort experimenten werd gekozen voor een binnengroepsvergelijking om te onderzoeken of lichtstimulatie het angstgedrag in de loop van de tijd direct kan veranderen, onafhankelijk van de basisangst van experimentele en controledieren. De centrumduur daalde aanzienlijk tijdens beide lichtstimulatieproeven, wat wijst op verhoogde angstniveaus. De totale verplaatste afstand werd niet gewijzigd, waaruit blijkt dat het bewegingsgedrag niet werd beïnvloed. Het aantal middelste inzendingen werd verhoogd, hoewel niet significant. In figuur 4Dworden de gegevens van de controlegroep weergegeven. Controledieren vertoonden geen gedragsveranderingen tussen Uit en Op proeven in een van de geanalyseerde parameters, waaruit bleek dat lichtstimulatie of implantatie niet de waargenomen effecten heeft veroorzaakt. Kortom, deze test toont verhoogde angst tijdens lichtstimulatie van IL piramidale neuronen via ChR2.
In figuur 5worden de gegevens van een mislukt optogenetisch experiment weergegeven voor het Elevated-Plus Doolhof. Tijdens het Elevated-Plus Maze-experiment, dat wordt gepresenteerd in figuur 5A,voltooiden muizen 6 proeven van elk 3 minuten. In de proeven 1, 3 en 5 werd geen lichtstimulatie uitgevoerd (Off1, Off2, Off3) en in de proeven 2, 4 en 6 werd blauw lichtstimulatie met 20 Hz (5 ms lichtpuls) en 1 mW intensiteit uitgevoerd (On1, On2, On3). In deze voorbeeldige resultaten waren de lengte van het optogenetische protocol en de constructie van het doolhof zelf niet geschikt voor de transgene muislijn. In Figuur 5B, kan worden gezien, dat verschillende muizen gleed uit het doolhof met hun rugpoten of zelfs naar beneden viel. Toen dit gebeurde, muizen kreeg een tweede kans om de EPM uit te voeren een dag later. Als ze weer naar beneden vielen, werden ze uitgesloten van analyse. Toen muizen meerdere keren uitgleed, maar erin slaagden om op het doolhof te blijven, werden de gegevens normaal geanalyseerd. Niettemin moeten de gegevens zeer zorgvuldig worden geïnterpreteerd en worden de controledieren belangrijker. Nex-Cre muizen hadden motorische problemen om op de smalle open armen te blijven. Om dit te voorkomen, kleine muren, met een hoogte van 1 cm, zou hebben geholpen voor een veilige greep van de achterpoten op de armen van het doolhof. Zowel de heatmaps als de grafieken laten zien dat experimentele, evenals controlemuizen, begonnen met het vermijden van de open armen van proef 2 (On1) op (Figuur 5C-E). De tijd op de open armen is aanzienlijk afgenomen voor beide groepen, net als de open arm inzendingen. Het analyseren van de experimentele groep alleen verkregen gegevens impliceert een groot anxigeen effect van de lichtstimulatie, als tijd op de open arm en open arm ingangen zijn aanzienlijk verminderd tijdens de On1 proef. Echter, bij het vergelijken van deze gegevens met de controlegroep, die hetzelfde gedrag vertonen, wordt het duidelijk dat het waargenomen gedrag niet wordt bemiddeld door de optogenetische stimulatie, maar door het vermijden van de open armen in het algemeen als gevolg van gewenning aan het doolhof. Deze gegevens onderstrepen het belang van een goede controlegroep om onderscheid te maken tussen gedragseffecten die worden bemiddeld door optogenetische stimulatie en mogelijke gedragsaanpassing. Ook werpt deze gegevens licht op het belang van het goed aanpassen van een experimentele setup aan de specifieke mousselijn en experimentele vraag.
Om verzamelde gedragsgegevens te valideren en te versterken, worden de hersenen van muizen verwijderd na het laatste experiment om de juiste injectie en implantatie te controleren(figuur 6). Hersenen zijn vastgesteld in 4% paraformaldehyde en verwijderd uit de schedel. Hersenen zijn uitgedroogd in 30% sacharose gedurende 1-2 dagen en cryosliced daarna. De 40 μm dikke coronale hersenplakjes worden gewassen en gemonteerd op superfrost objectieve glijbanen met een montagemedium met DAPI, dat celkernen bevlekt. Dit maakt de identificatie van doelgebieden in de coronale plakjes mogelijk. Fluorescentie van de YFP-tag of tdTomato zelf geeft de locatie van de virusinjectie aan. In figuur 6B worden de voorbeeldige injectieplaatsen van ChR2-YFP aan de linkerkant (geel) en tdTomato aan de rechterkant (rood) gepresenteerd. Met behulp van een sjabloon, aangepast aan de Paxinos en Franklin45 muis hersenatlas, kan de IL-regio worden geïdentificeerd. In beide dia's wordt het optogenetische gereedschap uitgedrukt in het IL-gebied, maar ook in aangrenzende hersengebieden. Voor een goede interpretatie wordt de verspreiding van blauw licht in hersenweefsel geraadpleegd8 (Figuur 1D,E). Men kan zien dat het blauwe licht de DP-regio onder de IL zal bereiken met slechts minder dan 5% van de initiële 1 mW-lichtintensiteit bij de vezelpunt (Blauwe lijn in figuur 1D)8. Bovendien kan kleine hoeveelheid licht omhoog gaan naar de PrL-regio als gevolg van back-scattering47. Bijgevolg kan men zeggen dat de IL-regio het sterkst wordt verlicht, maar aangrenzende regio's zoals de DP- en PrL-regio kunnen ook enigszins worden gestimuleerd. Daarom is il-celspecifieke stimulatie niet gegarandeerd en moet immunohistochemische analyse van de aangrenzende gebieden worden uitgevoerd om te zien of de activiteit van PrL- en DP-cellen via licht wordt gemoduleerd. In figuur 6Cwordt een andere belangrijke controle getoond: de specificiteit van de Nex-Cre muislijn. Via antilichaam kleuring tegen de twee celtypen in het IL-gebied, glutamatergic principe neuronen en GABAergic interneurons, kan worden gezien, dat de ChR2-YFP-expressie alleen voorkomt in glutamatergic neuronen en niet met GABAergic degenen.
Al met al tonen onze experimenten aan dat met optogenetische manipulatie tijdens gedragstesten veranderingen in angstgerelateerd gedrag kunnen worden waargenomen. Door meer dan één test voor hetzelfde gedrag te gebruiken, kan een betrouwbare conclusie worden getrokken. Bovendien bevestigt immunohistochemische analyse de verkregen gegevens. Onze experimenten suggereren, dat de specifieke activering van piramidale neuronen in de infralimbic cortex toegenomen angst-gerelateerd gedrag in bepaalde testen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg"> Figuur 4: Optogenetische activering van IL piramidale neuronen verhoogt angstgedrag. Lichtstimulatie tijdens experimenten: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulatie. A) Schematische tekening van injectie- en implantatieplaats voor ChR2-YFP of tdTomato in de IL. Tijdens het experiment worden piramidale neuronen in het IL-gebied van het mPFC geactiveerd door ChR2. Saggital brain slices aangepast van de Paxinos en Franklin muis hersenen atlas, saggital: laterale o,6. B) Open Field doolhof met licht stimulatie protocol (20 min met 4x5 min afwisselend Off en Op proeven; links) en warmtekaarten van voorbeeldige ChR2-geïnjecteerd (EXP) en tdTomato geïnjecteerd (CT) muizen in alle 4 proeven van het experiment (rechts). EXP dieren besteden minder tijd in het centrum van de OF wanneer gestimuleerd met blauw laserlicht. Voor CT-dieren verschilt de tijd die in het centrum wordt doorgebracht niet tussen licht uit en op proeven. C) Groepsgegevens voor EXP-dieren in het OF, n=11. Muizen besteden aanzienlijk minder tijd in het midden van de OF wanneer gestimuleerd met blauw licht (Off1 39.49±6,9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0.033, *; Off1:On2, MWRS, p=0,049, *). Afstand verplaatst wordt niet beïnvloed (Off1 2703.09±292,65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). # van het centrum inzendingen afnemen met de tijd, maar tonen geen significante verschillen (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Groepsgegevens voor CT-dieren in het OF, n=15. De muizen van de tijd besteden in het centrum van VAN, de verplaatste afstand, # van middelste ingangen verandert niet tussen lichte Aan- en Uit-proeven (Tijd in het midden Off116.73±2,65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Afstand Off1 3399,69±296,77 cm, On1 3210,6±446,9 cm, Off2 3030,28±513,83 cm, Op2 2955±617,7 cm; # van het centrum ingangen Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). CT-muizen vertonen aanzienlijk hogere baseline angst (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0.005, **). Waarden zijn gemiddelde±S.E.M. * wijzen op significante verschillen (p≤0,05), ** wijzen op significante verschillen (p≤0,01). t-test altijd twee-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL: infralimbic cortex; BLA: basolaterale amygdala; DRN: dorsale raphe kernen; VAN: Open veld; CT: controledieren; EXP: proefdier; L: licht. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Berg et al. 2019, PLoS One43 en van Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg"> Figuur 5: EPM-experiment heeft geen gedragseffecten bij Nex-Cre-muizen laten zien. Lichtstimulatie tijdens experimenten: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulatie. A) Elevated-Plus Doolhof met lichtstimulatie protocol (18 min, 6x3 min, afwisselend Off en Op proeven). B) Groepsgegevens voor de muizen die "uitglijden" worden opgenomen in de gegevens, totaal n=23. Nex-Cre muizen hadden de neiging om met hun rugpoten van de open arm af te glijden, onafhankelijk van de experimentele groep (links). Alleen muizen die voor alle 6 de proeven in het doolhof bleven, werden in latere analyses meegenomen. Slip off's in de eerste Off1 fase zijn reden voor latere vermijden van de open armen (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0,79, Off2+3 EXP 0,125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0,625±0,26, CT 0,1±0.1). Pie grafiek (rechts) toont muizen vallen uit het doolhof tijdens de 18 min met 42,42%. Slechts 57,57% maakte het experiment af. C) Heat kaarten van voorbeeldige EXP en CT muizen in alle 6 proeven van het experiment. Beide groepen vertonen een afname van de open armduur na de Off1-proef. D) Groepsgegevens voor EXP-dieren in de EPM, n=12. De tijd doorgebracht in de open armen aanzienlijk gedaald tijdens de eerste twee proeven en voortdurend daarna (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0.041, *). De verplaatste afstand wordt niet beïnvloed (Off1 679.96±71,63 cm, On1 712.24±112,82 cm, Off2 717,49±97,39 cm, On2 782,51±81,11 cm, Off3 722,11±68,60 cm, On3 663,90±106,57 cm). Het aantal open armingangen daalt aanzienlijk van Off1 naar On1 en blijft dan constant (Off1 8.08±1.08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p=0.002, **). De tijd doorgebracht in het centrum van de EPM vermindert langs proeven, maar toont geen significant verschil van Off naar On trial (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Groepsgegevens voor CT-dieren in de EPM, n=11. CT-gegevens tonen dezelfde significante dalingen als EXP-gegevens, wat aangeeft dat het experiment niet goed heeft gewerkt (Tijd in open armen Off1 86,92±12,74 s, On1 33,78±14,38 s, Off2 18.01±11,61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; Afstand Off1 705,11±88,36 cm, Op1 789,45±77,53 cm, Off2 724,74±80,49 cm, On2 676,57±111,99 cm, Off3 716,99±132,47 cm, On3 663,03±132,46 cm; Open arm inzendingen Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p=0.01, *; Tijd doorbrengen in het centrum Off1 35.89 s, On1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Waarden zijn gemiddelde ± S.E.M. * wijzen op significante verschillen (p≤0,05), ** wijzen op significante verschillen (p≤0,01). t-test is altijd twee-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Elevated-Plus Doolhof; CT: controledieren; EXP: proefdier; OA: open armen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Berg et al. 2019, PLoS One43 en van Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg"> Figuur 6: Injectiezijde van ChR2 en tdTomato in de IL- en Nex-Cre-specificiteit. A) Schematische tekening van de implantatieplaats op coronale hersenplakken bij AP + 1,66 mm, mL 0,3 mm, DV -1,8 mm, met eenzijdige injectie en implantatie (aangepast van muishersenenatlas, Paxinos en Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Voorbeeldige injectieplaatsen van ChR2-YFP (links, geel) en tdTomato (rechts, rood) samengevoegd met DAPI gekleurde celkernen (blauw) in Nex-Cre muizen. Schaalbalk 1 mm. Insets tonen een hoge vergroting van de IL-regio. Schaalbalk 150 μm. Witte vakken geven de locatie van insetsaan . C) Bovenste rij: confocale beelden van de linker IL-regio van een Nex-Cre muis bevlekt met CamKII als een marker voor glutamatergic neuronen (blauw), en ChR2-YFP (geel) of Gad67 als een marker voor GABAergic neuronen (groen), van een Nex-Cre muis. Onderste rij: colocalisatie van ChR2-YFP (geel) met CamKII (links, blauw), maar niet met Gad67 (rechts, groen), met specificiteit van Nex-Cre muizen voor glutamatge neuronen. Schaalbalk 50 μm. PrL: prelimbic cortex; IL: infralimbic cortex; DP: dorsale pedunculaire cortex. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Berg et al. 2019, PLoS One43 en van Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd.

Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd. Het uiteindelijke doel van optogenetica is de modulatie van neuronale circuits met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in het gedragende dier.In tegenstelling tot farmacologische of elektrische manipulaties, optogenetica zorgt voor de nauwkeurige controle van specifieke celtypes op neuronale circuits. Optogenetica is de perfecte manier om specifieke celtypen te targeten in speciaal gedefinieerde regio tijdens gedrag, en om het directe effect van veranderingen in dergelijke microcircuits te onderzoeken. We zullen nu een stap presenteren om te begeleiden hoe te bereiden en te planten en optogenetica uit te voeren in een vrij bewegende muizen.Voor de bereiding van het optische implantaat, plaats een keramische ferrule platte kant omhoog in een bankvise. Strip de code van een 200 micrometer diameter glasvezel, met een vezel strippen tool en snijd twee tot drie centimeter niet stukken met een keramische vezel schrijver. Plaats het stuk glasvezel in de keramische ferrule en plaats een druppel een superlijm aan de vlakke kant met een injectie cannulaire.Aan de ronde kant van de keramische ferrule, snijd de glasvezel zo kort mogelijk en plaats het pre-implantaat op een ferrule polijsten puck om de ronde kant op te poetsen op vier verschillende publishing papers. Snijd daarna de glasvezel aan de vlakke kant van de keramische ferrule, tot de lengte die nodig is voor implantatie. Gebruik een muis hersenatlas om de lengte van het implantaat te berekenen.Het implantaat moet direct boven het belanggebied eindigen. Voorafgaand aan de implantatie wordt anesthesie toegepast. De precieze en esthetische techniek wordt beschreven in het manuscript.Wanneer de muis een diepe staat van anesthesie bereikt, plaats deze op een verwarmingsplaat en bevestig het hoofd in een stereotactisch frame. Bevestig de neus en de tanden aan de voorkant en de oren aan beide zijden. Breng een algesia met een cuprofen onderschuit in de achterkant van de muis en breng ondoorzichtige oogzalf op beide ogen om hen te beschermen tegen drogen.Bevochtig het haar op de hoofdhuid met een natte papieren handdoek en snijd het af met een schaar. Zorg ervoor dat al het losse haar te verwijderen met een natte papieren handdoek. Gebruik een katoenen stok om de hoofdhuid te desinfecteren met een tinctuur die jodium bevat.Verhoog de hoofdhuid over het gebied van belang met een pincet en snijd een centimeter langs de middellijn. Om de schedel te ruwen voor implantatie, breng een kleine hoeveelheid fosforzuur op het litteken en laat het van kracht worden gedurende 15 seconden. Verwijder al het zuur met een katoenen stok en spoel het litteken twee keer af met natriumchloride.Bereken voor een goede injectie de F-factor voor individuele coördinaten. Plaats een glazen cannulair in het stereoctatische frame en lokaliseer het direct boven bregma. Nu nul het coördinatensysteem en verplaats de glazen canule naar Lambda.Bereken de F-factor met de volgende formule. Bregma minus Lambda gedeeld door 4,2 is gelijk aan de F-factor. Exacte coördinaten zijn erg belangrijk voor injectie en implantatie, want anders, als de verkeerde structuur wordt gestimuleerd, zijn de gedragseffecten niet-specifiek.Alle muizen hebben minimale afwijkingen in de grootte van hun schedel, daarom is de coëfficiënt absoluut verplicht. Gebruik de aangepaste coördinaten om de locatie op het litteken direct boven de structuur van belang te vinden. Gebruik een injectie canule om een gat in de schedel te boren, door de canule ter plaatse te draaien.Om een virusoplossing in de glasblikje te nemen dat is aangesloten op spuit, plaatst u een druppel natriumchloride op de schedel en een stuk pirophen erop. Plaats een druppel van twee microliter virus oplossing op de pirophen en lager de punt van de glas canule in het virus. Breng negatieve druk en wacht tot het virus oplossing wordt opgenomen door de canule.Nul op die coördinaat wanneer de punt van het virus met canule is op het niveau van de schedel en langzaam lager in het boorgat naar de laagste positie van de injectie kant. Breng een kleine hoeveelheid positieve druk met de spuit tot de meniscus wordt verlaagd. Laat het virus zich twee tot drie minuten verspreiden voordat u de glazen canule naar boven naar de volgende positie verplaatst.Verwijder de glazen canule heel langzaam en gooi het na de laatste injectie weg. Bereid nu de schedel voor op implantatie. Droog de schedel met perslucht, breng de primer aan met deze overeenkomstige stick en laat deze 15 seconden drogen.Breng de band met dezelfde stick aan en genees deze gedurende 20 seconden met UV-licht. Plaats het implantaat in de overeenkomstige houder en plaats de punt van de glasvezel direct boven het boorgat en laat het voorzichtig zakken. Stop met het verlagen van het implantaat wanneer de resterende klep van superlijm de schedel raakt.De implantatie van optische vezels kan ook worden gemaakt voor bilaterale structuren zoals de hippocampus. Dit maakt lichte stimulatie in beide hemisferen tegelijkertijd mogelijk of maakt het mogelijk om twee verschillende structuren te stimuleren. Het is ook mogelijk om het virus te injecteren op een andere locatie dan het optische vezelimplantaat.Als de injectie en implantatie worden gedaan in verschillende regio's, boor alle nodige gaten na het aanbrengen van fosforzuur, maar vóór de twee componenten hechting. Controleer opnieuw of de schedel nog volledig droog is, breng dan vloeibaar tandcement rond het implantaat aan en in de omgeving en moet u vervolgens 20 seconden genezen met UV-licht Breng twee mindere cement aan in volledig bontvrij en gedroogd schedelgebied. Genees elke laag met UV-licht.Om de operatie te voltooien van toepassing jodium zalf op de hele wond. Laat de neus- en oorfixatie los, breng de muis in een verse kooi en plaats deze onder een verwarmingslamp om verlies van lichaamswarmte te voorkomen. Controleer het de gezondheidstoestand ten minste eenmaal per dag en het zal post operatieve en algesia na drie dagen indien nodig.Na twee weken herstel kunnen muizen worden gebruikt voor gedragsexperimenten. Open de Pulser Software en selecteer de USB-poort waarop de lichtbron is aangesloten. Kies bewerkingsmodus drie om een externe software de lichtbron te laten bedienen.Kies de juiste aanpassing voor 20 Hertz stimulatie met vijf milliseconden lichtpuls. Als u de verdeling wilt vinden om met de pulser te communiceren, drukt u op startvolgorde. Deze status blijft bestaan totdat de experimenten zijn voltooid.Maak nu een nieuw experiment in EthoVision XT, ga naar het bestand, kies nieuw uit sjabloon en selecteer een vooraf gedefinieerde sjabloon toepassen. Kies live tracking en selecteer de camera met bron en bevestig de aangesloten Puslar Gen-Eye cam. Kies de muis als het dier dat moet worden geregistreerd.Selecteer de arenasjabloon, het open veldvierkant en het zonesjablooncentrum, de rand, de hoeken. Bevestig een onderwerp dat moet worden bijgehouden en selecteer het middelpunt, neuspunt en staartbasis. Bevestig de dierlijke kleur in vergelijking met de achtergrond is donkerder en de aanbevolen sample rate om de stap te voltooien.Geef het experiment de juiste naam en kies een locatie die u wilt opslaan. Totdat u de arena-instellingen vindt, opent de camera automatisch een achtergrondafbeelding. Pas de vooraf gedefinieerde zones aan de echte arena aan met behulp van de pijl en de twee symbolen op het recht.Als sommige zones overbodig zijn, verwijdert u ze. Druk op trekschaal om te kalibreren en zet een lijn van de ene hoek van het doolhof naar de andere. Voer de lengte van de werkelijke afstand in centimeters.Herhaal dat voor de andere as. Als u de instellingen voor proefbesturingselementen wilt definiëren, stelt u de hoofdregel voor door de conditietijd aan te passen aan 20 minuten. De voorwaarde voor Star Trek moet zijn, wanneer het onderwerp is in arena voor twee seconden, voor een automatische status van de tracking wanneer de muis in de arena.Als u een subregel voor de lichtstimulatie wilt maken, gaat u naar structuren, meer en selecteert u subregel. Plaats het onder de hoofdregel en verspreid de twee dozen. Ga naar voorwaarden, tijd en geef het een naam als licht op een, aanpassen voorwaarde wordt voldaan met na vijf minuten.Plaats het vak direct achter het vak met de regel van de subregel. Ga naar aangepaste hardware en geef deze een naam met licht op één. Selecteer actie om uit te voeren als:Ik zet een hoog.Plaats de doos direct achter de conditiedoos. Herhaal de stappen om licht te programmeren tot in het licht op. Ga nu naar structuren, subregelverwijzing en controleer of de verwijzing tot de juiste subregel behoort.Kies startvoorwaarden als zonder vertraging en start voorwaarden als eenmaal per start voorwaarde uit te voeren. Plaats het referentievak tussen de extra boeken een en conditie boeken twee van de belangrijkste regel. Definieer nu de detectie-instellingen om het systeem te laten zien wat het moet bijhouden.Plaats een testmijl in de arena en selecteer geautomatiseerde setup. Kies knaagdier als diertype en gebruik de muiscursor om een doos rond de muizen in de arena te tekenen. Bevestig de resultaten van de zorgvraag met ja.Voor het open veld experiment, breng de experimentele muis naar de gedragsruimte vlak voor het experiment om een goed niveau van angst te garanderen. Koppel de muis een spleet van de lichtbron door zachtjes op het rooster van de kooi te drukken. Plaats het in een wachtkooi met vers strooisel gedurende 10 minuten om te wennen aan de lichtkabel.Begin met acquisitie door op de stopknop te drukken en je naar vision XT. Breng de muis vanuit de wachtkooi naar de linkerbovenhoek van het open veld. Verlaat het gezichtsveld van de muis tijdens het experiment en blijf kalm. Na 20 minuten, wanneer het experiment is voltooid, verwijder de muis uit het doolhof, koppel de lichtkabel los en zet hem terug in zijn eigen kooi.Door een controlevisualisatie kunnen de verschillen in middentijd tussen licht uit en licht op gezichten direct worden gezien. De muis brengt minder tijd door in het midden wanneer het licht aan staat. Voor de Barnes doolhof experiment, breng alle experimentele muizen in de gedragsruimte ongeveer een uur voor het experiment.Bereid de Barnes doolhof door het sluiten van alle gaten, behalve een, en nu die een escape box is geplaatst. Sluit één muis in de lichtbron bij beide implantaten en plaats deze direct in het midden van het Barnes doolhof. Druk op start en noodzaak om volgende T te bezoeken en verwijder de doos.Wees bereid om de proef handmatig te stoppen voor het geval de software niet de hele overgang herkent. Haal de muis uit het doolhof en verwijder de verbinding met de lichtkabel. Bij het uitvoeren, leren en geheugen taak, niet alleen het onmiddellijke effect van de manipulatie wordt onderzocht, maar ook de lange termijn effect van manipulatie tijdens de verwerving, consolidatie of ophalen.Voor gegevensanalyse vindt u de behandelingstoestand behandeld of gecontroleerd, gaat u naar nesting en selecteer de testcontrolestatus. Kies het statusinterval van de elementactie Star Trek naar het element action light gaat op één. Plaats de nestkast tussen de filterboxbehandeling en de bijbehorende resultaatbox.Dit gedefinieerde interval is van één. Herhaal de stappen voor intervallen op een van de twee en op twee als ook voor de controlegroep. Definieer ook de parameters die moeten worden geanalyseerd in het analyseprofiel.Kies de afhankelijke variabele in de zone en selecteer het zonecentrum, het hoofdpunt, het middelpunt en ga op proefstatistieken. Selecteer frequentie, cumulatieve duur en laat het eerst zien. Voeg ook afstandsbeweging toe als variabele.Met dit profiel zijn de gegevens beschikbaar voor de tijd die in het midden wordt doorgebracht, centreert en wordt verteld dat u op afstand moet bewegen. Als u gegevens uit elke divisie wilt extraheren, gaat u naar de resultaten en selecteert u statistieken en grafieken, drukt u op berekenen om de geanalyseerde gegevens te bekijken. Druk op exportgegevens en selecteer de proefstatistieken en de locatie die u wilt opslaan.De geëxporteerde gegevens worden opgeslagen als een excel-bestand en met afzonderlijke waarden voor elke muis. Ga bovendien naar de visualisatie van de heatmap en druk op plothittekaarten, selecteer rechts proeven om individuele warmtekaarten voor elke muis en proef te bekijken. Klik met de rechtermuisknop op de muis en exporteer de heatmaps als afbeeldingen.Open later het excel-bestand van de computer en bereken de gemiddelde en standaard euro SCM voor alle vier de proeven en elke gemeten conditioneringsgroep. Om grafieken en Sigma plot te genereren, kopieer de middelen en SCM in de juiste volgorde van het extra bestand naar Sigma plot. De rijen moeten de gegevens bevatten voor één, op één, en de kolommen bevatten trial, mean en SCM hertz.Selecteer alle drie de kolommen en ga naar grafieken maken. Selecteer het vak met de balk en kies het vak niet-gegroepeerd met pijl. Label de hele grafiek, ga naar huis, selecteer het grafiekvak en druk op exporteren.Selecteer de doelmap en kies metabestand als indeling. Om statistieken voor verkregen gegevens te berekenen, kopieert u de juiste gegevens van Xcel één op één, et cetera, en naar enkele kolommen van Sigma plot. Markeer de kolommen die u wilt vergelijken en ga naar analyse, kies T-test en druk op run.Ten slotte kunnen gedragsgegevens worden getoond verdeeld in let off en op proef met extra warmtekaart specialisatie. In het open veld experiment, tijdens lichtstimulatie van Channelrhodopsin2 en piramidale neuronen, is de centrumduur verminderd, wat wijst op verhoogde angstniveaus. Via immunohistochemie kunnen de injectieplaats en expressie van het virus worden bepaald, ook op de specificiteit van de speciale Cre-afhankelijke muislijn kan worden gevalideerd.Men kan duidelijk zien dat de lichtstimulatie van Channelrhodopsin2 geestneuronen van dit specifieke cortexgebied verhoogt angstniveaus, in vergelijking met baseline angst voor die stimulatie. Dit onmiddellijke effect van de manipulatie op gedrag is de reden waarom optogenetic vandaag voor zo veel onderzoekvragen betreffende gedrag wordt gebruikt. Deze procedure kan worden gebruikt voor optogenetische modulatie van een gewenst celtype of neuronale circuits in de hersenen van de muis.Door deze procedure te combineren met geschikte gedragstests voor uw onderzoek, kan een dieper inzicht worden verkregen in neuronale circuits die betrokken zijn bij gedrag en bezienswaardigheden.

Research

JoVE Journal

Behavior

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Langdurige Potentiëring van perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Vrij Gedragen Muizen

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Het blootleggen van Beat Doofheid: Het opsporen ritmestoornissen met gesynchroniseerde Finger tikken en Perceptuele Timing Taken

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Flat-gevloerd Air-opgeheven Platform: Een nieuwe methode voor het combineren Gedrag met Microscopie of Electrofysiologie op Awake vrij bewegende Knaagdieren

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

A Novel Experimentele en analytische benadering van de Multimodal Neural Decoding of Intent Gedurende sociale interactie in Vrij-gedragen Human Zuigelingen

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Visualizing Motion Patterns in Acupuncture Manipulation

Visualiseren Motion Patronen in Acupunctuur Manipulatie

Acupuncture manipulation varies widely among practitioners in clinical settings, and it is difficult to teach novice students how to perform acupuncture ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test rPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

De knaagdieren Psychomotorische Waakzaamheid Test (rPVT): Een methode voor het beoordelen van Neurobehavioral bij ratten en muizen

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Manipulatie van Epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) en Sleep bij ratten en muizen door Acupunctuur

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Beeldvorming in vrij bewegende muizen met prisma sonde en geminiaturiseerde fluorescentiemicroscopie

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

Een draadloze, bidirectionele Interface voor In Vivo opname en stimulatie van neurale activiteit in vrij gedragen ratten

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Assessing Activity-based Anorexia in Mice

Beoordeling van Activity based Anorexia in muizen

Rodents develop activity-based anorexia (ABA) when exposed to a restricted feeding schedule and allowed free access to a running wheel. These conditions ...